【白细胞检验的临床应用】PPT课件.ppt

第九章白细胞检验的临床应用,1,第一节概述,2,白血病的发现,1827年，Velpeau医生描述了第一例白血病：生前有腹胀、全身乏力及发热，住院不久即死亡。尸检发现肝、脾明显肿大，血液粘稠，色似红酒，上有白膜，像“脓”。1845年，英国的Bennett和德国的Virchow又分别报道一例血液中有大量脓样球体的类似病例。1847年，Virchow首次提出了“白血”这个名称，德文是weissesblut，希腊文则译为leukemia，即白血病，认为患者是“白色血球”的增多，并随后进行了一系列研究1856年，Virchow进一步对白血病做了综合描述，对血液中的这些无色或白色的球体的来源，提出了三种可能性：即血液、淋巴，也可能来自血管壁，并认为来自淋巴的可能性最大。,3,定义,白血病是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病。其克隆中的白血病细胞增殖失控、分化障碍、凋亡受阻，而停滞在细胞发育的不同阶段。在骨髓和其他造血组织中白血病细胞大量增生累积，并浸润其他器官和组织，而正常造血受抑制。,4,发病情况,我国白血病年发病率约2.76/10万，男性发病率略高于女性（1.81：1）。在恶性肿瘤所致的死亡率中，白血病在男性居第6位、女性居第8位，在儿童及35岁以下成人中居第1位。我国AL比CL多见（约5.5：1）。其中AML最多(1.62/10万)，其次ALL(0.69/10万)，CML(0.36/10万)、CLL少见(0.05/10万)。成人以AML多，儿童以ALL多。CML随年龄增长发病率逐渐升高。CLL在50岁以后发病才明显增多。,5,病因及发病机制,白血病的病因尚未完全清楚，可能是.病毒物理因素化学因素遗传因素其他血液病,6,病毒成人T细胞白血病/淋巴瘤（ATL）可由人类T淋巴细胞病毒-1型（HTLV-1）所致。霍奇金淋巴瘤（HL）患者血清中存在高效价的EB病毒抗体。HIV感染后，部分免疫功能异常者患白血病危险度会增加。,7,物理因素包括X射线、射线等电离辐射。放射工作者发生白血病最早报道于1911年。1929-1942年放射科医师白血病的发病率为非放射科医师的10倍，以后加强防护后明显减少。广岛及长崎原子弹袭击后，幸存者中白血病发病率比未受照射的人群高30倍。对强直性脊柱炎的放射治疗和真性红细胞增多症32P治疗，发病率较对照组高。,8,化学因素多年接触苯以及含有苯的有机溶剂与白血病发生有关。早年制鞋工人较正常人的发病率高2-3倍。药物：氯霉素、保泰松,9,遗传因素家族性白血病约占白血病的7/1000.单卵孪生子中如果一个发生白血病，另一个的发病率为1/5。先天性痴愚（Downs综合症），此种病儿患白血病的发病率为50/10万，较正常儿童高1520倍。,10,其他血液病MDSPNH淋巴瘤多发性骨髓瘤,11,临床表现,正常骨髓造血功能受抑制，出现贫血、发热、出血征象。白血病细胞增殖浸润，肝脾淋巴结肿大、骨关节疼痛、眼部浸润、口腔和皮肤浸润、中枢神经系统白血病。其他,12,贫血面色苍白、疲乏无力、头昏和气促。部分患者因病程短，可无贫血。半数患者就诊时已有重度贫血，尤其是继发于MDS者。贫血原因：红细胞生成受抑、无效红细胞生成、溶血、失血、抗代谢药物应用。,13,发热半数患者以发热为早期表现，可出现低热或高热，伴有畏寒、出汗。高热往往提示继发感染，口腔炎、牙龈炎、咽峡炎最常见；肺部感染、肛周炎、肛旁脓肿亦常见。最常见的致病菌为革兰阴性杆菌，长期应用抗生素者可出现真菌感染，可发生病毒感染，偶见卡氏肺孢子虫病。发热原因：瘤性发热、功能性粒细胞减少（主要为中性粒细胞减少）,14,出血以出血为早期表现者近40出血部位：以皮肤瘀点、瘀癍、鼻出血、牙龈出血、月经过多为多见；眼底出血可致视力障碍。多数AL死于出血，其中多为颅内出血。出血原因：白血病细胞在血管中淤滞及浸润，血小板减少是最重要原因，凝血异常（M3型最易致DIC），抗凝物质增多。,15,肝、脾肿大：轻、中度，但并非普遍存在；主要与白血病细胞的浸润及新陈代谢增高有关。淋巴结肿大：约50病人在就诊时伴有淋巴结肿大（包括浅表淋巴结和纵隔、腹膜后等深部淋巴结）多见于急淋。,16,骨骼、关节浸润骨骼、关节疼痛：是白血病常见的症状，以儿童多见。发生骨髓坏死时，可引起骨骼剧痛。胸骨下段局部压痛：对白血病诊断有一定价值。,17,眼部粒细胞肉瘤（绿色瘤），由于骨膜受累，可在眼眶、肋骨及其他扁平骨的骨面形成，其中以眼眶部位最常见，可引起眼球突出、复视或失明。,18,口腔、皮肤浸润可有牙龈增生、肿胀皮肤出现蓝灰色斑丘疹（局部皮肤隆起、变硬、呈紫蓝色结节状）、皮下结节、多形红斑、结节性红斑等多见于M4和M5,19,中枢神经系统白血病（CNSL）表现：轻者表现为头痛、头晕，重者可有呕吐、视乳头水肿、视力模糊、面瘫、颈项强直、抽搐、昏迷等。CNSL可发生在疾病的各个时期，但常发生在缓解期，以急淋最常见，儿童病人尤甚，其次为M4、M5和M2。白血病髓外复发的最常见部位,20,睾丸浸润睾丸出现无痛性肿大，多为一侧性，另一侧虽无肿大，但在活检时往往也发现有白血病细胞浸润。多见于急淋化疗缓解后的幼儿和青年。是仅次于CNSL髓外复发的根源。,21,白血病的早期分类,Virchow和Bennet早在他们的病例中就已发现白血病有不同类型1856年，Virchow将白血病分为“脾型(splenic)”和“淋巴型(lymphatic)”两大类，各类型均有其独特的细胞，目前的分型是在此基础上发展起来的。1868年，德国Neumann教授：发表“血液的形成主要在骨髓”的论文，认为出生后骨髓是形成血液的一个重要器官提出髓源性白血病（myelogenousleukemia）这一名称，以后又简称为髓性白血病（myeloidleukemia）。,22,1887年，德国Ehrlich创立血细胞染色法，开始了真正的白血病分型。1889年，Ebstein第一次明确提出“急性”白血病这一名称。1900年，瑞士Naegeli提出了原始髓细胞，以后证实急性髓细胞白血病是原始髓细胞增多。1913年，Reschad和Schilling首先报道了单核细胞白血病的病例。1917年，DiGuglielmo分出红白血病这一类型。,23,1938年，单核细胞白血病分为粒-单核细胞白血病和单核细胞白血病。1938年，Forkner在白血病及其有关疾病一书中，将白血病分为急性和慢性两大类，急性白血病又分为髓细胞型、淋巴细胞型、单核细胞型。1957年，Hillested首先报道了急性早幼粒细胞白血病1974年，英国Hayhoe及法国Bernard、Mathe、Flandrin等又各自提出了不同的分型方法，这就使白血病的分型显得有些混乱。,24,白血病的基本分类,根据白血病细胞的成熟程度和自然病程分类。急性白血病（AL）：AL的细胞分化停滞在较早阶段，多为原始及早期幼稚细胞，病情发展迅速，自然病程仅几月。慢性白血病（CL）：CL的细胞分化停滞在较晚的阶段，多为较成熟幼稚细胞和成熟细胞，病情发展缓慢，自然病程数年。,25,根据主要受累的细胞系列分类AL分为：急性淋巴细胞白血病（ALL）和急性非淋巴细胞白血病（ANLL）或急性髓细胞白血病（AML）。CL分为：慢性淋巴细胞白血病（CLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、慢性单核细胞白血病（CMOL）。特殊类型白血病：如嗜酸粒细胞白血病、嗜碱粒细胞白血病、全髓白血病、混合细胞等。,26,急性白血病FAB分类,1975年，法国巴黎急性白血病分类讨论会上英国Galton与Dacie提出按细胞形态分为M0-M6七种类型。1976年，法、美、英3国7位血液学家共同对大量白血病患者的骨髓和血液图片，以光学显微镜下的形态学特征为主要依据，参照细胞化学染色，制定了FAB分型标准，标志着现代白血病诊断与分型的开端。1985年，FAB协作组提出AML形态学诊断标准的修改意见。1985年，将急性巨核细胞白血病划为M7。1991年，又提出急性髓细胞白血病微分化型（M0）,27,28,L1原始和幼淋巴细胞以小细胞为主（直径12m）大小较一致染色质较粗核仁小不清,29,L2原始和幼淋巴细胞以大细胞为主（直径12m）大小不一染色质较疏松核仁较大，1个至多个,30,L3大细胞为主，大小一致。染色质细点状均匀核仁1个或多个且明显细胞内有明显空泡，胞浆嗜碱性，染色深。,31,M0（急性髓细胞白血病微分化型）骨髓原始细胞30无嗜天青颗粒及Auer小体，核仁明显.髓过氧化物酶(MPO)及苏丹黑B阳性细胞3电镜下MPO阳性CD33或CD13等髓系标志可呈阳性，淋巴系抗原通常为阴性，血小板抗原阴性。,32,M1（急性粒细胞白血病未分化型）原粒细胞（型型，原粒细胞浆中无颗粒为型，出现少数颗粒为型）占骨髓非红系有核细胞（NEC，指不包括浆细胞、淋巴细胞、组织嗜碱细胞、巨噬细胞及所有红系有核细胞的骨髓有核细胞计数）的90以上其中至少3以上的细胞为MPO阳性,33,M2（急性粒细胞白血病部分分化型）原粒细胞占骨髓NEC的3089其他细胞10，单核细胞20,34,M3（急性早幼粒细胞白血病）骨髓中以颗粒增多的早幼粒细胞为主，此类细胞在NEC中30其胞核大小不一，胞浆中有大小不等的颗粒，Aure（棒状）小体。,35,M4（急性粒-单核细胞白血病）骨髓中原始细胞占NEC的30以上各阶段粒细胞占3080各阶段单核细胞20M4Eo除上述特点外，嗜酸性粒细胞在NEC中5,36,M5（急性单核细胞白血病）骨髓NEC中原单核、幼单核及单核细胞80原单核细胞80为M5a原单核细胞80为M5b,37,M6（红白血病）骨髓中幼红细胞50NEC中原始细胞（型型）30,38,M7（急性巨核细胞白血病）骨髓中原始巨核细胞30血小板抗原阳性血小板过氧化物酶阳性,39,MDS的FAB分型,根据患者外周血和骨髓中原始细胞的比例、形态学改变及单核细胞数量分为5型。难治性贫血（RA）环形铁力幼细胞性难治性贫血（RAS）难治性贫血伴原始细胞增多（RAEB）难治性贫血伴原始细胞增多转变型（RAEB-t）慢性粒-单核细胞白血病（CMML）,40,FAB分类AL诊断标准与步骤,除临床症状、体征与血象外，骨髓形态学分类是诊断急性白血病的主要依据，尤其是原始细胞（包括原粒、原单核及原淋巴细胞）的百分比。,骨髓穿刺,原、幼红细胞50ANC,原、幼红细胞50ANC,原始细胞30NEC,原始细胞30NEC,AML-M6,MDS,ALL,M0-M5,M7,原始细胞30ANC,原始细胞30ANC,注：ANC：全部骨髓有核细胞；NEC：非红系骨髓有核细胞,骨髓增生活跃以上,骨髓增生减低或重度减低,骨髓活检,41,FAB对AL的诊断标准为:(1)骨髓有核细胞分类计数(500个细胞)原始细胞比例0.30;(2)如果骨髓以红系为主(0.50),则非红系细胞(包括淋巴细胞、浆细胞和巨噬细胞)分类计数（NEC）原始细胞0.30(3)有急性早幼粒细胞白血病特异性形态特征。根据第(1)条标准ALL就可以确诊,而急性髓系白血病（AML）的诊断则需要(1)+(2)/(3)。,42,关于髓系原始细胞FAB协作组定义了二型:型原始细胞无颗粒,染色质疏松,核浆比例高,常有明显的核仁；型原始细胞的形态与I型基本上相同，但胞浆中有少许嗜天青颗粒,核浆比例相对较低；型原始细胞如果胞核已经偏位、出现高尔基区、染色质凝集则为早幼粒细胞。NEC计数是指不包括浆细胞、淋巴细胞、组织嗜碱细胞、巨噬细胞及所有有核红细胞的骨髓有核细胞计数。,44,FAB分类的不足,按骨髓原始细胞比例0.30的诊断标准,并非所有急性白血病均可得以诊断。某些白血病在其早期骨髓原始细胞0.30(但常0.20)由于存在有原发性白血病特征染色体核型异常如t(8;21)(q22;q22)或inv(16)(p13q22)而诊断为AL,有人把该类型AL称之为寡原始细胞(oligoblastic)白血病。此外,某些AL骨髓原始细胞比例0.30,而外周血原始细胞则0.30,亦有人把该类AL称之为“外周血性白血病”。,45,并非所有AL均可按FAB标准确定其亚型，特别是治疗相关性AML或骨髓增生性疾病(MPD)衍变的AML。FAB分型可重复性较差：AL的FAB分型诊断可重复性为0.58-0.98，特别是M1与M2、M2与M4之间的鉴别，准确的分型有赖于阅片者的经验，带有一定的主观性。FAB分型未包括双表型白血病、双系列白血病等系列不明的白血病。,46,最为重要的是FAB分型忽略了对临床治疗策略制定、预后判断等有重要指导意义的白血病细胞生物学特征如：M3中t(15;17)(q22;q21)，患者为全反式维甲酸(ATRA)敏感，而t(11;17)(q23;q21)则表现为ATRA耐药。,47,MICM分型,1985-1986年FAB协作组邀请免疫学家和细胞遗传学家共同提出了形态学、免疫学、细胞遗传学（morphologic、immunologic、cytogenetic，MIC）的分类标准；80年代末至90年代初，随着PCR等分子生物学技术的应用，使白血病的诊断和分型迈入分子生物学水平，出现了MICM（形态学、免疫学、细胞遗传学、分子生物学）分型。但总的来说，由于MICM分型可操作性差而基本未被临床采用。,48,WHO分类,1995年开始由美国血液病理学会（SH）和欧洲血液病理协会(EAHP)合作制订，包括52位知名血液病理学家联合组成一个指导委员会下设十个专题委员会分工起草另聘35位白血病和淋巴瘤方面的临床专家，组成临床咨询委员会（CAC）1995-1997期间指导委员会成员与各专题委员会数次开会制定中的病种名称和诊断标准进行会商，以取得一致。,49,1997年3月完成初稿，举行第一次SH和EAHP联席会议进行详细讨论。1997年11月举行CAC讨论会，参加者为36位CAC成员WHO委员会成员以及SH和EAHP执行委员会成员，会后经过善后讨论，于1999年初发表了CAC会议报告。2001年由WHO国际癌症研究暑以WHO肿瘤分类（蓝皮书）系列书之一正式公布。,50,1.血或骨髓原始粒（或单核）细胞20%，可诊断AML。2.当患者被证实有克隆性重现性细胞学异常:t(8;21)(q22;q22),t(15;17)(q22;q11-12)及其变异型,t(16;16)(p23;q11)或inv(16)(p13;q22),11q23异常时，即使原始细胞20，也应诊断AML。3.伴有多细胞系病态造血的AML及治疗相关性AML和MDS，分别单独划分为独立亚类。,WHO分类AML诊断标准：,51,细胞遗传学检查是WHO分类亚型的重要内容主要方法有染色体检查、逆转录多聚酶链式反应（RT-PCR）以及荧光原位杂交（FISH）等。鉴于基因诊断在WHO分型中的重要性，建议对初诊患者常规作染色体检查，对具有特定染色体异常患者定期复查染色体、RT-PCR或FISH异常基因的表达，以指导治疗。,52,WHO分类与FAB的主要区别,AL诊断标准改为原始细胞0.20MDS5型改为8型，取消原FAB分型中的转化中难治性贫血伴有原始细胞过多（RAEB-t）亚型（归为AML）。,53,WHO分类，将形态学、生物学和遗传学信息融合，代表着我们认定和处理独特疾病能力上的一个重要进展。在我国，WHO分类正处于推广应用阶段；新的分子机制的探索，将进一步完善现行的WHO分类体系。,54,第二节AL的实验室检查,55,实验室检查,血象骨髓象细胞化学免疫学检查细胞与分子遗传检验其他,56,血象WBC：多数，也有正常或WBC10109/L白细胞增多性白血病WBC1.0109/L白细胞不增多性白血病多数可见数量不等的原始和/或幼稚细胞RBC：多数为正常细胞性贫血，少数可找到幼红细胞PLT：，约5060109/L，晚期极度减少（2109/L）,57,骨髓象诊断AL的主要依据和必做检查需要特殊注意的几个问题：原始细胞/全部骨髓有核细胞（ANC）30为AL的诊断标准“白血病裂孔”现象低增生性白血病（原始细胞达到诊断标准）Auer小体仅见于AML，有独立诊断意义,58,Auer小体,59,细胞化学染色,60,AML，POX,ALL，PAS,M5，非特异性酯酶,M5，非特异性酯酶，NaF抑制,61,免疫学分型,借助免疫学技术，利用细胞表面(或细胞浆)某些特异性的成分来判断细胞的系别、类型和阶段性，从而对白血病做出正确的分析和诊断。,62,以T淋巴细胞为主表达的标志,63,以B淋巴细胞为主表达的标志,64,淋系细胞主要免疫标记特征,1、T细胞CD7为出现早、且贯穿表达整个T细胞分化发育过程中的抗原CD25为激活的T、B细胞的标记2、B细胞细胞膜表面免疫球蛋白（SmIg）是成熟B细胞特征性的标记小鼠红细胞受体（Em）为早期成熟B细胞标志CD19是鉴别全B系（从早前B细胞至前浆细胞）的敏感而又特异的标记,65,以髓系细胞为主表达的标志,66,髓系细胞主要免疫标记特征,粒-单细胞有些共有的标记如CD11b、CD31-36、CD64、CD68等。CD13、CD33反应谱系较广，亦可表达在细胞质中，十分稳定，用于AML诊断。CD14是单核细胞特异的。胞质中CD13、CD14、CD15表达早于膜表面表达，且特异性更强。抗髓过氧化物酶（MPO）为髓系所特有。,67,巨核细胞系：CD41a（b/a）、CD41b（b）、CD61（a）、血小板过氧化物酶（PPO）红细胞系：血型糖蛋白A、H和CD71,68,非系性标志,69,造血干、祖细胞主要免疫标记特征,CD34是造血干细胞标记，无系特异性CD38是造血祖细胞标记,70,免疫学分型与FAB相比，不仅更客观、准确、重复性好，还可鉴别白血病细胞的起源、分化阶段及基因的克隆的特点，提高了白血病的诊断，可将99%的AML与ALL鉴别开，可明确对ALL进行免疫分型，可明确形态学不能或很难区分的白血病类型及亚型，如M0、M7和混合细胞白血病。,71,免役表型补充了形态学的不足，提高了分型的正确性，故已成为白血病的诊断、治疗及基础研究的重要手段，但尚不能取代形态学的分型。由于白血病细胞具有“异质性”和“非同步性”，且常伴有抗原表达紊乱现象，有时免疫分型的分化抗原在单抗表达上会出现一些差异，故免疫标记诊断需要综合分析。,72,随着研究的深入，目前已涉及到分化抗原的分子结构和功能的领域，研究证明，造血系统某些分化抗原代表细胞因子受体、黏附分子、表面酶等，参与细胞活动。因此，白血病分化抗原的功能亚群分类可能代表一种更有应用前景的方法。,73,细胞遗传学检验,是采用染色体检测技术对白血病细胞进行核型分析并分型，找出与FAB分型的相关性或特定核型改变与治疗和预后的相关性。,74,染色体命名法：臂以着丝粒将每一染色体分为长臂（q）和短臂(p)。区两相邻界标之间的区域，从着丝粒往远侧依序编号。带从着丝粒往远侧依序编号，作为界标的带属于此界以远的区。,75,常见染色体结构异常及其英文缩写缺失（deletion，del）易位（translocation，t）倒位（inversion，inv）重复（duplication，dup）等臂染色体（isochromosome，i）环状染色体（ring.chromosome，r）,76,临床常见白血病的染色体改变93%AML核型异常平衡畸形（倒位和易位，与FAB分型相关）不平衡畸形（数目异常，与FAB分型无关）90%ALL克隆性核型异常特异性染色体重排（与免疫学亚型相关）数目异常（与免疫学亚型无相关性）,77,临床常见白血病的染色体改变,急性白血病染色体异常见于各种亚型预后价值急性髓细胞白血病t(8;21)M2预后较好t(15;17)M3同上inv(16);del(16q)M4E0同上+8各种亚型预后不良+21M1,M7+13双表型预后不良5q-,-5,-7继发性白血病同上t(8;16)M5b同上t(9;22)M1等同上t(4;11)双表型同上急性淋巴细胞白血病t(4;11)L2预后较好t(1;9)L1预后不