直接抗人球蛋白试验操作规程.doc

XXX医院直接抗人球蛋白试验操作规程1.目的 保证试验结果的准确性，确保临床输血安全。2.适用范围 XXX医院输血科。3.职责 输血科具有专业技术的工作人员负责本院患者直接抗人球蛋白检测，但只对该单份标本负责。4.相关文件 试剂采购、保存和使用管理程序 设备采购、使用管理程序 消毒与清洁管理程序 标本采集、运输、保存和报废管理程序5.相关记录 仪器设备的采购、使用和维护记录 仪器的温度记录 恒温水温箱的换水和消毒记录 消毒液的配置记录 清洁消毒记录 试剂采购、使用记录 标本交接和报废记录6.实验原理 抗球蛋白试验（Coombs试验）是测定结合在红细胞上的抗体和/或补体的主要方法。直接Coombs试验是检测体内已被抗体和/或补体致敏的红细胞。间接Coombs试验时通过血清与细胞的孵育，证实抗体和/或补体在体外的结合。 抗体分子和补体成分都是球蛋白。用人球蛋白免疫动物使其产生抗体即抗人球蛋白。抗人球蛋白试剂可凝集被人球蛋白致敏的红细胞。抗人球蛋白试剂可以和致敏在红细胞上的人球蛋白反应，通过桥梁作用使致敏红细胞出现凝集，呈现阳性反应。7.仪器设备玻璃试管(75X12mm)、玻片、记号笔、一次性塑料滴管、显微镜、交叉配血专用离心机、试管架、恒温水温箱、试剂保存冰箱、标本保存冰箱。8.试剂生理盐水、抗D(IgG)试剂(效价1:8)，直接抗人球蛋白试剂(抗IgG,C3d)，均为有合格证件的正品。9.试剂保存和性能指标9.1.保存：直接抗人球蛋白试剂（抗IgG,C3d）应置于28冷藏保存，切勿反复冻融。储存条件下有效期为24个月。9.2.性能指标：直接抗人球蛋白试剂（抗IgG,C3d）为多特异性试剂。外观：应澄清透明，无杂质；灵敏度试验：分别与强抗体抗D(IgG)，中等强度抗体(抗Jka)和弱抗体(抗Fya)致敏细胞反应，结果均为阳性。效价：与IgG(抗D)致敏细胞凝集效价1:4；与C3致敏细胞凝集效价1:1。特异性试验：阴性对照试验与加入AB血浆的Rh(D)阳性细胞反应，结果为阴性；阳性对照试验与抗D(IgG)致敏细胞反应，结果为阳性。10.标本收集和处理应使用EDTA抗凝标本，可反映体内红细胞被补体致敏的真实情况。若怀疑冷抗体引起的直接抗球蛋白试验阳性，其血液标本凝固应保持在37，直到血清被分离出来为止。11.实验方法与步骤用生理盐水制备受检者3%红细胞悬液备用。将1滴受检者3%红细胞悬液加入干净的试管中，用生理盐水洗涤3次3400转/分钟（1000g），每次离心1分钟，离心后将上清液全部倒出。加入2滴抗IgG,C3d，以3400转/分钟（1000g）离心15秒。将取出的试管持一定角度并轻轻摇动直至松动所有的细胞，然后反复倾斜试管，直至呈现均匀的细胞悬液（阴性）或凝集物（阳性）为止。用肉眼或借助光学显微镜观察凝集情况，并按凝集程度进行初步判读结果并记录。若初步判读结果为阴性，则在室温中放置510分钟，再离心一次，重新判读结果并记录。阳性对照试验（IgG抗D致敏细胞）：将1滴阳性对照细胞加入干净的试管中；再加入2滴直接抗人球蛋白试剂（抗IgG,C3d）；以3400转/分钟（1000g）离心15秒；将取出的试管持一定角度并轻轻摇动直至松动所有的细胞，然后反复倾斜试管，直至呈现均匀的细胞悬液（阴性）或凝集物（阳性）为止；再进行初步结果判读。对初判为阴性结果的，再在试管中加入1滴阳性对照细胞，进行再离心、再悬浮和再判读结果。如果在制备阳性对照细胞悬液时，能充分去除所有未结合的球蛋白，则此步对照试验结果为阳性。（此步对照很关键，它是检测细胞是否洗涤充分的唯一方法。）阳性对照细胞（IgG抗D致敏细胞）制备：取1份市售抗D（IgG）试剂（效价1:8），加入1份Rh(D)阳性O型红细胞，混匀后置37水浴30分钟，再用生理盐水洗涤3次3400转/分钟（1000g），每次离心1分钟，离心后将上清液全部倒出，最后配成3%红细胞悬液备用。12.结果判断出现红细胞凝集为阳性反应，表示红细胞上有相应抗体存在；红细胞不凝集为阴性反应，表示红细胞上没有相应抗体存在。13.质量控制与注意事项红细胞洗涤不充分，微量残留的未结合的球蛋白将中和抗人球蛋白试剂，影响试验结果的准确性。直接抗人球蛋白试验的试管在初读结果之后，应再放在室温中510分钟，这样孵育后，对C3d或IgA致敏红细胞有增强作用，重新离心后观察结果可使初判的阴性结果转变为阳性结果；而IgG致敏的红细胞在孵育后反应可能会更弱。试剂中含有0.1%W/V叠氮钠，若摄入人体会引起中毒。直接抗人球蛋白试剂（抗IgG,C3d）为体外诊断试剂。抗IgG可用于抗体筛选和相容性试验中，但其有一定的局限性，使用抗IgG测定抗体偶尔会失败，可依靠含有抗C3成分的多价抗球蛋白试剂测定，没有被IgG测得的