病毒纯化浓缩方法.doc

_病毒纯化浓缩方法方法一 超速离心沉淀法 1 仪器 超速离心机(BECKMANOPTIMAL-80XP) 5000080000rpm相对离心力最大可达510000g；高速冷冻离心机(BECKMANAVANTIJ-26XP)2000025000rpm 最大离心力为89000g；超速离心管(Beckman344058)，Ultra-clearSW28离心管2 方法步骤 （1） 转染后44-48小时，收集上清液到50ml离心管内，并加入20mlProduction 培养基以便第二轮病毒的收集。将收集的上清液4，4000g离心10分钟，去除细胞碎片，然后0.45m滤膜过滤到40ml超速离心管中。（2） 取6个Beckman超速离心管，70%乙醇清洗后在生物安全柜中风干并紫外消毒30min。（3） 每个Ultra-clearSW28管加入30ml预先处理过滤过的病毒上清。（4） 取一支10ml的移液管，吸取12ml20%的蔗糖溶液(PBS配制)。将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4ml，形成一个蔗糖垫。同样地，将剩下8ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。（5） 务必确定离心管没有裂缝且用PBS调整各管重量使两两平衡。（6） 4离心，25000rpm（82700g）2h。（7） 离心完毕后小心取出超速离心管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。管底可见少量的半透明或白色沉淀。将超速离心管倒置在吸水纸上晾干约10min，并用Tip头吸去管壁上多余的液体。（8） 每管中加入100ul不含钙和镁的冷PBS洗下沉淀。（9） 将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。（10） 在4溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。（11） 4，500g离心1分钟，使溶液集中于管底。（12） 用200l移液器轻柔吹打使沉淀重悬。避免产生泡沫。将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中，分装50ul/管，保存于成品管中，用碎干冰速冻后储存在-80冻存。方法二PEG-8000浓缩法(1) 5XPEG8000+NaCl配制称取NaCl8.766g;PEG800050g溶解在200mlMilli-Q纯水中；121摄氏度30min湿热灭绝30min；保存在4。(2) 使用0.45m滤头过滤慢病毒上清液；(3) 每30ml过滤后的病毒初始液，加入5XPEG-8000+NaCl母液7.5ml；(4) 每2030min混合一次，共进行3-5次；(5) 4度放置过夜；(6) 4度，4000g，离心20min；(7) 吸弃上清，静置管子12分钟，吸走残余液体；(8) 加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；(9) 集中后的病毒悬液分装成50l每份，保存在成品管中。用碎干冰速冻后储存在-80方法三 慢病毒纯化浓缩试剂盒1. 每10ml过滤后的病毒初始液，加入ConcenSolution3ml，每20-30min混合一次，共进行3-5次。2. 2.4放置过夜。3.4，3000g，离心45min。4.去掉上清，静置管子1-2min，吸走残余液体。5.加入无血清DEME充分溶解慢病毒沉淀。6.病