（生物化学与分子生物学专业论文）植物异三聚体g蛋白在脱落酸以及一氧化氮调控气孔运动中的功能研究.pdf

吴亚兵； 植物异三聚体g 蛋白在脱落酸以及一氧化氮调控气孔运动中的功能研究 兰 符号说明 a b b r e v i a t i o n s 英文缩写英文全称中文名称 a b a a b s c i s i ca c i d脱落酸 a c a d e n y l y lc y c l a s e 腺苷酸环化酶 a g b l a r a b i d o p s i sgp r o t e i nps u b u n i拟南芥g 蛋白p 亚基 a g b l j m u t a n to f g p r o t e i nps u b u n i tg 蛋白p 亚基突变体 a p x a s c o r b a t ep e r o x i d a s e抗坏血酸过氧化物酶 c a mc a l m o d u l i n钙调素 c a tc a t a l a s e过氧化氢酶 c t xc h o l e r a t o x i n霍乱毒素 g p r o t e i n g t p b i n d i n gp r o t e i n g t p 结合蛋白( g 蛋白) g c r lg p r o t e i nc o u p l e dr e c e p t o r g 蛋白耦连受体 g c r l 一5 m u t a n t o f g p r o t e i n c o u p l e dr e c e p t o rg 蛋白耦连受体突变体 g i i n h i b i t o r ygp r o t e i n抑制性g 蛋白 g p a l a r a b i d o p s i sgp r o t e i nas u b u n i t拟南芥g 蛋白a 亚基 g p a l 一4 m u t a n to f o p r o t e i na s u b u n i tg 蛋白o r , 亚基突变体 g s s t i m u l a t e l ygp r o t e i n激活性g 蛋白 h 2 0 2h y d r o g e np e r o x i d e过氧化氢 h b h e m o g l o b i n 血红蛋白 i p 3 i n o s i t o l1 , 4 ，5t r i s p h o s p h a t e 1 , 4 ，5 三磷酸肌醇 m a p k m i t o g e na c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e 分裂原激活的蛋白激酶 n a d p h r e d u c e dn i c o t i n a m i d e a d e n i n e还原型辅酶i i n o n i t r i co x i d e一氧化氮 n o s n i t r i co x i d es y n t h a s e一氧化氮合酶 n r n i r n i t r a t e n i t r i t er e d u c t a s e 硝酸还原酶亚硝酸还原酶 6 扬州大学硕士学位论文 p a p e g 6 0 0 0 p l c p l d p t x r a c k l r a c k l a r g s l r g s l 一2 s n p a f t 3 6 p h o s p h a t i d i ca c i d p o l y e t h y l e n eg l y c o l6 0 0 0 p h o s p h o l i p a s ec p h o s p h o l i p a s ed p e r t u s s i st o x i n r e c e p t o r a c t i v a t e dck i n a s e1 a t r a c k lm u t a n t r e g u l a t i o no f g p r o t e i ns i g n a l i n g m u t a n to fg p r o t e i nr e g u l a t o r s o d i u m n i t r o p r u s s i d e d o u b l em u t a n to fg p r o t e i n 、bs u b u n i t 磷酯酸 聚乙二醇6 0 0 0 磷酯酶c 磷酯酶d 百日咳毒素 活化c 激酶1 受体 a t r a c k l 突变体 g 蛋白转导调节因子 g 蛋白转导调节因子突变体 硝普钠 g 蛋白a 、b 亚基双突变体 吴亚兵：植物异三聚体g 蛋白在脱落酸以及一氧化氪调控气孔运动中的功能研究 植物异三聚体g 蛋白在脱落酸以及一氧化氮调控气孑l 运动中的功能研究 摘要 脱落酸( a b a ) 是植物体内具有广泛生理作用的一种植物激素，其最重要的生理 功能之一为调控气孔运动，表现为诱导气孔关闭以及抑制气孔开张。一氧化氮( n 0 1 是植物体内一种重要的信号分子，参与了植物多种生理过程。最近研究证明n o 是 保卫细胞信号转导的新成员。植物异三聚体g 蛋白介导的细胞信号转导是植物细胞 信号转导机制中最为保守的信号转导机制之一。大量的实验结论已经阐明了a b a 调节气孔关闭机制，同时证实部分g 蛋白信号组分蛋白以及n 0 参与了a b a 调控气 孔运动过程，但关于其他g 蛋白信号组分蛋自在a b a 信号转导途径中的功能却知之 较少，且g 蛋白在保卫细胞n o 信号转导途径中的功能还未见报道。 本文以拟南芥野生型c o l 以及a t g p a l 、a t a g b l 、a t g p a l a t a g b l 、a t r g s l 、 a t g c r l 、a t r a c k l 蛋白缺失突变v 4 c g p a l 一4 、a g b l 一2 、棚民r g s l - 2 、g c r l 5 、r a c k l 为研究材料，利用表皮条生物分析和荧光显微技术探讨了g 蛋白参与保卫细胞n o 和a b a 信号转导中的功能，主要研究结果总结如下： 1 ) 野生型拟南芥表皮经3 0 1 m a o l l a b a 处理后气孔关闭，证明外源a b a 诱 导了野生型拟南芥气孔关闭。在此过程中，g p a l 4 对a b a 不敏感，说明a t g p a l 介导了a b a 对气孔关闭的诱导作用；r g s l - 2 、g c r l 一5 对a b a 敏感，我们推测 a t r g s l 和a t g c r l 蛋白在a t g p a l 介导的a b a 诱导拟南芥气孔关闭信号转导途 径中起负调控功能；a g b l - 2 、r a c k l 对a b a 敏感，结合本实验室前人的研究结果 推测g b 亚基、a r r a c k l 蛋自在触发a b a 合成过程中可能起到负调控作用。 2 ) 外源a b a 可以抑制野生型拟南芥气孔开张运动。在此过程中，g p a l 4 、 a g b l - 2 对a b a 敏感，a f t 3 6 双突变体对a b a 不敏感，说明a t g p a l 和a t a g b l 共同介导了该过程，且二者可能是a b a 下游两个平行信号转导途径中的组分； r g s l - 2 、g c r l 一5 对a b a 敏感，我们推测a t g c r l 和a t r g s l 蛋白在a t g p a l 介导 的a b a 抑制拟南芥气孔开张过程中起负调控作用。r a c k l 能够响应a b a ，再次证 2 扬州大学硕士学位论文 明a t r a c k l 蛋白在触发a b a 合成过程中可能起负调控作用。 3 ) 野生型拟南芥表皮经5 0 l x m o l ls n p ( n o 供体) 处理后气孔关闭，说明外源 n o 可以诱导野生型拟南芥气孔关闭。在此过程中，g p a l 一4 对n o 敏感，推测 a t g p a l 蛋白可能位于n o 上游；r g s l 2 、g c r l 5 对n o 不敏感，据此推测a t g c r l 和a t r g s l 蛋白参与了n o 诱导气孔关闭过程，并可能起着正调控作用；a g b l - 2 、 r a c k l 对n o 敏感，推测a t a g b l 和a r r a c k l 蛋白在n o 诱导气孔关闭过程中可 能发挥负调控作用。 4 ) 外源n o 抑制了野生型拟南芥气孔开张运动，对所有突变体亦产生相同的 效应，说明g 蛋白没有参与n o 抑制气孔开张过程，或者是在该过程中起着负调 控作用。 5 ) a b a 、n o 促进气孔关闭和抑制气孔开张均是由不同的机制或程序所控制 的，而不是简单的互逆过程，并且其中的信号转导组分也不完全相同。 6 ) g p a l 、a g b l 蛋白参与了a b a 诱导的拟南芥保卫细胞n o 合成过程。其 中，r g s l 可能起正调控功能，g c r l 、r a c k l 可能发挥负调控作用。 关键词：拟南芥，一氧化氮，异三聚体g 蛋白，气孔运动，脱落酸，信号转导 吴亚兵：植物异三聚体g 蛋白在脱落酸以及一氧化氮调控气孔运动中的功能研究 3 t h ef u n c t i o n so fh e t e r o t r i m e r i cg - - p r o t e i ni na b a - a n d n o m e d i a t e ds t o m a t a lm o v e m e n t a b s t r a c t a b s c i s i ca c i dc a j 3 a ) ，ap h y t o h o r m o n et h a th a sc o m p r e h e n s i v e b i o l o g i c a lf u n c t i o n , r e g u l a t e ss t o m a t a lm o v e m e n ti n a r a b i d o p s i st h a l i a n a a b ac a ni n h i b i tt h es t o m a t a l o p e n i n g ，a d d i t i o n a l l yi n d u c es t o m a t ac l o s u r e n i t r i co x i d e ( n o ) i sak e ys i g n a l i n g m o l e c u l a ri np l a n t si n v o l v e di nv a r i o u sb i o l o g i c a lp a t h w a y s n oh a s b e e nr e p o r w aa sa n e wm e m b e ro f s i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a yi ng u a r dc e l lr e c e n t l y p l a n th e t e r o t r i m e r i c g - p r o t e i ns i g n a li so n eo f t h ec o n s e r v a t i v es i g n a l si np l a n t sc e l l r e c e n t l y , t h e r ea r e a l a r g en u m b e ro f r e p o r t sa b o u tm e c h a n i s mo f a b a i n d u c e ds t o m a t a lc l o s u r e ，m o r e o v e r i th a se s t a b l i s h e dt h a tn oa n ds o m ec o m p o n e n t so f h e t e r o t r i m e r i cg - p r o t e i ns i g n a l i n g m e & a t ei nt h ea b a r e g u l a t e ds t o m a t a lm o v e m e n t b u tt h e r ei sl i t t l ei n f o r m a t i o n a v a i l a b l ea b o u tt h ef u n c t i o n so f o t h e rc o m p o n e n t so f h e t e r o t r i m e d cg p r o t e i ns i g n a l i n g i na b as i pt r a n s d u c t i o np a t h w a y , f u r t h e r m o r et h e r ei sn or e p o r tc o n c e r n i n gt h e f u n c t i o no f g p r o t e i ni ng u a r dc e l ln os i g n a l i nt h i ss t u d y , b yu s i n ga r a b i d o p s i sn u l lm u t a n t so f g p a l 一4 、a g b l 一2 、a f t 3 6 、r g s i 一2 、 g c r l - 5a n d a t r a c k la b s e n to f t h ea t g p a l 、a t a g b l 、a t g p a l a t a g b l 、a t r g s l 、 a t g c r l 、a r r a c k lr e s p e c t i v e l ya n dt h e i rw i l dt y p e ，t o g e t h e rw i t he p i d e r m a ls t r i p b i o a s s a ya n df l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y , w ed i s c u s s e dt h ef u n c t i o no ft h ec o m p o n e n t so f h e t e r o t r i m e r i cg p r o t e i ns i g n a l i n gm e d i t e di na b aa n dn o s i g n a l i n gi ng u a r dc e l l t h e m a j o rr e s u l t sa r es h o w e da sf o l l o w i n g s ： 1 ) e n o g e n o u sa b ai n d u c e ss t o m a t a lc l o s u r ei na r a b i d o p s i sw i l dt y p e ，a n dt h i s p r o c e s si sm e d i a t e db ya t g p a l a t r g s la n da t g c r lm a y a c t 髂an e g a t i v er e g u l a t o r i ng p a l 一m e d i a t e ds t o m a t a lc l o s u r ep r o c e s sp r o m o t e db ya b a a g b la n da t r a c k l a r ed i s p e n s a b l ec o m p o n e n t si nt h i sp r o c e s sa n dm a y b eh a v en e g a t i v ef u n c t i o ni na b a s y n t h e s i s 4 扬州大学硕士学位论文 2 ) i na r a b i d o p s i sw i l dt y p e ，e n o g e n o u sa b a c a ni n h i b i t es t o m a t a lo p e n i n g ，a n d t h i sp r o c e s si sm e d i a t e db ya t g p a la n da t a g b l ，f o r t h m o r em e y m a y b ei n v o l v e di n t w op a r a l l e lp a t h w a y si na b as i g n a l a t r g s la n da t g c r lm a ya c ta san e g a t i v e r e g u l a t o ro f g p a l 一m e d i a t e ds t o m a t a lo p e n i n gp r o c e s si n h i b i t e db ya b a a t r a c k li s ad i s p e n s a b l ec o m p o n e n ti nt h i sp r o c e s sa n dm a y b eh a v en e g a t i v ef u n c t i o ni na b a s y n t h e s i s 3 ) e n o g e n o u sn oi n d u c e sa r a b i d o p s i sw i l dt y p es t o m a t a lc l o s u r e ，a n dt h i s p r o c e s si sm e d i a t e db ya 墩g s la n da t g c r im a y b ei n t e r a c tw i t ha t g p a la n de x e r t p o s i t i v ef u n c t i o n a t g p a li sd i s p e n s a b l ea n dm a y a c tu p s t r e a mo f n oi nt h i sp r o c e s s a g b la n da t r a c k la r ed i s p e n s a b l ec o m p o n e n t si nt h i sp r o c e s sa n dm a y b eh a v ea n e g a t i v ef u n c t i o n 4 、w ei d e n t i f yt h a te n o g e n o u sn oi n h i b i t e ss t o m a t a lo p e n i n gi na r a b i d o p s 妇w i l d t y p e c o m p o n e n t so f h e t e r o t r i m e r i cg - p r o t e i ns i g n a l i n gd on o ti n v o l v e di nt h i sp r o c e s s ， o rm a y b ee x e r tn e g a t i v ef u n c t i o n 5 ) b o t ht h ea b aa n dt h en oe f f e c t so ns t o m a t a lc l o s u r ea n do p e n i n ga r e g e n e t i c a l l yi n d e p e n d e n t l y , t h e ym a yb ec o n t r o l l e db yd i f f e r e n tm e c h a n i s ma n d p r o c e d u r e 6 ) i na r a b i d o p s i sg u a r dc e l l s ，g a p lm e d i a t e sa b ai n d u c t i o no nn os y n t h e s i s ， a n da g b li sp a r t l yi n v o l v e di nt h i sp r o c e s s r g s lm a ye x e r tp o s i t i v ef u n c t i o na n d g c r l 、r a c k lm a yh a v en e g a t i v ef u n c t i o ni nt h ec o u r s e k e yw o r d s ：a r a b i d o p s i st h a l i a n a ，n o ，g p r o t e i n , s t o m a t a lm o v e m e n t ，a b a ，s i g n a l t r a n s d u c t i o n 吴亚兵：植物异三聚体g 蛋白在脱落酸以及一氧化氮调控气孔运动中的功能研究 7 第一章文献综述 1 植物一氧化氮( n o ) 研究进展 一氧化氮( n i t r i c o x i d e ，n o ) 是一种广泛存在于生物体内具水溶性和脂溶性及自 由基性质的气体活性分子，是继乙烯之后自然界中发现的第二种气体信号分子。 1 9 9 8 年美国三位药理学家f u r c h g o t t ，m u r a d 和i g n a r r o 因对动物细胞中n o 功能的出 色研究而共同获得诺贝尔生理与医学奖，这一研究成果被认为国际生物学及医学 界的一项令人瞩目的发现。1 9 9 2 年国际上最具权威性的科学杂志遴i 盎_ n o 为当 年的“明星分子”( k o s h l a n d ，1 9 9 2 ) 。但有关植物系统中n o 功能研究则相对滞后， 一直至u 1 9 9 6 年，有关n o 在植物体内的功能研究才引起全球植物学家的密切关注。 1 9 9 8 年，对植物体n o 研究起里程碑作用的两篇文章报道了n o 参与了植物对病原菌 的防御反应( d e l l e d o n n ee ta 1 ，1 9 9 8 ；d u r n e re ta 1 ，1 9 9 8 ) 。目前有关高等植物体内n o 研究成为当今植物科学的热点领域( d u m e ra n dk l e s s i n g ，1 9 9 9 ；k l e s s i n ge ta l ，2 0 0 0 ； g u oe ta 1 ，2 0 0 3 ；n e i l le ta 1 ，2 0 0 3 ；c o r p a se ta l ，2 0 0 4 ；b r i g h te ta 1 ，2 0 0 6 ；c r a w f o r de t a 1 ，2 0 0 6 ) 。n o 不仅在植物生命周期中通过与其他植物激素分子相互作用而对植物 生命活动起着基础性调节作用，此外，它还作为一个重要的信号分子调节植物多 种生理过程，包括种子萌发、光形态建成、根的生长发育、果实等组织的成熟及 衰老、细胞程序性死亡、气孔运动、各种胁迫反应及抗病防御反应等( d e l l e d o n n ee t a 1 ，1 9 9 8 ；d u m e re ta 1 ，1 9 9 8 ；l e s h e m ，2 0 0 1 ；g r a z i a n oe ta 1 ，2 0 0 2 ；p a g n u s s a te ta 1 ， 2 0 0 2 ；d e s i k a ne ta 1 ，2 0 0 2 ；n e i l le ta 1 ，2 0 0 2 ；g a r c i a - m a t ae ta 1 ，2 0 0 3 ；g u oe ta 1 ，2 0 0 3 ， 2 0 0 5 ；h ee ta 1 ，2 0 0 4 ；g a b a l d o ne ta 1 ，2 0 0 5 ；p r a d oe ta l ，2 0 0 4 ；h ue ta l ，2 0 0 5 ；b r i g h t n a 1 ，2 0 0 6 ；s h ee ta 1 ，2 0 0 6 ；m u n e m a s ae ta 1 ，2 0 0 7 ) 。 1 1 植物体内n o 的来源 植物体中有多种合h i , n o 的途径，各个途径的重要性主要取决于不同的种属、 细胞和组织类型、植物生长的条件以及特定条件下发挥作用的信号转导途径等等。 由图1 1 可以看到，植物体内至少存在三条合成n o 的途径，即依赖一氧化氮合酶 ( n i t r i co x i d es y n t h a s e ，n o s ) 途径、依赖硝酸还原酶或亚硝酸还原酶( n i t r a t e n i t r i t e 8 扬州大学硕士学位论文 r e d u c t a s e ，n r n i r ) 途径和非酶催化合成途径( 如图1 1 ) 。 图1 1 植物体内n o 合成的可能途径 f i g 1 1p o s s i b l ep a t h w a y so f n i t r i co x i d eb i o s y n t h e s i si np l a n t s ( w o j t a s z e k , 2 0 0 0p h y t o e h e m i s t r y5 4 ：1 4 1 1 1 1 一氧化氮合酶叫o s ) 催化的n o 合成途径 哺乳动物中，在n a d p h 作为电子供体和0 2 的参与下，n o s 催化l 一精氨酸转化 成n o 和l 一瓜氨酸。根据细胞类型，动物中n o s 可分为：神经元n o 合酶( n n o s ) 、 内皮细胞n 0 合酶( e n o s ) 和细胞因子诱导性的n o 合酶( i s o s ) ，分子量分别为1 6 0 、 1 3 3 、1 3 0 k d 。它们结构相似，在产生n o 时需要f m n 、n a d p h 、b 1 4 _ 4 和钙调素等 因子的参与。三种n o 合酶的氨基酸序列同细胞色素p 4 5 0 有相当高的同源性( b r e d t e t a 1 ，1 9 9 1 ) 。根据n o s 活性的诱导条件，它有两种同工酶类型，即组成型( c o n s t i t u t i v e n o s ，e n o s ) 和诱导型n o s ( i n d u c i b l en o s i ，i n o s ) 。e n o s 活性依赖于c a 2 + c a m ，引 起n o 短期释放，而i n o s 活性不依赖于c a 2 + c a m ，在某些细胞因子的诱导下，引起 长时间n o 释放。通常由e n o s 形成的n o 量多于i n o s ( w e n d e h e r m ee ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 自1 9 9 6 年以来越来越多的研究表明，在植物体中也存在类似于哺乳动物体中 n o s 活性的n o s 。在植物体中主要是从以下三个方面证实n o s 活性的存在： 1 1 1 1 生物化学和电子顺磁共振( e p r ) 证据 最早表明植物中可能存在类似于哺乳动物n o s 活性的证据是n i n n e m a n n 和 m a i e r ( 1 9 9 6 ) 在豆科植物m u c u n ah a s s j o o 中检测到n o s 活性。c u e t o 等( 1 9 9 6 ) 采用 从放射性标记的l 精氨酸到放射性标记的瓜氨酸的转化来表示n o s 活性，在白 吴亚兵：植物异三聚体g 蛋白在脱落酸以及一氧化氮调控气孔运动中的功能研究 9 羽扇豆的根和茎节中发现了n o s 活性。随后分别在烟草、大豆以及豌豆叶片过氧 化物酶体中都检测到了n o s 活性的存在，并且这种活性可以为动物n o s 抑制剂 n m m a ( n g - m o n o m e t h y l l a r g i n i n e ) 和l n n a ( n o ) - n i t r o l - a r g i n i n e ) 所抑制 ( d e l l e d o n n ee ta 1 ，1 9 9 8 ；d u m e re ta 1 ，1 9 9 8 ；b a r r o s oe ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 c o r p a s 等( 2 0 0 4 ) 研究发现随着过氧化物酶体蛋白浓度的增加，n o 特异的绿色 荧光强度也有所增强，说明n o 的产生水平和过氧化物酶体蛋白含量有关。将过 氧化物酶体样品与n o s 抑制剂a o ( 氨基胍碳酸盐) 预培养，或在反应体系中不加 入n o s 底物l - a r g ，或在加入荧光指示剂前对过氧化物酶体样品加热变性，与对 照相比，这三种情况下荧光强度均有6 5 到8 8 的下降。通过检测从l a r g 到瓜 氨酸的形成来表示n o s 活性，该活性和过氧化物酶体蛋白含量间存在着线性关 系，这与观察到的绿色荧光强度相一致。这种n o s 酶活性在培养后3 0 分钟不断 增加并达到顶峰( c o r p a sc ta 1 ，2 0 0 4 ) 。最近，他们以豌豆幼苗为研究系统，发现豌 豆幼苗主要生长器官( 叶、径、根尖) 中均有组成型n o s 酶活性，并且n o 主要产 生或积累于以上三个主要器官的表皮细胞以及维管组织( 木质部) 中( c o r p a sc ta 1 ， 2 0 0 6 ) 。 此外，细胞中诱导型一氧化氮合酶( i n o s ) 催化形成的n o 可被f e 2 + ( m g d ) 2 捕获， 所产生的n o f e 2 + ( m g d ) 2 可直接在e p r 检测中获得典型的三重峰信号。刘斌等 ( 2 0 0 4 ) 采用e p r 方法验证了高等植物叶绿体内光诱导电子传递可产生n 0 的设想。 c r e u s 等( 2 0 0 5 ) 运用e p r 及n o 特异荧光染料( d a f = 2 d a ) 均检测到需氧生长的巴西固 氮螺菌可以产生n o ，且绿色荧光可以被c p t i o 消除。但是n o s 抑制剂l - n a m e 或 l - n i o 、硝酸还原酶n r 抑制剂钨酸盐均不可以抑制n o 的生成，但是当培养基中加 入a r g 时，n o 的生成量增加了5 0 ，这说明在胺作为氮源及有氧条件下巴西固氮螺 菌至少可能是通过一种类n o s 活性来产生n 0 。 i i i 2 免疫学证据 用动物n o s 的抗体检测植物n o s 的研究已广泛展开，并已有报道证明植物体 中n o s 的存在( k u oe ta 1 ，1 9 9 5 ；s e na n dc h e e m a , 1 9 9 5 ；砒b e i r oc ta 1 ，1 9 9 9 ；b u t te ta 1 。 2 0 0 3 ) 。在植物中n o s 的编码基因或e d n a 序列以及与n o s 高度同源的蛋白的分离 1 0 扬州大学硕士学位论文 是研究的热点。k u o 等( 1 9 9 5 ) 用老鼠大脑n o s 抗体和w e s t e r n 印迹技术从酵母和麦芽 中分离出有关蛋白。s e n 和c h e e m ( 1 9 9 5 ) 利用野兔n o s 抗体从豌豆胚轴分离出了分 子量为1 0 5 4k d 的蛋白，从麦芽中分离出分子量为8 9 7 k d 和5 7 5k d 的蛋白。 r i b e i r o 等( 1 9 9 9 ) 用抗鼠巨噬细胞n o s ( i n o s ) 抗体和抗兔脑细胞n o s ( n n o s ) 抗体并 结合w e s t e r n 印迹技术在玉米幼苗根尖和幼叶可溶性提取物中检测到大约1 6 6 k d 的 蛋白条带，同时酶抽提液能够催h e 一【u1 4 c 】精氨酸转化成l u 一1 4 c 】瓜氨酸。b a r r o s o 等( 1 9 9 9 ) 运用c 末端含抗鼠n o s 的多克隆抗体并结合免疫印迹技术在过氧化物酶体 中检测到大约1 3 0 k d 免疫反应蛋白。但是最近的蛋白质组分析表明这样的交叉反 应蛋白和n o s 并不一定相关( b u t te ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 1 1 1 3 分子生物学证据 最近两个家族不相关的n o s 在植物体中被报道：分别是拟南芥和烟草中病原 诱导的n o s ( i n o s ) 和拟南芥中激素激活的n o s ( a t n o s l ) ( c h a n d o k e ta 1 ，2 0 0 3 ；g u o e ta 1 ，2 0 0 3 ) 。前者被确定为分子量1 2 0 k d 的甘氨酸脱羧酶复合物( g l y c i n e d e c a r b o x y l a s ec o m p l e x ，g d c ) p 蛋白的变体形式。从活性大小、辅助因子、抑制剂敏 感程度等方面来看，该i n o s 和动物i n o s 具有很多明显的相似性，但是该酶仅有很 少一段n 0 合成所必需的和动物及微生物n o s 相似的保守区。所以i n o s 可能运用独 特的化学结构或特性来产生n o 。拟南芥可以通过i n o s 产生n 0 来抵抗萝h 枯萎病 毒侵染，同样，烟草植株经过烟草花叶病毒( t m v ) 或者真菌诱导子隐地蛋白处理后 也可以通过i n o s 产生n 0 ( l 锄o t t ee ta 1 ，2 0 0 4 ) 。此外，i n o s 还是西红柿抵抗丁香假 单孢菌侵染过程中的一个关键性酶( w e n d e h e n n ee ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 基于与蜗牛n o 合成途径中的一个蛋白序列的相似性，g u o 等( 2 0 0 3 ) 从拟南芥中 克隆了一个激素激活的n o s 。a t n o s l 与哺乳动物n o s 及其它植物i n o s 都没有相似 序列，但具有不依赖于核黄素、亚铁血红素以及四氢生物蝶呤的n o s 活性，a b a 不影响n o s lm r n a 水平，说明a t n o s l 是组成型的。a t n o s l 是拟南芥种子萌发、 根和茎生长、种子育性、a b a 诱导的气孔关闭等生命活动所必需的，这可能是 a t n o s l 催化产生的n o 能够对一系列激素或其他信号产生响应的缘故( g u oe ta 1 ， 2 0 0 3 ) 。g u o 等( 2 0 0 5 ) 对a t n o s l 突变体进一步研究结果表明，在非胁迫条件下， 吴亚兵：植物异三聚体g 蛋白在脱落酸以及一氧化氮调控气孔运动中的功能研究 1 1 a t n o s l 的作用是降低r o s 水平以及蛋白质和脂质氧化水平，a t n o s l 同样能够在 黑暗诱导的衰老过程中降低h 2 0 2 生成水平以及蛋白质降解程度。黑暗处理的a t n o s l 突变体植株或离体叶片衰老明显快于野生型。 z e i d l e r 等( 2 0 0 4 ) 报道了a t n 0 s 1 参与了植物防御反应。脂多糖( l p s ) 可以诱导野 生型拟南芥悬浮培养细胞以及叶片表皮细胞产生大量n o 。有趣的是，野生型拟南 芥叶片以及病原可诱导的v a r p 突变体叶片经l p s 处理后，都能够产生大量的n o ， 而在c a t n o s l 突变体叶片中，l p s 并不诱导n o 的生成。由此说明在野生型拟南芥中， l p s 是通过激活a t n o s l 来诱导n o 生成的。l p s 可以诱导一系列防御或胁迫相关基 因的表达，包括谷胱甘肽s 一转移酶基因、细胞色素p 4 5 0 基因以及许多编码病原相 关蛋白的基因。但是，在_ a m o s l 突变体中l p s 并不能诱导类似基因的表达。此外， a t n o s l 突变体比野生型拟南芥更易受植物病原细菌p s e u d o m o n a ss y r i n g a ep v t o m a t od c 3 0 0 0 的感染，说明a i n o s l 参与了拟南芥对细菌病害的忍受过程。 此外，a t n o s l 还参与了拟南芥花期的控制( v i ee ta l 。，2 0 0 4 ) 。a t n o s l 突变体开花 时间要早于野生型。 1 1 1 4n o s 的活性检测和细胞学定位 r i b e i r o 等( 1 9 9 9 ) 运用免疫印迹技术在玉米幼苗根尖和幼时可溶性提取物中检 测到大约1 6 6 k d 的蛋白条带，免疫荧光检测显示玉米n o s 蛋白主要产生于分生区 细胞的细胞质，并可以转运到玉米根尖伸长区细胞的细胞核中。这些结果表明， 玉米组织中存在具有活性的n o s 酶，且该蛋白的定位主要依赖于细胞的类型( 如： 分生细胞、伸长细胞等) 。 b a r r o s o 等( 1 9 9 9 ) 同样运用免疫印迹技术在豌豆叶片过氧化物酶体中检测到大 约1 3 0 k d 免疫反应蛋白。电镜下观察到免疫金标记的n o s 主要定位于过氧化物酶 体以及叶绿体中。在过氧化物酶体中检测到n o s 活性表明这些氧化性细胞器很可 能是n o 的源泉，同时也揭示了过氧化物酶体在细胞信号转导机制中新的功能。 g u o 等( 2 0 0 5 ) 在含有n o s l - g f p 融合蛋白的转基因拟南芥根部成熟区和根毛区 观察到强烈的呈点状的g f p 荧光，说明n o s l g f p 融合蛋白定位于某个细胞器。在 根毛区，来f l n o s l 一g f p 荧光信号能够与线粒体荧光探针( 红色) 共定位，说明n o s l 扬州大学硕士学位论文 定位于线粒体，该定位也使得n o s l 处于一个关键性的位置以控制细胞的发育进 程，女i r o s 产生、细胞程序性死亡等。 1 1 2 硝酸还原酶( n r ) 催化的n o 合成途径 n r 利用n a d p n a d p h 作为氢离子和电子供体，催化硝酸盐和亚硝酸盐的单电 子还原反应来合成n o ，它是高等植物中氮代谢途径的一个关键酶，并且其催化的 反应为限速反应( l e a , 1 9 9 9 ) 。 r o c k e l 等( 2 0 0 2 ) 报道植物体中n r 能够调节n o 的生成，n r 催化的n o 生成速率 严格受亚硝酸盐水平的调节，而硝酸盐却作为一个组成型抑制剂发挥作用，n o 的 生成并不受n o s 抑制剂的影响，却受到n r 活性抑制剂冈田酸的抑制。 钨酸盐作为一种钼的类似物，预处理细胞能够降低n r 活性。a b a 诱导的拟南 芥保卫细胞中n o 的合成，以及伴随的气孔关闭过程可以被钨酸盐抑制，但此效应 不被n o s 抑制剂l n a m e 抑f 1 i j ( n e i l le la 1 ，2 0 0 3 ) 。k a i s e r 等( 1 9 9 9 ) 报道- j n r 活性在转 录水平和转录后水平受到众多环境因子的调节，这些因子包括n 0 3 浓度、光、温 度、c 0 2 浓度、0 2 以及细胞质p h 变化等，而这些因子都参与了对气孔运动的调节。 大豆n r 缺陷型突变体不能像野生型植株一样释放n o ，表明n r 是一种潜在的 产生n o 的酶( d e a na n dh a r p e r , 1 9 8 6 ) 。大豆n r 的活性依赖于n a d ( p ) h ，最适p h 为 6 7 5 ，对氰化物敏感( d e a na n dh a r p e r ，1 9 8 8 ) 。通过对拟南芥n r 缺陷型和n r 突变体 ( n i a l 和n i a 2 ) 研究发现n r 在a b a 诱导的保卫细胞n o 形成过程中起着作用( d e s i k n n e la 1 ，2 0 0 2 ；n e i l le la 1 ，2 0 0 3 ；b r i g h te la 1 ，2 0 0 6 ) 。马铃薯块茎经过晚疫病病菌或者来 自于o o m y c e l e 病原体的诱导子处理后可以从转录以及蛋白质水平诱导n r 基因的表 达，所以在植物防御过程中，n o 可以通过n r 途径合成( y a m a m o t oe ta 1 2 0 0 3 ) 。 1 1 3 非酶途径 在酸性或者还原条件下，亚硝酸的还原将转化为n o ，亚硝酸能够由抗坏血酸 反应形成脱氢抗坏血酸和n o ( w e i t z b e r ga n dl u n d b e r g ，1 9 9 8 ) 。大麦糊粉层外质体 中检测到由亚硝酸盐通过化学还原作用形成n o 的非酶途径。该反应需要酸性p h 和酚化合物做还原剂，a b a 和赤霉素能够迅速酸化质外体基质，在响应这两种激 素的时候也可以在质外体观察到非酶途径n o 的合成( w e n d e h e n n e e l a l 2 0 0 4 ) 。 吴亚兵；植物异三聚体0 蛋白在脱落酸以及一氧化氮调控气孔运动中的功能研究 1 3 式娶磊 progr彳ammedcell p r o t e c t i o n 土 l、 v ( p c d ) g e r m i n a t i o nd e v e l o p m e n t 图1 2 1n o 参与了多种胁迫或刺激引起的细胞反应 f i g 1 2 1i n v o l v e m e n t o f n o i n c e l l u l a r r e s p o n s e s t o v a r i o u ss t r e s s e sa n ds t i m u l i ( d e s i k a ne ta 1 ，2 0 0 4 ，j o u r n a lo f e x p e r i m e n