细胞爬片 细胞生物学实验报告.doc

细胞生物学实验报告细胞爬片 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员： 一、实验原理细胞爬片就是让玻片浸在细胞培养基内，细胞在玻片上生长，主要用于组织学，免疫组织化学，冰冻切片，细胞涂片，原位杂交等。细胞爬片采用的玻片可以是普通的盖玻片也可以用细胞爬片专用玻片。使用普通盖玻片是，要按照玻璃器皿的清洗方法进行清洗，并进行高压灭菌。专用玻片通常已经过处理可直接使用。细胞爬片常用的方法有两种：（1）细胞爬片时用无菌小镊子将处理好的玻片放到细胞培养板中，可按照普通细胞传代的方法进行细胞的消化和传代。细胞会在玻片上贴壁生长。特别提示：比如在六孔板中放入爬片,六孔板的孔底面积往往会比爬片面积多出一部分，加细胞悬液时常常就是细胞铺满整个孔底，有时细胞生长会出现边缘现象，就是靠近边缘密度要高些,这样处于中央玻片上爬的细胞数量就可能相对较少，实验中所需的细胞数量要比实际在玻片中生长的细胞多。（2）另一种方法是将玻片放入孔板的孔内后,加细胞悬液时只滴到玻片上,一直滴到液体布满整个玻片又不会溢出玻片边缘(因为液体表面张力作用可以很容易做到这一点!)，小心将孔板放在培养箱中，待细胞贴壁后取出，再滴加培养基布满整个孔底，继续培养，这样玻片上的细胞生长的密度就会很集中，相对比较节省细胞。二、实验目的1巩固细胞传代技术。2掌握细胞爬片的方法。3. 为细胞骨架的观察提供实验材料三、实验器材1.细胞CHO细胞、鸡胚成纤维细胞、HeLa2.试 剂DMEM培养基、血清、抗生素、胰酶 3.仪 器超净工作台、CO2培养箱、倒置相差显微镜4.其它用品：盖玻片（无菌）、35mm细胞培养皿、试管、移液管，滴管，酒精灯、75酒精棉球、废液缸。四、方法与步骤（1）入无菌室之前首先穿实验服，佩戴一次性手套、帽子。要用肥皂洗手,用新洁尔灭溶液拭擦双手消毒。（2）关闭已照射超净台台面20分钟左右的紫外灯，打开抽风机清洁空气。打开照明灯。（3）超净台台面应整洁，用75%酒精擦双手消毒，并擦拭超净台台面。（4）准备好所需试剂及仪器，摆放在超净台中。（5）按照1%的比例向含10%FCS的DMEM培养基中加入双抗（本次试验的培养基约为70ml，故加入700l的双抗）（6）用灭菌小镊子将处理好的盖玻片轻轻放入35mm培养皿中。（放入前先过火，将盖玻片上的酒精蒸发掉，以免影响细胞生长）（7）打开鸡胚成纤维细胞瓶盖并在酒精灯上轻轻烧口消毒，倒掉或吸出培养基。（8）向培养瓶加入1滴管的胰酶, 显微镜下观察细胞的消化状态，待细胞大部分收缩、突起、变圆，细胞边界清晰时，即可竖立或翻转培养瓶停止消化，在超净台内靠近火焰处弃胰酶。注意勿使细胞提早脱壁落入消化液中。（9）加两滴管含10%FCS的DMEM培养基反复冲瓶壁上的细胞层，至全部冲下，滴管轻轻吹打，混匀，成细胞悬液，细胞计数，将细胞稀释成1105/mL。（10）在35mm培养皿中加入2 mL细胞悬液，镜下观察细胞密度和状态，标记细胞名称及操作者。（11）培养皿两侧用医用橡皮膏粘贴好。向原细胞培养瓶中补加培养2ml，做好标记。（12）将细胞培养皿及培养瓶放入5%CO2、37培养箱培养，其中培养瓶瓶口需拧松半圈。（13）将用过的试剂仪器等摆回原处，将超净台打扫干净，关闭照明灯及抽风机。（14）实验后数小时后去观察培养皿中细胞爬片情况。五、注意事项1.盖玻片非常薄，易碎，取放盖玻片时动作要轻。2.把握好传代时机，80%90%的细胞融合度为最佳，过早细胞量少，过晚细胞生长状态不佳。3.消化时间要适度，过短细胞不易脱落，过长细胞可脱落流失并造成细胞损伤。4.注意无菌操作的规范。六、实验结果与讨论我们对原代培养的鸡胚成纤维细胞进行了爬片，在培养过夜后观察细胞爬片情况，显微镜下可观察到鸡胚组织块附近有大量细胞迁移，且迁移出来的细胞数目较上一次观察相比有所增多。迁移出来的细胞呈纤维状，贴壁生长。爬片一天后，第二天上午时老师通知我们细胞爬片的培养皿被污染了。 实验失败原因分析：实验时无菌操作不规范，在使用滴管、镊子等工具时没有注意无菌操作，吸取培养液、细胞悬液时，应专管专用，一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去，以防止污染扩大或造成培养物之间的交叉污染。我们小组四个人的细胞均发生了污染，有可能是小组在吸取胰酶、血清时操作不规范，使得实验材料被污染；实验操作没有在酒精灯附近操作，或者是实验操作太接近实验台边缘，导致细胞污染。操作时尽量不要谈话，咳嗽以防止来自唾沫和呼出的气