（分析化学专业论文）电化学分析有机磷毒剂.pdf

1 d i s s e r t a t i o nf o rm a s t e r t h e a p p l i c a t i o no fe l e c t r o c h e m i c a lm e t h o d i nt h e a n a l y s i so fo r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e c a n d i d a t e ：k a is u n s u p e r v i s o r ：p r o f y u q i n gm i a o d i s c i p l i n e ：a n a l y t i c a lc h e m i s t r y c o l l e g eo fc h e m i s t r y & l i f es c i e n c e ， z h e j i a n gk e yl a b o r a t o r yf o rr e a c t i v ec h e m i s t r yo ns o l i ds u r f a c e s ， z h e j i a n gn o r m a lu n i v e r s i t y , j i n h u a3 2 1 0 0 4 ，z h e j i a n g ， 一 - 1 ， 摘要 电化学分析有机磷毒剂 摘要 近几十年来，有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂已经被广泛应用在现代农业、工 业和医学当中。由于这些杀虫剂的高毒性以及在生物体内易积累等特点，已经引 起了越来越多的学者的关注。因此，为了保护人类的健康和生态环境，痕量农药 的快速检测和精确定量就显得非常重要，许多传统的农药检测方法如气相色谱 法、液相色谱法等已经被广泛的应用。相对于这些传统方法，以乙酰胆碱酯酶抑 制为基础的电化学检测手段作为一种灵敏、快速、方便的方法已经被广泛的应用 在有机磷农药和环境污染物的检测当中。 本论文包括三个部分，分别如下： 1 概述了有机磷农药的基本性质以及研究现状，有机磷农药传统检测方法。 介绍了建立在农药对乙酰胆碱酯酶的抑制原理基础上的电化学检测方法以及本 论文的研究目标和研究思路。 2 以胆碱酯酶的抑制为基础，提出了一种检测有机磷农药的新的检测方法。 利用两个不相溶的相即有机相溶有底物和水相溶有酶来进行测定，在两相界面上 底物被胆碱酯酶水解并且生成的产物自发的进入水溶液中引起了电化学信号的 变化。同时，在农药甲基对硫磷的抑制下，讨论了农药浓度同抑制率的关系，在 浓度范围5 0 n g m l 1 0 0 p 咖l 之间呈现良好的线性关系。 3 本部分主要讨论了水环己烷卵磷脂体系中农药对酶的抑制检测。由于底 物分子被包裹进入卵磷脂为表面活性剂的水溶液中，乳液体系的形成不仅为酶分 子和底物分子之间的接触提供了更有效的接触面积而且阻止了酶活性中心同有 机溶剂的直接接触，避免了酶活性的降低。随着农药的加入，胆碱酯酶的催化活 性被抑制，通过测定峰电流的改变可以计算不同浓度的农药倍硫磷的抑制率。农 药的检测范围在l o n g m l1 0 0 p g m l 之间。 摘要 关键词：有机磷；乙酰胆碱酯酶；农药；抑制；电化学 k “ r a l 摘要 t h ea p p l i c a t i o no fe l e c t r o c h e m i c a l m e t h o di nt h ea n a l y s i so f0 r g a n o p h o s p h o r u s p e s t i c i d e a b s t r a c t o r g a n o p h o s p h o r u sa n de a r b a m a t ep e s t i c i d e s h a v eb e e nw i d e l ya p p l i e df o r d e c a d e si nm o d e r na g r i c u l t u r e ，i n d u s t r ya n d m e d i c i n e r e c e n t l y , i n c r e a s i n ga t t e n t i o n h a sb e e ng i v e nt h e s ec o m p o u n d sd u et ot h ep r o p e r t i e so ft h e i rh i g h l yt o x i ca n dt h e a c c u m u l a t i o ni n l i v i n go r g a n i s m s s o ，t h er a p i d d e t e r m i n a t i o na n d p r e c i s e q u a n t i f i c a t i o no ft r a c el e v e lo fo pc o m p o u n da r es i g n i f i c a n tt oh u m a nh e a l t ha n d e c o l o g i c a le n v i r o n m e n t s e v e r a la n a l y t i c a lt e c h n i q u e ss u c ha sg a sc h r o m a t o g r a p h y a n dl i q u i dc h r o m a t o g r a p h ya r ep r o p o s e di no r d e rt od e t e r m i n et r a c el e v e l so ft h e s e t o x i c p e s t i c i d e s r e l a t i v e t ot h o s et r a d i t i o n a lm e t h o d ，t h ee l e c t r o c h e m i c a l d e t e r m i n a t i o na ss e n s i t i v ea n ds e l e c t i v ea n a l y t i c a lm e t h o d sb a s e do nt h ei n h i b i t i o no f a e e t y l c h o l i n e s t e r a s eh a sb e e nw i d e s p r e a da p p l i e df o rt h ed e t e c t i o no ft h et r a c el e v e lo f e n v i r o n m e n tp o l l u t a n t t h i sg r a d u a t i o nt h e s i si n c l u d et h r e es e c t i o n s ，a sf o l l o w s ： 1 t h eb a s i cp r o p e r t yo fo r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d ea n dt h ec u r r e n ts i t u a t i o n w a sd e s c r i b e d ，s e v e r a lt r a d i t i o n a ld e t e r m i n a t i o nm e t h o d ss u c ha sg a sc h r o m a t o g r a p h y a n dl i q u i dc h r o m a t o g r a p h yw e r ea l s or e p r e s e n t e d i na d d i t i o n ，t h ee l e c t r o c h e m i c a l m e t h o db a s e do i lt h ei n h i b i t i o n p r i n c i p l e o fp e s t i c i d et o t h e a c t i v i t y o f a c e t y l c h o l i n e s t e r a s ew a sc h a r a c t e r i z e d i nt h ee n d ，t h er e s e a r c ht a r g e ta n dr e s e a r c h m e n t a l i t yo ft h i st h e s i sw a sa l s oi n t r o d u c e d 2 an o v e lm e t h o df o rt h ed e t e c t i o no f p e s t i c i d e sb yi n h i b i t i o no fa c h ee x t r a c t e d f r o me a r t h w o r mh a sb e e nd e v e l o p e d t w oi m m i s c i b l ep h a s e sw h i c ht h eo r g a n i cp h a s e c o n t a i n i n gs u b s t r a t ea n dt h ea q u e o u sp h a s ec o n t a i n i n ge n z y m ea r ee m p l o y e d 。t h e s u b s t r a t ew a sh y d r o l y z e db ya c h ea tt h ei n t e r f a c eo ft w op h a s e sa n dp r o d u c t i i i 摘要 s p o n t a n e o u s l yp e n e t r a t e d i n t o a q u e o u ss o l u t i o n ，a r o u s e d t h et r a n s f o r m a t i o no f e l e c t r o c h e m i c a ls i g n a l m e a n w h i l e ，t h ec o r r e s p o n d i n gr e l a t i o no ft h ei n h i b i t i o nr a t et o t h ec o n c e n t r a t i o no fp e s t i c i d ew a sd i s p l a y e di nt h ep r e s e n c eo fp a r a t h i o n - m e t h y l a g o o dl i n e a rr e l a t i o n s h i pb e t w e e np e s t i c i d ec o n c e n t r a t i o na n di n h i b i t i o nr a t ew a s o b t a i n e di nt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g eo f5 0 n g m l 10 u g m 1 3 i nt h i s s t u d y , t h ea s s a ym e t h o do fa c h eb a s e d o nt h ef o r m a t i o no f w a t e r c y c l o h e x a n e l e c i t h i n e m u l s i o ni se v a l u a t e d f o rt h ed e t e c t i o no f o r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e sb yt h ei n h i b i t i o no fe n z y m e t h ef o r m a t i o no fe m u l s i o n n o to n l yp r o v i d em o r ee f f e c t i v ei n t e r f a c eb e t w e e ne n z y m em o l e c u l e sa n ds u b s t r a t e d u et ot h es u b s t r a t em o l e c u l e sa l ee n w r a p p e di n t ot h em i c e l l e so fl e c i t h i nt h a ta c ta s s u r f a e t a n tb u ta l s op r e v e n tt h ea c t i v i t yc e n t e ro fa c h ec o n t a c tw i t ho i lp h a s ed i r e c t l y a n dt h u sa v o i dt h ed e s t r u c t i o no fe n z y m a t i ca c t i v i t y t h ei n h i b i t i o ne f f i c i e n c yo f f e n t h i o nw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n sv e r s u sa c h ew e r ee v a l u a t e db yd e t e r m i n i n g t h er e d u c t i o no fp e a kc u r r e n td u et ot h ec a t a l y t i ca c t i v i t yo fa c h ew a sl i m i t e dw i t h t h ea d d i t i o no fp e s t i c i d e ，t h ep e s t i c i d ec o n c e n t r a t i o n si nt h er a n g ef r o mlo n g m lt o 1 0 0 t g m lc a n b em o n i t o r e db yu s i n gt h i se f f e c t i v ei n h i b i t i o nm e t h o d k e yw o r d s ：a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ；p e s t i c i d e ；i n h i b i t i o n ；e l e c t r o c h e m i s t r y ； 一 1 i 一 k 目录 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 目匀电v l 绪论1 1 1 有机磷农药概述l 1 1 i l 有机磷农药1 1 1 2 有机磷农药残留及危害1 1 1 3 有机磷农药性质2 1 1 4 有机磷农药中毒机理3 1 1 5 预防农药污染与中毒。3 1 2 有机磷农药检测方法4 1 2 1 气相色谱法4 1 2 2 高效液相色谱法4 1 2 3 色质联用法。5 1 2 4 毛细管电泳法5 1 3 酶抑制法研究5 1 3 1 乙酰胆碱酯酶概述5 1 3 2 乙酰胆碱酯酶水解过程。6 1 3 3 农药对酶的抑制原理7 1 4 基于酶抑制法的电化学检测7 1 4 1 电化学检测概述7 1 4 2 电化学检测原理8 1 4 3 电化学检测有机磷农药进展8 1 5 本论文研究目标和内容9 1 5 1 研究目标9 1 5 2 研究内容9 2 水异辛烷两相体系中电化学检测有机磷农药1 0 2 1 弓i 言l ( ) 2 2 实验部分1 l 2 2 1 实验原理1 1 2 2 2 仪器和试剂l l 2 2 3 实验方法1 2 2 3 结果和讨论1 3 2 3 1 酶浓度的影响1 3 2 3 2 水相体积的影响。1 4 2 3 - 3 底物浓度的影响。1 5 2 3 4 扫描速率的影响1 7 2 3 5 农药浓度的影响1 8 2 3 6 农药的抑制率1 9 2 4 小结1 9 3 水环己烷卵磷脂体系中电化学检测有机磷农药一2 l v 目录 3 1 引言21 3 2 实验部分2 2 3 2 1 实验原理2 2 3 2 2 仪器和试剂2 2 3 2 3 实验方法2 3 3 3 结果和讨论。2 3 3 3 1 酶催化及农药抑制原理。2 3 3 3 2 不同体系对酶催化过程的影响一2 4 3 3 3 反应时间的影响一2 6 3 3 4 不同异丙醇量的影响。2 7 3 3 5 卵磷脂浓度的影响。2 8 3 3 6 农药抑制时间的影响2 9 3 3 7 农药抑制率的测定2 9 3 4d 、结3 ( ) 4 参考文献3 2 5 j $ 【谢4 3 6 攻读硕士学位期间取得的研究成果4 4 7 浙江师范大学学位论文独创性声明4 5 p 绪论 1 1 有机磷农药概述 1 1 1 有机磷农药 1 绪论 有机磷农药是一类含有磷原子的有机酯类化合物，在体内与胆碱酯酶形 成磷酸化胆碱酯酶，使胆碱酯酶活性受抑制，而产生毒性作用的一类农药的 总称【l 】。这一类农药品种多、药效高，用途广，易分解，在人、畜体内一般 不积累，在农药中是极为重要的一类化合物【2 】。但有不少品种对人、畜的急 性毒性很强，在使用时特别要注意安全，近年来，由于高效低毒的品种发展 很快，因此一些高毒品种逐渐被取代，使有机磷农药的使用更安全有效【3 1 。 过去我国生产的有机磷农药绝大多数为杀虫剂，如常用的对硫磷、内吸磷、 马拉硫磷、乐果、敌百虫及敌敌畏等，近几年来已先后合成杀菌剂、杀鼠剂 等有机磷农药。有机磷农药多为磷酸酯类或硫代磷酸酯类，其结构式中含有 甲氧基( c h 3 0 ) 或乙氧基( c 2 h 5 0 ) 等基团，可以合成多种有机磷化合物。 自二十世纪三十年代，德国gs e h r a d e v 首先发现有机磷农药后，已经历了六十 余年的历史【4 1 。 1 1 2 有机磷农药残留及危害 有机磷农药是使用最为广泛的农作物杀虫剂，大多数的有机磷农药是手性的， 且7 0 以上的有机磷农药都属于剧毒，高毒类，多为果品蔬菜上禁止使用的，对 有机磷农药的快速检测一直是食品卫生领域的研究热点【5 】。几十年来，由于此类 农药相对而言具有药效较高、使用方便、易在自然条件下降解等特点，无论从品 种与产量都使其成为了各类农药及杀虫剂之首，并在杀菌剂、除草剂、植物生长 调节剂等其他农药领域中也涌现了不少产品。但是由于长期使用有机磷杀虫剂， 以致产生了严重的抗药性。同时，由于不少有机磷产品具有极高的毒性，从而在 绪论 有的国家被限制或禁止使用【6 】。同时，也由于近年来新的、超高效、对环境相容 性更高的新杀虫剂的问世，故有人提出在世界范围内全面禁用有机磷杀虫剂。对 此，众说纷纭，议论纷纷。但是，对于某些毒性极高、对环境影响大的有机磷杀 虫剂必须尽早予以禁止或限制使用【_ 7 1 。 农药已经是环境污染中最主要的成分之一【8 】。作为除草剂、杀真菌剂、杀虫 剂，有机磷农药具有广谱、高效、量小以及作用方式多、使用方便、半衰期短等 优点，广泛应用农业、工业、医药等领域，与此同时产生的环境问题也日益严重。 有机磷农药对人与动物的毒性作用较大，绝大多数有机磷农药是剧毒的，它们进 入机体会导致严重的疾病，这已经引起了人们的注意 9 j 【1 0 】。由于有机磷农药在 生产、运输、以及农业中滥用，引起环境污染，同时由于管理不当，有机磷农药 保存与储藏过程中与食品混合在一起或生物富集作用，人们食用含有大量有机磷 化合物的食物，导致有机磷中毒甚至死亡。有机磷化合物的危害已经得到了国际 社会的公认并为此投入了大量的人力物力。加强对有机磷农药检测方法的研究， 对保护生态环境，保障人类健康有着重要的意义【1 1 】【1 2 1 。 1 1 3 有机磷农药性质 有机磷农药大多呈油状或结晶状，工业品呈淡黄色至棕色，除敌百虫和敌 敌畏之外，大多是有蒜臭味【1 3 1 。一般不溶于水，易溶于有机溶剂如苯、丙酮、 乙醚、三氮甲烷及油类，对光、热、氧均较稳定，遇碱易分解破坏。市场上 销售的有机磷农药剂型主要有乳化剂、可湿性粉剂、颗粒剂和粉剂四大剂型， 近年来混合剂和复配剂已逐渐增多。有机磷农药可经消化道、呼吸道及完整 的皮肤和粘膜进入人体【1 4 】。职业性农药中毒主要由皮肤污染引起，吸收的有 机磷农药在体内分布于各器官，其中以肝脏含量最大，脑内含量则取决于农 药穿透血脑屏障的能力。体内的有机磷首先经过氧化和水解两种方式生物转 化；氧化使毒性增强，如对硫磷在肝脏滑面内质网的混合功能氧化酶作用下， 氧化为毒性较大的对氧磷；水解可使毒性降低，对硫磷在氧化的同时，被磷 酸酯酶水解而失去作用 1 5 - 1 6 】。其次，经氧化和水解后的代谢产物，部分再经 葡萄糖醛酸与硫酸结合反应而随尿排出：部分水解产物对硝基酚或对硝基甲 酚等直接经尿排出，而不需经结合反应【l7 1 。 2 绪论 1 1 4 有机磷农药中毒机理 有机磷农药中毒的主要机理是抑制胆碱酯酶的活性【1 8 乏0 1 。有机磷与胆碱 酯酶结合，形成磷酰化胆碱酯酶，使胆碱酯酶失去催化乙酰胆碱的水解作用， 积聚的乙酰胆碱对胆碱神经有两种作用： 1 毒蕈碱样作用：乙酰胆碱在副交感神经节后纤维支配的效应器细胞膜 上与毒蕈碱型受体结合，产生副交感神经末梢兴奋的效应，表现为心脏活动 抑制，支气管胃肠壁收缩，瞳孔括约肌和睫状肌收缩，呼吸道和消化道腺体 分泌增多。 2 烟碱样作用：乙酰胆碱在交感、副交感神经节的突触后膜和神经肌肉 接头的终极后膜上与烟碱型受体结合，引起节后神经元和骨骼肌神经终极产 生先兴奋、后抑制的效应。这种效应与烟碱相似，称烟碱样作用。 乙酰胆碱对中枢神经系统的作用，主要是破坏兴奋和抑制的平衡，引起 中枢神经调节功能紊乱，大量积聚主要表现为中枢神经系统抑制，可引起昏 迷等症状。有机磷与胆碱酯酶结合形成的磷酰化胆碱酯酶有两种形式，一种 结合不稳固，如对硫磷、内吸磷、甲拌磷等，部分可以水解复能；另一种形 式结全稳固，如三甲苯磷、敌百虫、敌敌畏、对溴磷、马拉硫磷等，使被抑 制的胆碱酯酶不能再复能，可谓胆碱酯酶老化2 1 五3 1 。胆碱酯酶不能复能，可 以引起迟发影响，如引起周围神经和脊髓长束的轴索变性，发生迟发性周围 神经病。 1 1 5 预防农药污染与中毒 我国农药中毒高发的原因主要是：生产工艺落后，保管不严、配制不当、 任意滥用、操作不善、防护不良。因此，预防的重点是： 1 改革农药生产工艺，特别是出料、包装实行自动化或半自动化； 2 严格实施农药安全使用规程 ( 1 ) 配药、拌种要有专用工具和容器，配制浓度确当，防止污染环境； ( 2 ) 喷药时遵守安全操作规程，喷药工具有专人保管和维修，防止堵塞、 渗漏； 绪论 ( 3 ) 合理使用农药。剧毒农药不得用于成熟期的食用作物及果树治虫， 食用作物或果树使用农药应严格规定使用期限，严禁滥用农药： 3 农药实行专业管理和严格保管，防止滥用： 4 加强个人防护与提高人群自我保健意识。 1 2 有机磷农药检测方法 农药残留的检测手段随着化学分析技术的不断提高和社会发展需求的变化 而发生了很大的变化。对农药残留的检测方法主要有气相色谱法、液相色谱法以 及与各种光谱联用技术等【2 4 。2 7 1 。但是，这些方法需要对样品进行萃取分离等复 杂预处理过程，需要大量的人力物力，检测时间长且仪器价格昂贵，需要专业技 术人员维护，检测成本高，不适于现场检测，不能满足种类繁多的农产品检测需 求。 1 2 1 气相色谱法 g c 是测定o p s 的常用方法，在国内外得到广泛使用【2 8 。2 9 1 。在g c 检测中， 选择合适的色谱柱、色谱条件和高灵敏度检测器对于实现o p s 残留的准确定量 至关重要。由于o p s 相对分子质量较大，挥发性较低，通常需要较高的柱温， 因此，硅酮聚合物为优选的固定相。目前用于农药残留检测的检测器主要有电子 捕获检测器( e c d ) 、微电子捕获检测器( u e c d ) 、火焰光度检测器( f p d ) 、 脉冲火焰光度检测器( p f p d ) 、氮磷检测器( ，d ) 等。 1 2 2 高效液相色谱法 高效液相色谱是目前应用最多的色谱分析方法，其整体组成类似于气相色 谱，但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。h p l c 应用非常广泛，几乎 遍及定量定性分析的各个领域。使用高效液相色谱时，液体待检测物被注入色谱 柱，通过压力在固定相中移动，由于被测物种不同物质与固定相的相互作用不同， 不同的物质顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对 这些信号来判断待测物所含有的物质。高效液相色谱作为一种重要的分析方法， 4 绪论 广泛的应用于化学和生化分析中。高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有 本质的差别，它的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相， 适于分析高沸点不易挥发、分子量大、不同极性的有机化合物。目前用于农药残 留检测最多的是紫外吸收检测器( u v ) 、两极管阵列检测器( d a d ) 和荧光检 测器( f l d ) 。但由于大多数有机磷农药本身不发荧光，经衍生化反应后又比较 繁琐，因此限制了高效液相在农药方面的广泛应用【3 仉3 2 1 。 1 2 3 色质联用法 气相或液相与质谱联用，它既具备了色谱的高分离效能优点，而且具备了质 谱准确鉴定化合物结构的特点，可同时达到定性、定量的检测目的，特别适合于 农药代谢物、降解物的检测和多残留检测等，不过此法需要贵重仪器且操作繁杂 困难，不适合于经常性的检测，一般可用来做最后的确认工作。 1 2 4 毛细管电泳法 该方法是利用毛细管及高电压( 1 5 - 3 0 k w ) 分离各种农药残留物，非常适合于 一些难于用传统色谱法分离的离子化样品的分离和分析，比h p l c 有高1 0 1 0 0 0 倍的分析能力，而且所需缓冲液具有不危害环境的特点，在短时间( 3 0 分钟) 内就 可以完成定性及定量分析【3 孓”】。 一一一l 1 3 酶抑制法研究 1 3 1 乙酰胆碱酯酶概述 胆碱酯酶( c h o l i n e s t e r a s e ) 是一类糖蛋白，以多种同功酶形式存在于体内。 一般可分为真性胆碱酯酶和假性胆碱脂酶。真性胆碱酯酶也称乙酰胆碱酯酶， 主要存在于胆碱能神经末梢突触问隙，特别是运动神经终板突触后膜的皱摺 中聚集较多，也存在于胆碱能神经元内和红细胞中【3 6 。3 9 1 。此酶对于生理浓度 的乙酰胆碱作用最强，特异性也较高。假性胆碱酯酶广泛存在于神经胶质细 胞、血浆、肝、肾、肠中。对乙酰胆碱的特异性较低，假性胆碱酯酶可水解 绪论 他胆碱酯类，如琥珀胆碱。胆碱酯酶蛋白分子表面的活性中心有两个能与 酰胆碱结合的部位，即带负电荷的阴离子部位和酯解部位。酯解部位含有 个由丝氨酸的羟基构成的酸性作用点和一个由组氨酸咪唑环构成的碱性作 点，两者通过氢键结合，增强了丝氨酸羟基的亲核活性，使之易于与乙酰 碱结合。 乙酰胆碱酯酶的首次结构研究是在放电鱼类中发现的，如电鳐。这种鱼有大 量类似神经的结构存在于发电器官中，因此乙酰胆碱酯酶也是特别丰富的。它通 常带有附着在多肽链上的脂类，由多肽链将其锚定在细胞膜上。然而，脂质从晶 体结构除去后，会发生结晶。活性中心处在一个深沟中，其大小正好可使乙酰胆 碱掉入其中。在沟的基部是一组由丝氨酸组氨酸谷氨酸组成的三氨基酸序列， 这非常类似于丝氨酸蛋白酶类中的一段序列，如胰蛋白酶和糜蛋白酶。 1 3 2 乙酰胆碱酯酶水解过程 胆碱酯酶水解乙酰胆碱的过程可分为三个步骤：乙酰胆碱分子结构中 带正电荷的季铵阳离子头，以静电引力与胆碱酯酶的阴离子部位相结合；同 时乙酰胆碱分子中的羰基碳与胆碱酯酶酯解部位丝氨酸的羟基以共价键形式 结合，形成乙酰胆碱和胆碱酯酶的复合物。乙酰胆碱与胆碱酯酶复合物裂 解成胆碱和乙酰化胆碱酯酶。乙酰化胆碱酯酶迅速水解，分离出乙酸，酶 的活性恢复。神经细胞之间的相互通讯和神经细胞与肌肉细胞的相互通讯由神 经递质参与实现。这些小分子从神经细胞释放并迅速扩散至相邻细胞。它们一旦 到达相邻细胞就刺激其产生应答。不同的神经递质有不同的职能：谷氨酸酯使神 经细胞激动；氨基丁酸( g a b a ) 抑制信号传递；多巴胺和5 羟色胺涉及有关思考 和认知方面的微讯号传递【4 3 1 。神经递质乙酰胆碱的主要职能是从神经细胞携 带信号到肌肉细胞。当某运动神经元从神经系统得到适当的信号时，它便释放乙 酰胆碱进入附有肌肉细胞的突触。那里，乙酰胆碱打开肌细胞内的受体，触发收 缩过程。当然，一旦信号通过后，神经递质必须要被破坏，否则之后的信号会与 先前的神经递质分子混杂，乙酰胆碱的清除由乙酰胆碱酯酶负责。 6 绪论 1 3 3 农药对酶的抑制原理 在正常生理情况下乙酰胆碱完成传导作用以后即被体内的胆碱酯酶分解成 为胆碱和乙酸，反应式如下： h o ( c h 3 ) 3 n c h 2 c h 2 0 0 c c h 3 + h 囝；马h o 岭h 史s n c h2 c h2 0 h + c h 3 c o o h 有机磷与氨基甲酸酯农药共为神经系统乙酰胆碱酯酶抑制物，因此可以利用农药 靶标酶一乙酰胆碱酯酶( a c l l e ) 受抑制的程度来检测有机磷和氨基甲酸酯类农药。 由于o p s 与酶的作用速率高于天然底物，因此o p s 是a c h e 的有效抑制剂，抑 制机制属竞争性抑制4 4 4 7 1 。有机磷、氨基甲酸酯类农药进入机体以后与胆碱酯 酶结合形成了不易水解的磷酰化胆碱酯酶，丧失了水解乙酰胆碱的活力，使得乙 酰胆碱在神经突触处滞留，神经功能扰乱，机体受到严重的损害。如果大多数胆 碱酯酶都转变为相当稳定难以水解的磷酰化胆碱酯酶，乙酰胆碱就在体内大量蓄 积产生迟发性神经毒性，使中枢神经、交感神经、运动神经和一些腺体首先兴奋 而活动增强，引起运动失调等，最后转入抑制和衰竭、瘫痪甚至中毒死亡。 1 4 基于酶抑制法的电化学检测 1 4 1 电化学检测概述 与色谱、光谱等仪器分析法相比，电化学检测方法可直接得到电信号，且具 有设计简单、成本低、易于微型化和多元化等优点，并有多种电化学研究方法可 供选择，非常适合于自动控制和在线灵敏、快速分析。其中，伏安检测法具有极 高的灵敏度，并且该法对于检测样品具有一定的选择性【4 弘5 0 】。因此，伏安检测 法多年来已被广泛应用于环境科学、生物医学、药物学以及食品科学等领域，并 已经成为分析科学中最具活力、最有发展前景的研究领域之一。但是，有机磷农 药的直接电化学检测并没有得到足够的重视，直到最近几年，电化学检测尤其是 伏安检测法才逐渐成为有机磷农药残留检测方法研究的热点。该方法检测时，蔬 菜中的水分、碳水化合物、蛋白质、脂等物质不会对农药残留物的检测造成干扰， 节省了大量预处理时间，从而能达到快速检测的目的，因此该方法具有快速方便、 前处理简单、无需仪器或仪器相对简单，适用于现场的定性和半定量测定。但该 7 绪论 方法只能用于测定有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂，其灵敏度和所使用的酶、显色 反应时间和温度密切相关，经酶法检测出阳性后，需用标准仪器检验方法进一步 检测，以鉴定残留农药品种及准确残留量。 1 4 2 电化学检测原理 有机磷农药残留检测中最常用的是电化学酶传感器。固定化酶和电极结合在 一起，既具有对底物高度选择性的优点，又具有电化学电极的高灵敏度。一般通 过共价键结合方式使胆碱酯酶固定化至电极表面并经稳定化处理，选择相应的胆 碱作为底物。将电极插入溶液中，底物被酶催化发生水解反应，水解产物在电极 表面氧化，产生或消耗一种可被测定的电活性物质( 可氧化或可还原物质) ，并产 生相应的电化学信号。有机磷或氨基甲酸酯类农药抑制胆碱酯酶的活性，从而导 致电化学信号发生变化。根据电化学信号的变化程度可以计算有机磷农药对酶的 抑制程度，从而完成检测过程。由于此类传感器具有测定方法多样化、检测时间 短、灵敏度高等优点，已越来越广泛地用于有机磷或氨基甲酸酯类农药的检测 5 1 - 5 4 】。但用于农药检测的酶源相对匮乏，此外酶修饰电极的寿命一般较短，且 其稳定性受环境条件影响较大，这些不利因素成为酶电极推广的瓶颈所在【5 5 弱】。 1 4 3 电化学检测有机磷农药进展 宫景明等发展了建立在有机磷对乙酰胆碱酯酶的抑制基础上的金纳米颗粒 聚吡咯纳米线修饰玻碳电极的生物传感器检测方法，甲基对硫磷的检测范围为 5 n g m l - 1 2 0 n g m l ，检测限2 n g m l t 5 9 1 。杜丹等研究了碲化镉量子点修饰半胱氨酸 金电极对于农药西维因的检测，研究表明该修饰电极放大了电极检测信号，增大 了电极固定酶的有效表面积，检测范围l 5 0 0 n g m l ，检测限0 6 n g m l ，完善了电 化学检测方法唧1 。h a n a n ez e j l i 等制备了将乙酰胆碱酯酶固定在碳糊电极的安培 型电流传感器，用于检测有机磷农药并取得了良好的效果【6 1 1 。j o nr k i r c h h o f f 等用电沉积法制备了纳米金颗粒修饰的乙酰胆碱酯酶金电极，通过原子力显微镜 观测到纳米金增强了酶同电极之间的静电吸附作用，修饰电极被用来检测硫代乙 酰胆碱的水解过程并取得良好效果，他们认为该方法为新型传感器的制备提供了 绪论 新思路【6 2 1 。y u c h cl i n 等发展了碳纳米管修饰玻碳电极的方法用以提高硫代胆碱 电化学测量敏感度，并分别在修饰电极、玻碳电极、碳糊电极以及金电极上进行 循环伏安法和安培电流法的检测，修饰电极的检测限达到5 x l o 6 m o v l 6 3 1 。 1 5 本论文研究目标和内容 1 5 1 研究目标 本既韶酣目的目标舀j 于通过对胆碱酯酶活性抑制程度的研究，进行有机磷农药的 检测鉴定，促使建立乙酰胆碱酯酶的高效检测方法，提高有机磷农药残留物检测 灵敏度和检测限，从而建立有机磷对环境生物影响的早期评价，同时也实现禽畜 产品安全的过程监控。 1 5 2 研究内容 1 基于在水异辛烷两相体系中研究胆碱酯酶对特定底物靛酚乙酸酯的水 解过程，并在此基础上加入农药抑制酶的活性后进一步研究体系中电化学信号的 变化过程，根据农药对酶的抑制程度的不同，计算农药在此体系中的抑制率。 2 基于在水环己烷卵磷脂乳液体系中研究胆碱酯酶对特定底物靛酚乙酸 酯的水解过程，主要研究卵磷脂对酶的活性的影响，寻求合适的比例，以期提高 酶的活性，并在此基础上进一步研究有机磷农药的加入对该体系中乙酰胆碱酯酶 的活性抑制情况。 9 水异辛烷两相体系中电化学检测有机磷农药 2 水异辛烷两相体系中电化学检测有机磷农药 1 引言 甲基对硫磷俗称甲基1 6 0 5 ，学名o ，o 二甲基o ( 4 一硝基苯基) 硫代磷酸酯， 一种有机磷杀虫剂。工业产品为带蒜臭的黄棕色油状液体，纯品为白色结晶，熔 点3 6 - 3 6 5 。c ，难溶于水，易溶于有机溶剂，加热会异构化，高温或遇碱易分解。 甲基对硫磷是一种高效、高毒、低残留广谱有机磷杀虫剂，是生产上应用较多的 杀虫剂之一。该农药具有很强的触杀、熏杀和胃毒作用，在有机磷中毒的早期主 要表现为迟发性神经中毒。目前农药的大量使用，对环境、食品造成的污染已引 起社会各界的重视1 6 4 6 6 1 。 近年来由于农药的滥用或使用不当，农药严重污染环境且影响人类的身体健 康。为了提高人们生活质量，对安全、无污染的农产品的要求日趋强烈。气相色 谱法、高效液相色谱法等传统的有机磷农药检测方法，由于存在着仪器价格昂贵， 预处理过程繁琐、耗时、成本高等缺陷，因此一种快速、可靠、灵敏和实用的有 机磷农药监测手段的出现对于环境保护和食品安全等具有重要的现实意义。电化 学有机磷农药检测技术具有灵敏、快速、方便等优点，近年来已受到广泛的关注， 基于a c h e 的电化学生物传感器是最具有代表性的研究，已经在农药残留的检测 中得到良好的应用【6 7 神】。但是，传统的胆碱酯酶的催化底物硫代乙酰胆碱存在 着氧化电位过高的缺陷，因此本章中选用具有良好电活性的底物靛酚乙酸酯作为 催化底物。 关于有机磷农药对乙酰胆碱酯酶活性抑制研究的报道多在水溶液中进行，但 在水有机溶剂两相体系中的报道并不多见，因此我们着重研究了在两相体系中 胆碱酯酶的电化学活性，由于甲基对硫磷具有易溶于有机溶剂的良好特性，可以 直接溶解在异辛烷中，因此在本章中选用为酶抑制剂。 l o 水异辛烷两相体系中电化学检测有机磷农药 2 2 实验部分 2 2 1 实验原理 在乙酰胆碱酯酶的存在下，底物靛酚乙酸酯被水解成溶于水的靛酚和乙酸， 并且底物靛酚乙酸酯及其产物靛酚都具有良好的电化学活性，其电化学信号可以 通过循环伏安法和方波伏安法获得。 i n d o p h e n o la c e t a t e + h 2 0 骂i n d o p h e n o l 4 - a c e t i ca c i d 当在体系中加入溶解在异辛烷中的农药甲基对硫磷后，由于农药对酶的抑制作 用，导致了底物靛酚乙酸酯的水解速度变慢，电化学响应信号同时发生改变【7 们。 而电化学信号的改变同农药的浓度有一定的关系，根据信号改变的程度计算农药 对酶的活性抑制程度以及农药浓度。 2 2 2 仪器和试剂 1 实验仪器 ( 1 ) c h l 8 4 2 电化学仪( 上海辰华仪器公司) ( 2 ) h 9 7 控温磁力搅拌器( 上海梅颖浦仪器有限公司)；， ( 3 ) y p l 5 k 电子天平( 上海光学仪器厂) ( 4 ) p h 0 3 0 a 型干燥箱( 上海一恒科技有限公司) ( 5 ) t o m o s 高速离心机( 上海托莫斯科学仪器有限公司) 2 主要试剂 农药甲基对硫磷( s i g m a ) ，底物靛酚乙酸酯( s i g m a ) ，乙酰胆碱酯酶( s i g m a ) ， 牛血清白蛋白( 上海蓝季有限公司) ，异辛烷( 阿拉丁试剂) ，其他所用试剂均为 分析试剂，实验用水均为二次超纯水。农药甲基对硫磷溶解在异辛烷中制备成不 同浓度的储备溶液，同时称取不同质量的底物靛酚乙酸酯试剂溶解在异辛烷中配 成不同浓度的底物溶液储存于冰箱待用。 水异辛烷两