（海洋生物学专业论文）中国海膜科蜈蚣藻属三个新种的研究.pdf

l 学位论文独创性声明 i l llli ii i ii lll l li tiii 1y 18 9 0 2 6 7 ：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特别加以标注和 ，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本人的 的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名：毒牮墨 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权 辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名：燃 指导教师签名： 签名日期： 训p ，7 日 l00： ilii ， 巍铲f缸lall嚣， j玎。k f醍虢嚣辫褥。 膜科，有8 0 多种，广泛分 受环境、水温生长基质以 及地理位置等多种生态因子的影响，蜈蚣藻属各种的外部形态变异很大，所以至今仍然 没有建立一个统一的分类标准。结果造成同一种海藻不同的生长阶段会被误认为是两个 物种，或者两个物种被误认为是同一种海藻，因此蜈蚣藻属种的区分、鉴定非常困难， 所以被世界各国海藻分类学家认定为最难分类的属之一。 近年来，随着分子生物学技术的飞速发展和不断应用，特别是利用r b c l 序列分析探 讨海膜科红藻的系统发育，并将这种方法与形态学特征相结合，为海膜科红藻的分子系 统学研究奠定了基础，拓展了新的思路。这种研究方法也是本文主要采用的方法。即通 过形态学观察和而c l 序列分析相结合的方法，对采自我国大连、青岛、海南等海域的蜈 蚣藻属各种的亲缘关系、种的遗传多样性等进行系统分析研究；同时，通过对藻体的形 态结构特别是生殖器官的特征、类型等进行观察研究标本进行了全面系统的研究，主要 结果如下： 经过实验发现了蜈蚣藻属红藻的三个新种，它们分别是采集自大连的大连蜈蚣藻 ( g r a t e l o u p i ad a l i a n e n s i sw a n go t s h is p n o v ) ，青岛的黄海蜈蚣藻( g r a t e l o u p i a h u a n g h a i e n s i sw a n gs p n o v ) ，海南的莺歌海蜈蚣藻( g r a t e l o u p i ay i n g g e h a i e n s i sw a n ge t l u a ns p n o v ) 。在本文中将对他们形态结构，囊果的发育等进行详细描述，对，6 正基 因序列进行分析。 关键词：蜈蚣藻属；三个新种；分子系统学；，- 西比基因；形态观察 一卜 、 中国海膜科蜈蚣藻属三个新种的研究 t h et h r e en e ws p e c i e so fg r a t e l o u p i ai nc h i n a ( h a l y m e n i a c e a e ，r h o d o p h y t a ) a b s t r a c t n 扭r i n er e da l g a lg e n u sg r a t e l o u p i a ，b e l o n g st oh a l y m e n i a e e a e i tc o n t a i n sm o r e t h a n8 0s p e c i e s ，i nh a l y m e n i a e e a e ( h a l y m e n i a l e s ，r h o d o p h y t a ) i st h em o s ts p e c i e s r i c h g e n u sa n dd i s t r i b u t e dv e r yw i d e l yn om a t t e ri nt e m p e r a t eo rt r o p i c a lw a t e r st h r o u g h o u tt h e w o r l d , t h a t3 2s p e c i e sd i s t r i b u t e di nc h i n a f o re n v i r o n m e n t a lc h a n g e sa n dd i f f e r e n ts t a g e so f t h ep h y s i c a l ，g r a t e l o u p i ah a sb e e nc o n s i d e r e dp r o b l e m a t i c ，b e c a u s ei ng r o s sm o r p h o l o g yt h e s p e c i e si sd i v e r s e t h em o r p h o l o g i c a lc l a s s i f i c a t i o nc r i t e r i ah a v en o tb e e na b l et oa c h i e v e u n i t y ，s o m e t i m e st h et w oi n d i v i d u a l so ft h es a m es p e c i e sh a v eb e e ni d e n t i f i e da sd i f f e r e n t t y p e so rt w od i f f e r e n tt y p e sh a v eb e e ni d e n t i f i e da r t i f i c i a l l ya so n es p e c i e s b e c a u s eo ft h i s ， g r a t e l o u p i ai sr e g a r d e da so n eo ft h em o s td i f f i c u l ts u b j e c t sc l a s s i f i e db ya l g a lt a x o n o m i s t si n t h ew o r l & a sm o l e c u l a rb i o l o g yt e c h n o l o g yr a p i dd e v e l o p m e n ta n da p p l i c a t i o n ，e s p e c i a l l yu s i n g 而c lg e n et oe x p l o r et h eh a l y m e n i a c e a es y s t e md e v e l o p m e n t l y ，c o m b i n i n gt h i sw a ya n d m o r p h o l o g i c a la n a l y s i s f o rh a l y m e n i a c e a eo fm o l e c u l a rs y s t e m a t i c ss t u d yl a y saf o u n d a t i o n , e x p e n dn e wi d e a s b yt h i sw a y , r e s e a r c hg e n e t i cr e l a t i o n s h i p ，g e n e t i cd i v e r s i t ys y s t e m a t i c a l l y w h i c h w e r ec o h e c t e d f r o mn a i n a n , q i n g d a o ，d a l i a n ；a tt h e8 a t n et i m e ，m a d ea c o m p r e h e n s i v er e s e a r c ht ot h em o r p h o l o g i c a ls t r u c t u r eo fa l g a e ，e s p e c i a l l yt h er e p r o d u c t i v e o r g a n sc h a r a c t e r i s t i c s ，t y p e sa n d s oo n t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： t h r o u g he x p e r i m e n tid i s c o v e r e dt h r e en e ws p e c i e sa m o n gt h ea l g a s ，g r a t e l o u p i a d a l i a n e n s i sw a n ge ts h is p n o v ，g r a t e l o u p i ah u a n g h a i e n s i sw a n gs p n o v g r a t e l o u p i a y i n g g e h a i e n s i sw a n g e tl u a n s p n o v i nt h i sp a p e r , m a i n l yd e s c r i p t i o nf o rt h e i r m o r p h o l o g i c a ls t r u c t u r e ，t h ed e v e l o p m e n to fc y s t o c a r p sa n dt h e i rr b c ls e q u e n c e s k e yw o r d s ：g r a t e l o u p i a ；t h r e en e ws p e c i e s ；m o l e c u l a rs y s t e m a t i c s ；而c lg e n e ；m o r p h o l o g i c a l o b s e r v a t i o n - i i - 辽宁师范大学硕士学位论文 目录 i 】：】： 1 】l 学研究进展2 1 1 2 海膜科的分子系统学研究进展。3 1 1 3 蜈蚣藻属的研究概况。6 1 2 研究的目的和意义7 2 材料和方法9 2 1 材料的采集和处理9 2 2 实验试剂和仪器9 2 2 1 实验试剂9 2 2 2 实验仪器9 2 3 冰冻切片的制作和结构观察1 0 2 4 实验材料的形态观察1 0 2 5d n a 的提取：1 0 2 5 1u n s e tb u f f e r 法抽提d n a ：1 l 2 5 1 试剂盒法抽提d n a 1 2 2 6p c r 反应及产物：1 2 2 6 1p c r 引物设计1 2 2 6 2p c r 反应体系。1 3 2 6 3p c r 反应程序1 3 2 6 4p c r 反应产物的电泳检测1 3 2 7p c r 产物的纯化及测序方法1 4 2 8 序列分析1 4 3 结果1 5 3 1 蜈蚣藻属新种莺歌海蜈蚣藻( g r a t e l o u p i ay l n g g e h a i e n s j sw a n ge tl u a n s p n o v ) 1 5 3 1 1 藻体的形态特征1 5 3 1 2 序列分析1 8 3 1 3 讨论，2 3 中国海膜科蜈蚣藻属三个新种的研究 3 2 蜈蚣藻属新种黄海蜈蚣藻( g r at e l o u p y ah u a n g h a y e n s y sw a n gs p n o v ) 2 4 3 2 1 藻体的形态特征2 4 3 2 2 序列分析2 7 3 2 3 讨论3 2 3 3 蜈蚣藻属新种一一大连蜈蚣藻( g r a t e l o u p y ad a l i a n e n s y sw a n ge t s h i s p n o v ) 3 3 3 3 1 藻体的形态特征3 3 3 3 2 序列分析3 6 3 3 3 讨论4 1 结论? 4 2 参考文献4 4 致谢4 6 一i 、卜 辽宁师范大学硕士学位论文 1 绪论 中国做为世界上最大的国家之一有着非常辽阔的海域，有近3 0 0 万平方公里的 蓝色国土。我国近海共划分为五大海区，即渤海、黄海、东海、南海和台湾东侧的 太平洋海区。渤海、黄海、东海面积为1 2 3 万平方公里，南海为3 5 0 万平方公里， 它们南北相连，属北太平洋西部的陆缘海。辽东半岛南端老铁山角经庙岛群岛至山 东半岛北端蓬莱角连线是渤海与黄海的分界线；长江口北侧启东角与朝鲜半岛西南 侧济州岛之间连线是黄海与东海的分界线；广东南澳岛沿台湾浅滩南侧至台湾南端 鹅銮鼻之间连线为东海和南海的分界线；台湾以东海区则是指琉球群岛以南，巴士 海峡以北的太平洋水域。就整个海域自然地理分布范围而言东西跨度约2 4 个经度， 南北跨度约3 8 个纬度，海岸线长达1 8 0 0 0 多公里，生长着多达三、四千种海藻，其 中既包括红藻、蓝藻、绿藻、褐藻等大型底栖海藻和也包括硅藻、黄藻、金藻、甲 藻等小型浮游藻类n ，。中国的底栖海藻多为暖温带、亚热带和热带种类，但也有少 数冷温带及极少数的北极海洋植物种类口1 。 海藻分类最初主要从传统的形态学阶段开始，后来随着科学技术的不断发展， 尤其是分子生物学技术的研究和应用，海藻分类才进入了分子系统学阶段。目前将 传统的形态学与分子生物技术相结合的方法是现阶段研究海藻分类的主要方法。 1 1 海膜科的研究概况 海膜科( h a l y m e n i a c e a eb o r y1 8 2 8 ) 红藻隶属于红藻门( r h o d o p h y t a ) 隐丝 藻目( c r y p t o n e m i a l e s ) 。藻体直立，叶状或很多分枝，柔软黏质到硬软骨质，有或 无一个明显的柄口1 。多轴构造，有一个较细或粗壮，疏松或密集的丝状体组成的髓 层和一个由卵圆形细胞背斜排列成线状或成薄壁组织的皮层，髓层有或无星状或反 光折射的神经节细胞，藻红体盘状或细长，每个皮层细胞含少量或多数。生活史由 三相世代组成：同型配子体和四分孢子体。海膜科广泛的分布于世界各地海域， 全世界共报导有约2 0 属2 0 0 多种( w o m e r s l e y & l e w i s1 9 9 4 ) 。在我国，夏邦美( 2 0 0 4 ) 在中国海藻志第二卷红藻门第三册中记述了我国沿海产的7 属5 1 种海膜科海 藻。最近几年来，随着分子生物学技术的飞速发展和不断应用，国际上一些藻类学 专家开始利用分子数据构建系统树，进而研究海膜科海藻物种地理起源和系统发生 关系并且取得了一些成果。但是，在我国由于各种各样的原因仍然有部分海藻分类 的研究工作还停留在传统的形态分类和调查研究的水平上。另外，由于该科的种类 中国海膜科蜈蚣藻属三个新种的研究 外部形态各种各样，种的区分、鉴定非常困难，所以该科到目前为止还没有建立一 个妥当的分类系统。被世界各国海藻分类学家认为是最难分类的科之一。 j a g a r d h ( 1 8 4 2 ) 将海藻中的有关属组织起来形成现在分类学上的海膜科( 当时名 为隐丝藻科c r y p t o n e m i a c e a e ) ，在他的隐丝藻科中包括了海膜属、蜈蚣藻属、隐丝 藻属以及其他的2 1 属，但是后来这2 1 个属又被转移了出去。h a r v e y ( 1 8 4 9 ) 通过研 究又重新定义了c r y p t o n e m i a c e a e 的范围，目前海膜科中的所有属中只有海膜属和蜈 蚣藻属在当时是包括在其中。j a g a r d h ( 1 8 5 1 ) 建立了一个新属p r i o n i t i s ( 锯齿藻属) ， 并于 18 7 6 年将p a c h y m e n i a , p r i o n i t i s , p o l y o p e s , c r y p t o n e m i a , t h a m n o c l o n i u m , h a l y m e n 玩g r a t e l o u p i ac o r y n o m o r p h a 和其他六属转入c r y p t o n e m i a e e a e 。 s c h m i t z ( 1 8 8 9 ) 提出了蜈蚣藻科的命名，并将a e o d e s , p a c h y m e n i a , d e r m o c o r y m u s , p r i o n i t i s , p o l y o p e s , c r y p t o n e m i a , t h a m n o c l o n i u m , c a r p o p e l t i s , g r a t e l o u p 概h a l y m e n i a 和c o r y n o m o r p h a 放入其中。这个名称在1 8 9 2 年由s c h m i t z 完全使它生效。而 p a p e n f e s s ( 1 9 5 5 ) 重新将隐丝藻科作为这个家族的名称，并将蜈蚣藻科作为它的异名。 k y l i n ( 1 9 5 6 ) 将1 9 个属转移了进入这个家族，它们是p a c h y m e n 妞p r i o n i t i s p o l y o p e s , a e o d e s , c r y p t o n e m i a , c a r p o p e l t i s , p h y l l y m e n i a 等。g u i r y ( 19 7 8 ) 指出海膜科才 是这个家族最早的有效名称。海膜科的重要属海膜属是c a g a r c l h 于1 8 1 7 年在 h f l o r e s i a ( c l e m e n t e ) c a g a r d h 和其他七个种的基础上建立起来的。1 8 8 9 年，s c h m i t z 选择了h f l o r e s i a 作为该属的属模。蜈蚣藻属是由c a g a r d h 在1 8 2 2 年在g h y s t r x c a g a r d h , g o r n a t ac a g a r d h 和g f i l i c i n a ( l a m o u r o u x ) c a g a r d h 这三种的基础上建立 的，该属现在包括4 0 余种，属模为g f i l i c i n a 。 1 1 1 海膜科的形态学研究进展 海膜科( h a l y m e n i a c e a e ) 自1 8 4 2 年建立以来( 当时名为隐丝藻科 c r y p t o n e m i a c e a e ) ，世界各国的海藻类分类学家都致力于完善海膜科的系统发育体 系。经过藻类学家一个半世纪的努力，已经取得了一些喜人的成果，尤其是近二三 十年来，海膜科的研究进入了一个高速发展时期。 b e r t h o l d ( 1 8 8 4 ) 是世界上第一个研究海膜科生殖器官发育的人，在他的专著中系 统的阐明了海膜科蜈蚣藻属中的两种蜈蚣藻的囊果在受精前后发育的全过程。在 1 9 3 0 年，k y l i n 对海膜科蜈蚣藻属中的g r a t e l o u p u af i l i c i n a 进行了详细的研究。 h o l l e n b e r g ( 1 9 4 0 ) 研究了d e r m o c o r y n u s 属，通过研究他从d e r m o c o r y n u s 属中移出了 一个新的科d e r m o c o r y m i d a c e a e 。 辽宁师范大学硕士学位论文 c h i a n g ( 1 9 7 0 ) 口】分别对海膜科1 2 个属的不同种雌性生殖器官作了详细的研究。 通过研究，c h i a n g 根据助细胞的位置及在它周围联络丝所形成的助细胞瓶状体的特 点，将海膜科的所有种类分为5 种不同的类型，分别是：1 ) a e o d e s 型，2 ) g r a t e l o u p i a 型，3 ) h a l y m e n i a 型，4 ) c r y p t o n e m i a 型和5 ) t h a m n o c l o n i u m 型。c h i a n g 表示海膜科 红藻具有产生助细胞瓶状体的形态学特征在属水平上的区分有重要的系统分类意 义。并提出了自己对这个家族属的系统发育关系的一些看法旧。然而，许多学者都 质疑将这种特征应用于海膜科红藻的区分的正确性f r u a f t1 9 7 7 ，g u i r y & m a g g s 1 9 8 2 ) 。 由于海膜科在形态上的多样性造成海膜科属的区分十分的不稳定，长久以来一 直没有一个分类标准。海膜科大约有2 1 属都是根据总的形态特征进行区分的，如： 藻体大小、形状、质地和分枝的程度m1 9 5 6 ；c h i a n g1 9 7 0 ；w o m e r s l e y & l e w i s l 9 9 4 ) 。 w o m e r s l e y & l e w i s ( 1 9 9 4 ) 对分布在全世界各地海域的2 0 属2 0 0 多种的海膜 科物种进行了报道，并对其中的一些种作了详细的形态学上的描述。但是通过藻类 专家进一步的研究，发现许多属的划分要求必须进行更进一步的研究。 1 1 2 海膜科的分子系统学研究进展 j 随着分子生物学的迅速发展，分子系统学、分子遗传学等新技术和方法在海藻 分类学领域的研究和利用步伐不断加快，利用分子生物学和传统的形态观察相结合 对很多海藻类群进行分类即分子系统学的研究也取得了一定进展，特别是通过比较 不同种的r b c l 基因的核苷酸序列的差异和传统的形态学等进行比较研究等有很多 报道，利用此方法在红藻的很多类群的属、种的分类研究中取得了进展( b 矾e t a 1 1 9 9 2 ：h o m m e r s n de ta 1 1 9 9 4 ，1 9 9 9 ；f r e s h w a t e re ta 1 1 9 9 4 ，1 9 9 5 ；f r e s h w a t e r r u e n e s s1 9 9 4 ；f r e d e r i e q & r a m i r e z1 9 9 6 ：f r e d e r i c qe ta 1 1 9 9 6 ：s a t m d e r s & k r a f t1 9 9 6 ； s h i m a d ae ta 1 19 9 9 ，2 0 0 0 ，2 0 0 2 ，2 0 0 4 等) 。 其中王宏伟教授在日本从1 9 9 8 年到2 0 0 5 年期间对分布于朝鲜半岛、日本、中 国大连和青岛、马来西亚、越南、澳大利亚以及意大利( 地中海) 等地的海膜科7 属4 6 种海藻进行了传统的形态学和分子生物学研究。在研究的过程中对每一种藻体 营养体的形态结构和生殖器官的位置及构造都进行了详细的观察，绘制和拍照了大 量的图片，并且对个别形态变异比较大的海藻进行了室内培养研究，追踪了他们不 同生长阶段的形态变化。对每个个体的r b c l 基因( 1 4 6 7b p ) 序列，利用自己设计 的3 对引物进行p c r 扩增，通过测序确定了而乩基因核苷酸序列，利用近邻结合 中国海膜科蜈蚣藻属三个新种的研究 法、最节约法和最优法等建立了系统树，并对每个种的核苷酸序列进行了比较分析， 确立了各种间的遗传距离和种的遗传多样性。在研究的过程中，王宏伟采用不同方 法建立的系统树都分明显地分为5 个单系统，和c h i a n g ( 1 9 7 0 ) 建立的5 种助细 胞瓶状体类型相一致，从而得出了助细胞瓶状体是这个科进行属的分类最有效的形 态学证明，总结出来该科在形态学上分类的依据，同时也确定了利用传统的形态学 和现代分子生物学相结合是将来海藻分类研究的发展趋势。近几年来王宏伟通过研 究，发现一个新属3 个新种和1 4 个新组合，另外恢复了两个种名，纠正了一些很多 年来的错误结论以及一些有争议的问题。王宏伟【7 】等通过对产自亚洲的蜈蚣藻 ( g f i l i c i n a ) 和产自意大利的g f i l i c i n a 濮式标本产地) 在形态结构和分子方面的比 较研究，发现二者是完全独立的种，认为产自亚洲的蜈蚣藻( g f i l i c i n a ) 不是真正的 g f i l i c i n a ，故将亚洲产的蜈蚣藻定为新种：g a s i a t i c a ( 亚洲有无g f i l i c i n a 有待于进 一步研究) ；并通过对蜈蚣藻中空变形、节荚变形和李伟新定的新种管型藻 s i n o t i b i m o r p h ap o r r a c e a0 讧a r t e 璐e xk i r z i n g ) l i & d i n g 的形态学和而正序列分析， 认为它们是同物异名，并和蜈蚣藻( g f i t i c i n a ) 进行了比较研究，认为既不是蜈蚣藻的 变形也不是新种，而是蜈蚣藻属中的一个独立的种，恢复了g c a t e n a t ay e n d o ( 1 9 2 0 ) 种名【8 】，纠正了h o w e ( 1 9 2 4 ) 统治了半个多世纪的错误结论。 真核藻类有三种类型的d n a ，分别是核d n a 、叶绿体d n a 以及线粒体d n a 。 海膜科红藻分子系统学研究主要集中在r b c l 序列、1 8 s r d n a 基因以及i t s 基因的 序列分析上。这三种基因分别属于叶绿体d n a 和核d n a ，而目前对藻类线粒体 d n a 所知甚少，所以它的基因序列还没有像质体d n a 那样被广泛地应用于藻类 系统学研究中。 ( 1 ) 核d n a 由于核基因是双亲遗传的，基因组十分庞大，进化快，变化差异大，所以很少 用于藻类的分子系统学研究。但是其中的核糖体d n a 是编码核糖体r n a 的基因， 在细胞核中以重复连续排列的方式存在，每个细胞中的拷贝数目在1 0 0 0 至1 0 0 0 0 之间，由于核糖体d n a 中包含了进化速度不等的编码区、非编码转录区和非转录 区，因此可以选取其中保守的片段用于系统发育和进化研究。在真核生物中r d n a 以1 8 sr d n a ( s m a l l s u b u n i ts s u ) 、5 8 sr d n a 、2 6 sr d n a ( 1 a r g e s u b u n i tl s 们的顺序 串联组成重复单体。其中内转录间隔区( i n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e ri t s ) 分为两个片段， i t s l 和i t s 2 。i t s l 连接1 8 s 和5 8 sr d n a ，i t s 2 连接5 8 s 和2 6 sr d n a 。s s ur 阶慵 区域很保守，而i t s l 区域碱基替换的频率是外显子区的1 0 倍，只有序列很接近的 一4 r 辽宁师范大学硕士学位论文 度中进行比较。其中将s s ur d n a 与i t s 的数据进行综合分 析可以增加结果的稳定性【9 】。 i t s 序列差异较大，呈现出高度的可变性，在微藻的分类研究中应用较为广泛。 国外的o t s u k as 【1 川以及国内的陈月琴【l l 】等、史全良【1 2 3 等分别利用i t s 序列对微囊 藻、共生念珠藻、颤藻科( o s c i l l a t o r i as p ) 等进行了研究。庄丽等( 2 0 0 1 ) 1 3 1 利用i t s 和1 8 sr d n a 研究了赤潮叉角藻的分类地位，结果表明i t s 为高变区，是一种非 常好的分子标记技术，可用于叉角藻的快速鉴定。苟万里( 2 0 0 4 ) 等利用r d n a 和 i t s 对青岛胶州湾的一株裸甲藻进行了研究，并初步确定了其分类地位，根据结果 鉴定为共生甲藻属。曲凌云等提取并分析了渤海赤潮中的棕囊藻1 8 sr d n a 和i t s 序列，结果显示其与球形棕囊藻同源性最高，从分子生物学角度确定了渤海区种类 的分类地位。除在微藻研究中的应用，在大型底栖海藻研究中的应用也有见报道。 国外的b e l l o r i n 等、p e t e r s 等以及国内的李文红等等利用i t s 序列对江蓠科( 热带 大西洋、太平洋) 、酸藻科、细基江蓠及其繁枝变种等进行了研究。 ( 2 ) 叶绿体d n a 叶绿体基因相对保守，平均每年每个位点的进化速度约为0 2 1 0 1 0 9 ，这一进 化速度仅为核基因的1 5 。而且叶绿体基因既不像线粒体基因组那样重排事件频繁 发生，也不像核基因组那样有较多的重复序列。此外，叶绿体d n a 具有独立的进 化路线，不依赖于其他数据就可构建分子系统树。所以，迄今为止藻类分子系统学 研究大多基于对叶绿体d n a 的比较分析【1 4 】。 r b c l 基因序列属于叶绿体基因，以单拷贝形式存在，不发生基因转变，长达1 4 k b ， 能提供较多的分子性状，进化速率非常慢，比较适合应用于分析比较高等级类元间 ( 远缘间及科级以上分类群) 的系统关系。近年来，随着分子生物技术的飞速发展， 通过利用分子对海膜科红藻的质粒编码r b c l ( 核酮糖1 ，5 二磷酸羧化酶氧化酶大亚 基基因) 的核酸序列分析表明：r b c l 基因序列能为推断科属之间的系统发育关系提 供线索( f r e s h w a t e re ta l ，1 9 9 4 ；h o m m e r s a n de ta l1 9 9 4 ；f r e d e f i c qe ta l ，1 9 9 6 ) ，甚至能为 种的区分和辨别提供依据( g o f f e ta l ，1 9 9 4 ；c h o p i ne ta l ，1 9 9 6 ；s h i m a d ae ta l ，2 0 0 0 ；w a n g e ta l ，2 0 0 0 ) 。r u b i s c o 和小亚基基因间隙( r b c s ) 贝u 适用于属间和种以上水平的研究。 国外的k o s t r z e w a 1 5 】等h o m m e r s a n d 1 6 】等、d ej o n g 等( 1 9 9 8 ) 、k o g a m e 等【1 7 k a a n 与g u i r y 应用r b c l 及，6 c l 和而c s 之间间隔序列的核苷酸序列研究了对丝藻 ( a n t i t h a m n i o ns p ) 、橡叶藻( p h y c o d r y sr u b e n s ) 、石花菜目、杉藻目、萱藻目、翅 藻属等。国内的苏乔 6 1 等对中国沿海角叉菜( c h o n d r u s ) 进行了形态观察和r b c l 序列 分析，认为中国沿海存在c o c e l l a t u s ，c n i p p o n i c u s 和c a r m a t u s 等3 种角叉菜。 一5 - 中国海膜科蜈蚣藻属三个新种的研究 而c l 基因序列在海藻分类研究中应用最为广泛，除在大型海藻中的应用，在微藻研 究中也有应用。国外的p i c h a r d 等利用而c l 基因对自然浮游群落进行了系统多样 性分析。国内的刘金姐等利用鱼腥藻( a n a b a e n a ) 序列和聚球藻( s y n e c h o c o c c u s ) 序列与 f a c h b 3 4 1 序列进行了r b c s 同源性分析。孟振( 2 0 0 6 ) 对盐生杜氏藻进行了r b c l 序列差异分析，结果显示r b c l 基因序列中存在更多的碱基替代，基于8 株杜氏藻的 表型分析支持分子系统学的分析结果。 1 1 3 蜈蚣藻属的研究概况 蜈蚣藻属( g r a t e l o u p i ac a g a r d h ) 红藻隶属于红藻门( r h o d o p h y t a ) 隐丝藻目 ( c r y p t o n e m i a l e s ) 海膜科( i - i a l y m e n i a c e a e ) 。藻体叶片呈现淡红黄色或紫红色， 黏滑或软骨质，直立，单生或丛生。海藻高5 - 2 0 e m 以上，其固着器盘状，主枝圆 柱形，亚圆柱形或扁形。1 3 回羽状分枝，小枝互生，对生或偏生。有的为扁披针 形或叶片状，基部有的具柄，掌状或叉状分裂。有的为叉状或叉羽状分枝。多轴型。 中央髓部由纵走髓丝错综交织着形成。外围为皮层，多为圆形、椭圆形或不规则形 细胞组成，背斜排列。生活史由三相世代组成：同型配子体和四分孢子体【1 1 。全世 界共有8 0 种，我国分布3 2 种。 在上世纪八十年代以前，蜈蚣藻属的系统学分类研究主要是应用传统的形态学 分类和形态解剖以及调查研究等方法，c h i a n g ( 1 9 7 0 ) 通过对海膜科不同种类海藻的 雌性生殖器官的研究，根据助细胞的位置及在它周围联络丝所形成的助细胞瓶状体 的特点，提出了将海膜科的所有种类分为5 种不同的类型的建议。但是自从八十年 代末期开始，由于基因序列比较分析等分子生物学技术的不断发展和应用，蜈蚣藻 属系统分类学进入了分子系统学研究阶段，即将传统的形态学分类和分子系统学相 结合。二十世纪九十年代初期，蜈蚣藻属d n a 分析最常用的方法是r f l r ( 限制性 内切酶酶切片段长度多态性) 的方法，g o f f 和c o l e m 趾【1 8 】以及p a r s o n s 等【1 9 】利用 r f l p 技术对江蓠属( g r a c i l a r i a ) 和5 ( 枝拟伊藻( g y m n o g o n g r u s ) 海藻进行了研究。但 是随着d n a 测序和计算机分析技术的飞速发展和应用，d n a 序列分析已经成为蜈 蚣藻分子系统学研究的主要方法，从而使分析结果更加准确、可靠、可信。另外， 其他一些简便快捷的分子遗传标记技术、微卫星技术、单链构象多态性( s s c p ) 技术 等也被用于蜈蚣藻属红藻的分子系统学研究之中。例如在2 0 0 0 年，王茜，安利佳， 王宏伟等采用r a p d 技术在分子水平上对属于蜈蚣藻属的两种藻类一蜈蚣藻和管 形藻进行了研究分析，得出了两种藻类差异较大，确定它们为两个不同的属。o l i v i e r d ec l e r c he t a l ( 2 0 0 4 ) 2 0 3 根据而正序列分析和形态学研究得出了一些结论，包括g m i n i m a 的恢复使用和g r a t e l o u p i ac a p e n s i ss p n o v 的报导来研究g r a t e l o u p i a 辽宁师范大学硕士学位论文 f i l i c i n a 指出了被重新使用的g m i n i m ap 觚g r o u a b 是g f i l i c i n a 的异名。提出了一 种新种g c a p e n s i ss p n o v 以及将g f i l i c i n a 变种l u x u r i a n s 提升至种的地位。 g d o r y p h o r a 最初是被划入海膜属作为h a l y m e n i ad o r y p h o r am o n t a g n e 进行报道 的， s u z a n n ef r e d e r i c q 和b r i g i t t eg a v i o 两人在应用r b c l 基因序列构建系统树分析 基础上对它进行研究时，发现了在大西洋被当作g d o r y p h o r a 的并非本地种的正确 名称，实际上是g n f 九f 缸f ，1 f 【2 1 1 。 对于蜈蚣藻属的助细胞瓶状体的发育过程有了很多详细的研究。来自中国台湾 的s h o w e - m e i l i ne t a l 2 2 1 ( 2 0 0 8 ) 在r b c l 基因序列分析和孢子萌发研究的基础上对采 集台湾的蜈蚣藻属中的两个新种g r a t e l o u p i ao r i e n t a l i ss p n o v 和g r a t e l o u p h 2i t a i w a n e n s i ss p n o v 的助细胞瓶状体进行了详细的研究，经过研究发现在两个蜈蚣藻 属新种g t a i w a n e n s i ss m l i ne th - y l i a n gs p n o v 和g o r i e n t a l i ss _ m l i nv t h 一y l i a n gs p n o v 以及一个来自台湾的g r a m o s i s s i m a 中，助细胞瓶状体的发育模式 是完全不同的具有两种完全不同的，分别是g t a i w a n e n s i s 式和g o r i e n t a l i s 式，并对 它们的发育过程进行了详细的描述。根据而c l 基因序列分析得出了g - o r i e n t a l & 位 于蜈蚣藻属进化枝中，而g t a i w a n e n s i s 则位于另一个进化枝中，其中包括有 聊l l y m e n i a 的属模p h b e l a n g e r i 、p r i o n i t i s 的属模p r 1 a n c e o l a t a 和p a c h y m e n i o p s i s ( r a m a d a1 9 5 4 ) 属的p a 1 a n c e o l a t a 。根据分析结果提出了对蜈蚣藻属、p h y l l y m e n i a 、 p r i o n i t i s 、p a c h y m e n i o p s i s 的属模进行再度检测的建议，从而更好地区分蜈蚣藻属之 间以及和其他各属之间的关系。 1 2 研究的目的和意义 海膜科蜈蚣藻属的种类外部形态各种各样，从枝状体到膜状体等变异很大，而 同一种类的形态也因生态环境、地域等不同而相差巨大。种的区分、鉴定非常困难， 所以该科的属的分类还没有最后确定，到目前为止还没有建立一个妥当的分类系统。 被世界各国海藻分类学家认为是最难分类的科之一。但是在我国大多数海藻分类研 究工作还停留在经典的形态分类和调查研究的水平上。近年来，随着分子生物学技 术的不断发展，分子标记技术在海洋生物的研究中得到了广泛的应用：如遗传变异 水平的检测；包括遗传图谱的建立和分析，遗传改良、选育鉴定等；系统学研究； 保护生物学，濒危种群结构变化的监控等以及生理学、医学、病害与环境科学等领 域。目前，一些重要的海洋养殖生物的遗传连锁图已经建立起来；一批重要经济性 状的基因已被定位和克隆。相信在不久的未来，海洋生物多样性的研究和保护将是 海洋生物资源开发和利用的关键和基础，对海洋生物资源的保护和开发并永续利用 都是十分重要的。国际上的一些海藻分类学家将分子生物技术与传统的形态分类相 - 7 - 中国海膜科蜈蚣藻属三个新种的研究 结合，即分子系统学应用到海藻额分类当中去，这一方法的应用取得了很多成果， 纠正了一些错误。现在国际上的一些海藻分类专家已经开始利用分子数据构建系统 树，进而研究蜈蚣藻属海藻物种地理起源和系统发生关系。 本研究采用传统的形态观察、比较解剖学等方法，对分布于我国大连、青岛、