（农产品加工及贮藏工程专业论文）根霉酯化酶液态培养、酶学特性及应用.pdf

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对提高酶活有促进作用，z n ”、c u 2 + 对酶活有相对 较强的抑制作用。在反应时间l 一一3 h 范围内，反应时间与转化率有良好的 线性关系，此时反应速度为酶促反应初速度。 4 、饮料酸度、酶添加量及时间影响酯化酶在酸性苹果饮料中的增香效果。 在o5 1 的酸度苹果饮料中，添加1 的酯化酶，3 5 。c 下酯化3 d 总挥发酯 达到o 5 9 4 9 l ，有良好增香效果。 关键词：根霉；酯化酶；液态培养；酶学特性 根霉酯化酶液态培养、酶学特性及应用 a b s t r a c t e s t e r so fs h o r tc h a i nf a t t ya c i d sa n da l c o h o l sa r ek n o w na sf l a v o u ra n d f r a g r a n c ec o m p o u n d s ，a n dt h e y a r ew i d e l yu s e di nt h e f o o d ，b e v e r a g e ， c o s m e t i ca n dp h a r m a c e u t i c a li n d u s t r i e s t h ef l a v o u ra n df r a g r a n c ee s t e r s p r e p a r e db ye n z y m a t i cs y n t h e s i sm a yb el a b e l e da s “n a t u r a lf o o d ”an e w m e t h o dt op r o d u c en a t u r a le s t e r si so p e n e db ye n z y m ec a t a l y s i s e s t e r i f y i n g e n z y m eo fr h i z o p u ss p n o to n l yh a st h ea b i l i t yt os y n t h e s i z ee t h y lh e x a n o a t e b u ta l s os y n t h e s i z eo t h e re s t e r s 1 1 1 em e d i u mc o m p o n e n t s c u l t i v a t i o nc o n d i t i o n sa n de n z y m ep r o p e r t i e s o fr h i z o p u ss p w e r es t u d i e di nt h i sr e s e a r c h e s t e r i f y i n ge n z y m ew a su s e di n s o u ra p p l eb e v e r a g e p r i m a r i l ys t u d yr e s u l t sa sf o l l o w s ： 1 、t h i st h e s i sh a su s e dr h i z o p u ss p a st h ee x p e r i m e n tb a c t e r i a la n dc a r r i e d r e s e a r c ho nt h ee f f e c t so ft h er a t i oo fc a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c e ，n i t r o g e n s o u r c e ，c a r b o ns o u r c e ，d e n s i t yo fc o m p o n e n to ff e r m e n t e dc u l t u r e ，a n dt h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a t ：n eb e s tn i t r o g e ns o u r c ew a st h em i x t u r eo fs o y b e a n p o w d e ra n da l b u m e np e p t o n e ，t h eb e s tr a t i oo f c a r b o na n dn i t r o g e ns o u i c ew a s 5 t h ee n z y m ea c t i v i t yw o u l db eh i g h e ri f 4 o l i v eo i lw a sa d d e d o p t i m a ll i q u i d m e d i u m c o m p o n e n t s w e r ea s f o l l o w s ：s o y b e a np o w d e r o 5 b r a n 6 ，k 2 h p 0 4o 2 ，t h ee n z y m ea c t i v i t yc o u l db er e a c h e dt h eh i g h e s ta f t e r3 6 h 2 、e s t e r i f y i n ge n z y m ea c t i “t yo f r h i z o p u ss p w a sa f f e c t e db yt h ei n o c u l a t i n g v o l u m e ，c u l t u r ed e n s i t y , f l a s k o ff e r m e n t a t i o nv o l u m e ，i n i t i a l p hv a l u e ， t e m p e r a t u r ea n da g i t a t i o nf r e q u e n c y t h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s w e r ep h7 0 i n o c u l a t i n ga m o u n t l 2 ，f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e3 0 ，t h e a g i t a t i o n f r e q u e n c y1 5 0 r m a n d3 5 m l 2 5 0 m l f l a s k o f f e r m e n t a t i o n v o l u m e 3 、t h eo p t i m m nt e m p e r a t u r eo fe s t e r i f y i n ge n z y m ew a s4 09 c i ta l s oh a d a c t i v i t ya tar a n g ef r o m3 0 。c t o5 0 c t 1 1 eo p t i m u mp hw a s7 0t h ea c t i v i t y w a sm a i n t a i n e db yh e a t i n ga t4 0 。ca n dp h6 8 t h ee n z y m ea c t i v i t yw a s p r o m o t e db yc a 2 + , b u tw a si n h i b i t e db yz n 2 + 、c u 2 + i nr e a c t i o nt i m ew i t h i n1 - 3 2 山东农业大学硕士学位论文 h o u r s ：r e a c t i o nt i m ea n dc o n v e r s i o nr a t e sw e r eg o o dl i n e a rr e l a t i o n s h i p ，t h i s r e a c t i o nr a t ew a si n i t i a lv e l o c i t y 4 、s o u r , t h ea m o u n to fe n z y m ea n dt i m ea f f e c tt h ef l a v o ra n df r a g r a n c eo fs o u r a p p l eb e v e r a g e t h er e s u l ts h o w st h a t0 51 a c i da n do 1 e s t e r i f y i n g e n z y m ef e r m e n t e d3d a y sa t3 5 。c ，t h et o t a lv o l a t i l ee s t e rc o u l dr e a c h0 5 9 4 9 l k e y w o r d ：r h i z o p u ss p ，e s t e r i f y i n ge n z y m e ，l i q u i df e r m e n t a t i o n ，e n z y m e p r o p e r t i e s 3 根霉酯化酶液态培养、酶学特性及应用 1 引言 1 1 食品中的短碳链羧酸酯风味香气成分合成与应用 短碳链羧酸酯是重要的自然风味香气成分，近年来，国内外引起广泛 关注。特别是通过酯化酶催化合成的风昧酯被称为“绿色产品”( sh a r i k r i s h n ae ta l ，2 0 0 0 ) 。短碳链芳香酯是众所周知的风味香气成分，是我国 酿酒、食品、饮料、医药工业、香精香料行业等常用的添加剂或原料，每 年产量达几千吨，产值上亿元。目前大部分风味成分通过传统的化学法合 成或从天然原料中提取。在产品的安全性和使用效果上都处于低水平。由 于生物方法生产的芳香酯在美国的联邦法规和许多发达国家都被认为是 天然的产物。对绿色食品的追求，促使风味行业寻求新的方法获得天然绿 色风味酯。通过发酵直接生物合成被认为是很有潜力的方法( c h r i s t e na n d m u n g u i a ，1 9 9 4 ) 。然而通过发酵获得的酯的浓度和产率都很低。一种新的 通过酶在有机溶剂或无溶剂体系中催化酯合成成为可能( g u b i c z ae t a l ， 2 0 0 0 ) 。直接酯合成反应和酯交换反应已经用来生产乙酸酯、丁酸酯等多 种风味酯。 风味香气工业分为四大领域，复杂风味、复杂香气、天然原料和化学 合成。随着新的原料的寻找，天然风味越来越受到青睐，美国1 9 9 2 年时 所用的风味香气成分已有6 0 为来源于天然原料( a n np r z y b y l aw i l k e s ， 1 9 9 2 1 。自然风味香气成分包括通过发酵，酶技术转化和从天然原料中提 取获得。最终成品或原料半成品通过这几种方法加工。自然风味香气的制 作往往需要这三种方法的综合应用。 早期的风味香气成分主要通过萃取和蒸馏获得。从植物芳香部分萃 取，然后浓缩，经分馏选择不同芳香成分。随着分离技术的不断进步，萃 取成为一种从天然原料中获得风味香气成分的重要方法。萃取和蒸馏方法 很多，不同极性的溶剂或不同蒸馏温度可获得不同的芳香成分。 通过化学反应来合成芳香成分，目前大部分风味酯通过化学法合成。 但随着人们对绿色食品的追求以及回归自然的倾向，化学成分通过无机催 化剂合成的芳香酯不能满足人们的需要。 因此以自然界生物催化剂( 酶或细胞) 实现对自然界丰富的生物量原 料自然过程制造产生的风味芳香成分应运而生。 山东农业大学硕士学位论文 表1 生物转化与化学合成的比较( 徐岩，2 0 0 s ) t a b ic o m p a r a t i o no fb i o t r a n s f o r m a t i o na n dc h e m o s y n t h e s i s 随着生活水平的提高、健康意识的增强以其特有的高品质和有益于健 康的特点，香味剂在食品、饮料、化妆品和个人护理用品中应用成为市场 的主要发展趋势，成为国际上研发的重点。目前己有多个生物香味剂产品 实现商业化生产。 1 2 酯化酶与产酶微生物 酯化酶是能使呈香前体物质转化为香味物质的酶类。酯化酶也不是酶 学上的用语，酶学上应是脂肪酶和酯酶的统称解脂酶( 2 e 耀，2 0 0 3 ) 。 我国酯化酶应用主要是粗酶制剂，目前工业化生产的有根霉酯化酶粗酶制 剂和红曲酯化酶粗酶制剂，多应用于酒中增酯。 酯化酶具有多向合成功能，能受控同时合成浓香型酒以己酸乙酯为主 体香的四大酯，也可单一合成纯已酸乙酯，还可合成稀有酯类。用于液态 法白酒、串香白酒和新型白酒的增香，免除化学香料调香中存在的“浮香”， 从而提高质量，使普通白酒向优质白酒转化，以及创新白酒香型( 吴衍庸， 2 0 0 3 1 。在2 0 世纪8 0 年代前后相当一段时间内，提高浓香型大曲酒质量 的主攻方向是增己降乳( 提高己酸乙酯含量降低乳酸乙酯含量) 。在众多 生产工艺的技术措施中必然会注意到增强酯化作用的问题。自1 9 7 6 年发 现酵母及曲霉菌在不同条件下对己酸的酯化作用后，直至2 0 世纪9 0 年代 初，庄名扬等报道了其对曲霉菌的酯化作用较系统的研究成果，特别是应 用于全兴酒厂的生产实践取得了良好的效果后，有关酒厂及科研单位在这 方面的试验结果较多( 沈怡方，2 0 0 3 ) 。 根霉酯化酶液态培养、酶学特性及应用 随着发酵食品工业的发展和人们对发酵产品风味质量要求的提高，生 香微生物的研究受到广泛重视( j a n s s e n sl e ta l ，1 9 9 2 ) 。我国传统酿造食 品开放式发酵，含有丰富的生香微生物，包括众多种类霉菌、酵母菌、细 菌，应用从麦曲中分离、筛选、纯化的黄曲霉、根霉、红曲霉等作为酯化 菌提高浓香型曲酒酒质成为一项重要技术措施( 吴衍庸等，2 0 0 2 ) 。根霉菌 是北方大曲霉菌中的主体霉菌，含有丰富的淀粉酶和糖化酶，有的菌株含 有丰富的酯化酶系，具有合成较长直链酯的能力( 吴衍庸等，1 9 9 6 ) 。 在自然界中能产酯化酶的微生物资源是非常丰富的，从分类上看主要 是真菌，真菌中主要是青霉、镰孢霉、红曲霉、黑曲霉、黄曲霉、根霉、 毛霉、酵母菌、犁头霉、须霉、白地霉和核盘菌等1 2 属2 3 种。其次是细 菌，细菌主要是假单胞菌、粘质赛氏杆菌、无色杆菌和葡萄球菌等。另外， 放线菌中的个别种类也能产生一定量的酯化酶。青霉属有灰绿青霉 ( p e n i c i l l i u mg l k a u c u m ) 、娄地青霉( p e l l r o g u e f o r t o 、产黄青霉 ( p e nc h r y s o g e n u m ) 、草酸青霉p e no x a l i c u m ) 、圆弧青霉( p e n i c i l i u m c y c l o p i u m ) 和果味青霉( p e n i c i l i u md e c u m b e n s ) 等。红曲霉属中已报道过1 7 种，然而有些种的界限并不明确，在实际生产中经常应用的仅有紫色红曲 霉和烟色红曲霉。根霉属中已报道的根霉有近2 0 种，其中主要的为匍枝 根霉、华根霉、米根霉和无根根霉。其次，还有河内根霉、结节根霉、甘 薯根霉、小麦曲根霉和德氏根霉等。除此以外，像巴特勒犁头霉b s i d i a b u t l e r i l 、羊毛状腐质霉( h u m i c o al a n u g i n o s a ) 、自地霉( g e o t r i c h u mc a n d i d u m l i 砌等酯化酶的含量也比较高。目前，我国的科技工作者，利用红曲霉、 根霉和球拟酵母等产生的酯化酶，提高浓香型曲酒中的己酸乙酯、乙酸乙 酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯等四大酯的含量，提高优级率均获得大生产的成 功( 施安辉等，2 0 0 2 ) 。 1 - 3 酯化酶的培养方法 目前主要通过固态培养生产酯化酶。在浓香型大曲酒生产中，采用根 霉培养麸曲生产酯化酶粗酶制剂来提高酒质的方法，具有明显的效果。因 此，各酒厂对酯化酶的研究及应用也越来越重视( 柬成忠等，2 0 0 1 ) 。固态 培养是一种传统的发酵生产方式，由于其具有成本低、预处理简单、设备 体积小、能耗低、产物浓度高、生产废弃物少且易处理等特点，己被广泛 山东农业大学硕士学位论文 用于多种酶和菌体孢子的生产。工业固态发酵一般都以天然固态基质为底 物，与液态发酵相比，由于天然基质的组成复杂，底物消耗或产物生成情 况难以定量，菌丝体与基质紧密结合，生物量的测定非常麻烦且不准确， 故很难对微生物的生长和代谢过程进行定量研究。但是出于设备、成本等 因素考虑目前普遍采用的固态制曲，无论在传统制曲还是机械制曲生产酯 化酶粗酶制剂的过程中，常常会出现杂菌污染的现象，轻则影响产品的合 格品率，重则造成成批产品的报废。生产酯化酶粗酶制剂的过程中，时常 被杂菌污染的问题所困扰f 杜礼全等，2 0 0 3 ) 。 目前应用于生产的酯化酶主要是根霉、红曲霉固态培养的菌体和复合 粗酶制剂。但固态培养获得的酯化酶制剂酶活低，生产标准化程度低，通 风差，培养周期较长，生香效果不稳定，增香针对性不强，培养参数不易 调控。液态培养可有效弥补固态培养的缺点，它可以精确控制营养成分、 有效防止杂菌污染、自动化程度高，适于工业化生产。研制开发液态法标 准化生产专用纯酯化酶制剂技术，是提高酯化酶质量和扩大应用的关键。 碳源是微生物生长过程中为微生物提供碳素来源的物质。碳源物质在 细胞内经过一系列复杂的化学变化后成为微生物自身的细胞物质和代谢 产物。微生物利用碳源物质具有选择性，不同的微生物或原生长环境不同 的同种微生物，对碳源的利用是有区别的。氮源物质为微生物提供氮素来 源，这类物质主要用来合成细胞中的含氮物质，如蛋白质、核酸等。微生 物对氮源的利用也是有选择性的。根据菌体成分的分析，发现在各种微生 物的细胞中，其不同成分或元素间是有较稳定比例的。在异养微生物中， 碳源还兼作能源，而氮源提供微生物生长和繁殖的必须氨基酸和蛋白质。 不同培养目的，其培养基的碳源和氮源的比例是不同的。 徐岩等( 2 0 0 0 ) 研究了华根霉( r h 招o p u sc h i n e s ey - 9 2 ) 产脂肪酶发酵培 养基及发酵条件，采用优化后的豆饼粉一蛋白胨培养基可减少了发酵过程 中产生的泡沫，有利于大罐发酵，酶活提高1 0 。刘光烨等( 2 0 0 2 ) 采用液 态培养根霉c s 8 2 5 菌株，在液态培养时菌丝生长良好，同时在菌丝体中积 累胞内酯化酶和在发酵液中形成胞外酯化酶；刘斌等对根霉酯化酶液态发 酵条件研究，豆饼粉和麸皮各5 9 对产酶有利。2 8 。c ，1 5 0 r m 添加o 3 9 蔗 糖和o 3 9 硝酸钠对产酶有利，接种量为2 m l ( 1 1 07 ) ，2 8 。c 培养时，可得较 根霉酯化酶液态培养、酶学特性及应用 高的酶活力。( 刘斌等，2 0 0 3 ) 。目前液态培养还处在试验阶段，少有工业规 模化生产，可供生产参考的液态培养碳源、氮源和碳氮比等主要参数以及 发酵温度、转速、装液量等培养条件参数还很少，这也是限制了根霉酯化 酶工业化生产的主要因素。 1 4 酯化酶酶学研究 酯化酶的特性与产生酯化酶的微生物( 酯化菌) 有关，酯化菌在细菌、 霉菌、酵母中均存在，酵母菌合成乙酸乙酯的能力较强，而有的曲霉、根 霉、毛霉菌株合成较长直链酯的能力强，浓香型大曲中的红曲霉、根霉和 毛霉菌株具有合成较长直链酯的酯化活性( 刘光烨等，2 0 0 2 ) 。来源不同的 酯化酶，其最适作用温度不同。r a f l f i 等从假单胞菌( p s e u d o m o n a s ) s h 分离 酯化酶，在1 0 0 条件下能稳定存活，甚至在1 5 0 以上仍有数秒钟半衰 期，一般真菌酯化酶最适作用温度相对较低，而细菌酯化酶则较耐热。 酯化酶最适p h 受来源、底物种类和浓度、缓冲液种类和浓度等许多 因素影响。各种来源不同酯化酶，在一定条件下都有其特定最适p h 和p h 稳定范围。大多数细菌酯化酶最适p h 在中性或碱性范围内f d h a r r n s t h i t is e ta l ，1 9 9 8 ) ，稳定范围一般在p h 4 0 1 1 0 ( d o n gh ，1 9 9 9 ) 。真菌酯化酶p h 稳定范围也较宽。少根根霉( r h i z o p u sa r r h i z u sb u c n 酯化酶在p h 6 0 8 0 范围内酶活都较稳定( 杨学吴等，2 0 0 4 ) ，毛霉( m u s o rs p ) m 2 酯化酶p h 值 稳定范围为7 0 1 0 o f 宋欣，1 9 9 8 ) 。 同一种金属离子能激活某种酯化酶，而对另一种酯化酶活性则具抑制 作用。酯化酶作用不需辅助因子，二价金属阳离子，如c a 2 + 可提高大多数 酯化酶酶稳定性和酶活，可能是因c a 2 十的结合作用，促使底物与活性部位 结合( k o kr g ，1 9 9 6 ) 。一般来说，c 0 2 + ，n i 2 + ， h 9 2 + 和s n 2 + 能强烈抑制多 数酯化酶活性，z n 2 + 和m g ”在一定程度上也可抑制酯化酶活( p a t k a r s a ，1 9 9 4 1 。 我国酯化酶研究虽在产酶条件、性质、酶促水解、合成、交换及工业 应用上研究了几十年，但由于酯化酶结构和性质的多样性、酶的不稳定性、 底物的水不溶性和纯化困难以及应用范围不广泛等问题，使得其研究进展 与蛋白酶、淀粉酶相比要慢得多也窄得多( 高贵等，2 0 0 3 ) 。酯化酶的酶学 特性、动力学、分子生物学等基础理论研究需要加强。 山东农业大学硕士学位论文 1 5 酯化酶的应用研究 酯化酶既有水解能力也有催化合成的特性。国外在水解方面研究较多 主要应用于奶制品如奶酪、奶油和人造黄油的增香。用酯化酶处理过的奶 制品可获得更多的脂肪、蛋白质和乳糖代谢的产物比未处理的具有更好的 香味和可接受性。国内倾向于合成方面的较多，多用于发酵产品中风味酯 的增加，尤其是浓香型白酒中己酸乙酯的合成。除食品应用之外，酯化酶 还广泛应用于、医药、洗洁剂、化妆品等行业( g a b r i e l a a l v e s m a c e d o ，2 0 0 3 ) 。 1 5 1 在乳品工业中的应用 酯化酶广泛应用于乳品工业中水解乳脂肪。目前应用包括干酪的增 香、干酪的加速成熟、奶制品的生产、奶油及冰淇淋的酯解改性等。通常 自由脂肪酸赋予奶制品特别是软干酪特有的风味。短链脂肪酸( c 4 c 6 ) 产 生强烈的芳香味，而中链脂肪酸( c 1 2 c 】4 ) 使产品具有肥皂味。另外自由脂 肪酸还参与到类似微生物反应的过程中，增加了一些新风味物质的形成， 如甲基酮类、风味酯类和乳酯类等( 吴秋明，2 0 0 4 ) 。 对奶源不同的奶制品，酯化酶的使用可大大改善其原有的不良风味， 促使新的风味的产生，并能改进乳制品的营养价值。酯化酶在酶改良干酪 ( z m c ) 中起重要作用，e m c 是一种干酪，在酶的作用下不断提高温度以 浓缩风味作为其他产品的添加剂。酶改性奶酪中含有的游离脂肪酸比只经 过普通处理的未成熟奶酪中要高1 0 倍以上，这种技术在美国广泛应用， 对于其作为风味增强剂是十分有利的。 1 5 2 在白酒工业中的应用 浓香型白酒的风格及酒质的优劣，主要取决于酒体中己酸乙酯含量的 高低以及与其它酯类物质的比例是否协调。这些酯类物质是由发酵产生的 酸与醇进一步缩合而成。为了提高己酸乙酯的含量，通过人工老窖泥培养 己酸菌的方法增加前体物己酸的含量，从而有利于己酸乙酯的合成，但是 酯化反应速度缓慢、转化率低等问题并未解决，由于在曲酒生产过程中， 发酵产酒快，产酯生香慢，特别是大曲中酯化菌含量较少，从根本限制了 己酸乙酯的生成，故造成了大曲酒生产发酵生香周期长，优质酒率较低。 而酒体中已酸乙酯的含量偏低历来是浓香型酒生产酒质低下、优质酒少的 主要原因。为了提高酒体中已酸乙酯的含量，故在酒醅中加入酯化酶来催 根霉酯化酶液态培养、酶学特性及应用 促已酸乙酯合成，因而能达到缩短发酵周期，提高酒体中已酸乙酯含量之 目的。在适当的条件下，酯化酶可直接催化酸与醇合成酯，并使反应速度 大大加快，从而使困扰白酒生产的发酵周期长和优质品率低的问题将会得 到进一步的解决。近年来，酯化酶对酯化反应的催化作用己被越来越多的 酿酒界人士所认识，成为新的研究热点。 酯化酶新技术的应用，是中国白酒工业的一项重大创新成果，为我国 白酒质量的提高，发展生态食品具有重要意义。酯化酶技术应用在白酒上， 对白酒质量的提高、发展生态食品具有重要意义。山东兰陵美酒股份有限 公司采用国内最先进的优良菌种生产，酯化酶活力高。产品主要应用于浓 香型大曲酒生产，可直接加入酒醅参与发酵，提高出酒率3 5 ，提高 优质酒率2 0 3 0 。目前，国内很多白酒厂应用酯化酶新技术都取得了 显著的效果( 傅金泉，2 0 0 6 ) 。 酯化酶在饮料中的可增加以乙酸乙酯为主的醋类物质含量，对提高果 蔬汁饮料品质有着重要意义，由于酯化酶增香效果不稳定，还没有纯酶制 剂，目前在食品的应用研究主要集中在固态白酒的增香，仅有陈义伦在苹 果醋贮存期采用酯化酶增香，得到优质苹果醋的报道( 陈义伦，2 0 0 2 ) 。在 液态白酒、饮料中鲜有研究。 1 6 研究内容、目的、意义 1 , 6 1 根霉酯化酶培养基及液态培养条件的优化，对培养基主要成分碳氮 源及温度、转速、装液量等培养条件进行研究，确定液态培养基及培养条 件，为液态酯化酶工业化生产提供技术基础。 1 6 2 根霉酯化酶的酶学特性，对酯化酶的最适温度、p h 、金属离子等进 行研究探讨其酶学特性，为阐明酯化酶基本性质、酯化规律提供理论基础。 1 6 3 根霉酯化酶在苹果酸性饮料中的初步应用，酯化酶粗酶应用于苹果 酸性饮料中进行增香试验，确定其催化合成芳香酯的能力。 目前根霉菌酯化酶研究取得了一定的成果。研究主要集中于根霉菌酯 化酶的生香应用研究，主要体现在将固态粗酶应用于提高白酒酯香的条件 研究，但液态培养技术研究不够系统、深入，停留在液体曲实验室阶段， 未建立液态分批培养技术体系和酶的质量标准，对根霉菌酯化酶的酶系组 成、基本性质、酯化机理未阐明，深入研究根霉酯化酶培养基及液态培养 1 0 山东农业大学硕士学位论文 条件、酶学特性对丰富微生物酶学理论和阐明酯化酶酶学特点、规律有科 学理论意义；系统研究建立其液态培养技术体系，对提高酯化酶质量及工 业化、标准化和专用化生产程度有理论应用价值和实践指导作用。 1 7 技术路线 匝翌 | 培养基优化培养条件优化 i 根霉菌酯化酶l l 塑亟坚固匪堕堕塑堕囹 甲 根霉酯化酶液态培养、酶学特性及应用 2 材料与方法 2 1 菌种根霉( 本实验室保藏菌种) 2 2 培养基 2 2 1 斜面培养基 配方：麸皮2 0 9 、水1 0 0 m l 、蔗糖1 5 卧琼脂1 5 9 。 2 2 2 发酵培养基 配方：蔗糖f 含碳量4 2 ) 0 5 蛋白f l g ( 含氮量1 2 5 ，添加量依据碳氮 比而定) 。 2 3 主要试剂 名称 无水乙醇 磷酸二氢钾 磷酸氢二钠 蛋白胨 牛肉浸膏 氢氧化钠 盐酸 蔗糖 聚乙烯醇 橄榄油 可溶性淀粉 冰乙酸 正己烷 邻苯二甲酸氢钾 琼脂 酵母浸膏 t r i t i o n x 一1 0 0 麸皮 生产单位 天津市红岩化学试剂厂 天津市德恩化学试剂有限公司 天津市河北区海晶精细化工厂 天津市大茂化学试剂厂 上海市牛奶公司第九牧场 天津市凯通化学试剂有限公司 济南试剂总厂 天津市巴斯夫化工有限公司 淮海精细化工厂 上海毕高化学试剂有限公司 天津市东丽区天大化学试剂厂 天津市凯通化学试剂有限公司 天津市凯通化学试剂有限公司 上海山浦化工有限公司 石狮市狮头琼脂有限公司 北京双旋微生物培养基制品厂 上海生物工程有限公司 纯级 分析纯 分析纯 分析纯 生物试剂 生化试剂 分析纯 分析纯 分析纯 化学纯 化学纯 分析纯 分析纯 分析纯 工作基准试剂 生化试剂 试剂纯 山东农业大学硕士学位论文 2 4 主要仪器： 名称 y x q g 0 2 型电热式蒸汽消毒器 h h - s 恒温水浴锅 k d m 可调控温电热套 电热恒温培养箱 s w - c j 一1 f 洁净工作台 n i k o ny s 2 电子显微镜 q l 9 0 1 漩涡混合器 h h b 11 - 5 0 0 电热恒温培养箱 z d 8 5 a 汽浴恒温震荡器 d e l t a 3 2 0 p h 计 产地 山东新华医疗器械厂 江苏省金坛市正基仪器有限公司 山东鄄城华鲁电热仪器有限公司 上海市跃进医疗器械一厂 苏州安泰空气技术有限公司 日本尼康光学仪器有限公司 江苏海门其林贝尔仪器制造公司 上海市跃进医疗器械一厂 金坛市科兴仪器厂 梅特勒一托利多仪器( 上海) 有限公司 2 5 分析方法 2 5 1 溶液的配制 2 5 1 1 聚乙烯醇( p v a ) 橄榄油乳化液 。 称取4 0 9 聚乙烯醇( p v a ) ，加8 0 0 m e 水，加热溶解，冷却后定容至 1 0 0 0 m l 。过滤，备用。 量取上述p v a 溶液3 0 m l ，加入橄榄油1 0 m l 漩涡混合器均匀5 r a i n ， 得乳化液备用。用时再均匀5 m i n 。 2 5 1 20 0 2 5 m o l l p h 7 5 磷酸缓冲溶液的制备 甲液：称取化学纯k h 2 p 0 4 1 7 0 1 9 ，加蒸馏水溶解定容至5 0 0 m l 。 乙液：称取化学纯n a 2 h p 0 4 4 7 7 9 ，加蒸馏水再定溶至5 0 0 m l 。 吸取甲液1 3 m l 加乙液1 0 0 m l ，即成p h 7 5 ，o 0 2 5 m o l l 磷酸缓冲溶 液以酸度计调整p h 。 2 5 1 30 0 5 m o l l 氢氧化钠溶液的制备 n a o h 溶液：称取分析纯的氢氧化钠4 5 9 ，用蒸馏水溶解定容至 1 0 0 0 m l ( 约0 1 m o l l n a o h 溶液) 标定：精确称取10 5 。c 下干燥至恒重的邻苯二甲酸氢钾约0 5 9 ，置于 2 5 0 m l 三角瓶中，加5 0 m l 煮沸后冷却的蒸馏水溶解，再加入2 滴l 的 根霉酯化酶液态培养、酶学特性厦应用 酚酞指示剂，用滴定法标定n a o h 溶液，滴定终点为微红色。依照公式算 出氢氧化钠溶液标准浓度，然后再用蒸馏水稀释一倍，即为 o 0 5 m o l l n a o h 标准溶液。 n = w f vxo 2 0 4 2 ) n ：n a o h 的摩尔浓度 w - 邻苯二甲酸氢钾的质量( g ) v ：滴定消耗的n a o h 体积f m l ) 0 2 0 4 2 ：邻苯二甲酸氢钾毫克摩尔 2 5 2 酯化酶活力测定 酯化酶在一定条件下能把甘油三酯水解，释放出脂肪酸、甘油双酯、 甘油单酯及甘油，水解以标准的碱液滴定。 r c o o h + q a o h ，r c o o n a + h 2 0 取4 m l p v a 橄榄油乳化液和5 m l 00 2 5 m o l l p h 7 5 的 k h 2 p 0 4 - n a 2 h p 0 4 缓冲溶液于锥形瓶中，放入4 0 。c 水浴锅中，预热5 1 0 r a i n ，加入l m l 酶液，同时计时，反应1 5 r a i n ，样品加入1 5 m l9 5 乙 醇，滴入两滴酚酞，用o 0 5 m o l l n a o h 溶液滴定，记下体积v 1 。空白对 照时，先加入1 5 m l9 5 乙醇，再加入l m l 酶液，滴入两滴酚酞用 o 0 5 m o l l n a o h 溶液滴定，记下体积v 2 。酶活力计算公式如下： 酶活力( u m e ) = ( v l v 2 ) xo 0 5x1 0 0 0 r f t 式中：0 0 5 ：n a o h 的摩尔浓度 1 0 0 0 ：由m m o l 转换为u t o o l 的系数 1 1 ：稀释倍数 t ：反应时间，r a i n 2 5 3 总酸的测定 总酸为挥发酸和不挥发酸之和，测定原理是用氢氧化钠标准溶液滴定 根据中和反应所消耗的标准溶液的体积，计算出用酒石酸表示的酸含量。 滴定溶液在放置过程中，会吸收空气中的c 0 2 而使粉红退去，一般认 为滴定到粉红色保持半分钟不退即表示到终点。 1 4 山东农业大学硕士学位论文 总酸：竺! 兰! ：! ：! v 2 1 0 0 0 ( g l ) 式中：n 为n a o h 标准溶液的实际当量浓度；v l 为耗用n a o h 标准溶液 的体积( m l ) ；v 2 为取样的体积( m l ) ；0 0 7 5 为酒石酸的毫克当量。 2 5 4 挥发酯的测定 挥发酯的测定原理是：利用水蒸气蒸馏，将样品中挥发的酯蒸馏出， 先用氢氧化钠中和游离的酸，再加入一定量的碱使之与酯发生皂化反应， 剩余的碱再用一定过量的酸液中和，然后用氢氧化钠溶液滴定中和后剩余 的酸，以此公式计算样品中的含酯量。 挥发酯= n l ( v i - - v 2 ) - - n 2 v 3 】o 8 8 v d 式中：n l 为n a o h 标准溶液的摩尔浓度；v 1 为加入皂化用的n a o h 溶液体积( m l ) ；v 2 为滴定用n a o h 溶液的体积( m l ) ；n 2 为h c l 溶液的 实际摩尔浓度；v 3 为中和皂化用碱h c l 溶液体积( m l ) ；v 4 为取试样的体 积( m l ) ；0 0 8 8 为乙酸乙酯自辽摩尔浓度。 2 5 5 转化率的计算 反应一定时间后，取出样品i m l j j l j 入到l o r r l l 水溶液中，用o 0 2 5 m o l l 的氢氧化钠溶液滴定未反应的己酸，以1 滴o 5 ( v v ) 酚酞为指示剂。 脂肪酸减少的滴定摩尔数 转化率= 反应初始的脂肪酸滴定摩尔数 1 0 0 2 5 6 试验方法 2 5 6 1 斜面培养基制作 麸皮2 0 ，加1 0 0 m l 水煮沸1 5 r a i n ，过滤，滤液中加入1 5 蔗糖， 2 琼脂。加热全部融化后装入试管蒸汽灭菌，1 0 k g m 2 , 2 0 m i n 。灭菌完毕 根霉酯化酶液态培养、酶学特性及应用 摆好斜面自然冷却。斜面形成，将试管置于3 0 3 5 培养箱中培养7 2 h ， 如培养基表面无任何菌长出，则视为合格。 2 5 6 2 孢子悬液制作 斜面形成，在无菌条件下接入菌种。菌种接入后放入3 0 。c 培养箱中恒 温培养7 2 h ，斜面长出菌丝后即为一级种子。先将培养好的斜面菌种用生 理盐水配置成i o7 孢子m l 的孢子悬液。 2 5 6 3 发酵培养基制作 以蔗糖和蛋白胨为基本培养基。( 蔗糖含碳4 2 ；蛋白胨含氮量为 1 2 ，5 ) 其中每个2 5 0 m l 三角瓶分别添加蔗糖0 5 ，蛋白胨的量按照碳氮 比添加，加水完全融化后进行蒸汽灭菌，1 0 k g m 2 ，2 0 m i n 。灭菌完毕自 然冷却，准备接种。 蛋白胨添加量参照以下公式： m = o 5 x 4 2 x p 1 2 5 ( 式中p 为碳氮比) 。 2 5 6 4 碳氮比实验 以蔗糖和蛋白胨为发酵培养基确定产酯化酶霉菌的碳氮比。改变发酵 培养基中碳源和氮源的浓度比进行发酵培养，其中每个培养基分别添加蔗 糖0 5 9 ，蛋白胨0 5 6 9 、o 4 2 9 、0 3 0 6 9 、0 2 8 9 、0 2 2 5 9 每隔1 2 h 取发酵上 清液进行测定，观察不同碳氮比值对产酶的影响。 2 5 6 5 菌丝体酯化酶的制各 过滤收集菌丝体，用去离子水洗去发酵残留物，冰冻后在冷冻干燥 机冻干。冻干后的菌丝体研钵磨碎，4 。c 储存备用。 2 5 6 6 液态培养基优化正交试验设计 在黄豆粉为最佳氮源，考虑经济实用以麸皮为碳源，添加不同浓度 k 2 h p 0 4 进行正交试验。2 5 0 m l 三角瓶装液量为5 0 m l 在3 0 ，1 5 0 r m 的 条件下培养3 6 h ，每组三个平行，去除菌丝体取发酵上清液测定。正交试 验设计见表2 。 山东农业大学硕士学位论文 表2 液态培养基优化正交实验 t a b2o r t h o g o n a lt e s to fl i q u i dm e d i u m 2 5 6 7 选择温度、转速、装液量三个重要影响因素进行正交试验，以确定 较优液态培养条件。2 5 0 m l 三角瓶装液量为5 0 m l 在3 0 c ，15 0 r m 的条 件下，按优化后的培养基黄豆粉5 ，麸皮6 ，磷酸氢二钾0 2 ，进行 培养条件的优化，每组三个平行培养3 6 h 后去除菌丝体，取上清液测定。 实验设计见表3 。 表3 液态培养条件正交试验 t a b3o r t h o g o n a lt e s to f c o n d i t i o no f l i q u i df e r m e n t a t i o n 因素 水平 f a c t o r a b c 根霉酯化酶液态培养、酶学特性及应用 3 、结果与分析 3 1 根霉酯化酶液态培养基研究 3 1 1 碳源对根霉酯化酶产酶的影响 以根霉为实验菌种，分别以蔗糖、麸皮、可溶性淀粉、替换发酵培养 基中的碳源成分，碳氮比为5 ，培养基浓度5 ，2 5 0 m l 三角瓶装液5 0 m l ， 接种量6 m l ( 1 0 6 个h n l ) 孢子悬液即1 2 接种量，3 0 。c ，1 5 0 r m 培养，培养 至2 4 和3 6 h 时取样测定，结果见表4 。 表4 碳源对产酶的影响 t a b4e f f e c to fc a r b o ns o u r c eo ne s t e r i f y h a ge n z y m ea c t i v i t y 碳源 c a r b o ns o u r c e 酶活( u m l ) e s t e r i f y i n ge n z y m ea c t i v i t y 2 4 h3 6 h 结果表明碳源对根霉酯化酶产酶酶活影响不是太大。可以根据实际经 济节约的原则采用麸皮作为碳源。 3 1 2 氮源对根霉酯化酶产酶的影响 3 1 2 1 单一氮源对根霉酯化酶产酶的影响 以根霉为实验菌种，分别加入相应浓度的不同氮源( 黄豆粉、蛋白胨， 酵母粉，硝酸钠) ，碳源为蔗糖，碳氮比设置为5 ，培养基浓度5 ，2 5 0 m l 三角瓶装液5 0 m l ，接种量1 2 ，3 0 。c ，1 5 0 r m 培养，每隔1 2 h 测定，结 果见图1 。 山东农业大学硕士学位论文 1 2 、2 43 64 86 07 2 发酵时间( h ) 图1 单一氮源对根霉酯化酶产酶的影响 f i g 1e f f e c to f s i n g l en i t r o g e ns o u r c eo ne s t e r i f y i n ge n z y m ea c t i v i t y 从酶活大小来看，有机氮源明显优于无机氮源，以硝酸钠为氮源的在 第二次测酶活即培养2 4 h 时就达到了最高产酶量8 7 9 0 u m l 。其发酵周期 只有3 6 h 。而以黄豆粉为氮源的最高产酶量在