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基于复合纳米材料协同作用的葡萄糖电化学传感器研究 专业：分析化学 姓名：康信煌 导师：蔡沛祥教授 摘要 葡萄糖电化学传感器仍然是电分析化学的重要研究方向之一，随着纳米材料制备技术 的提高，表征手段的完善，以及与化学和生命科学的融合，对生命中的微环境及组分的快 速探知和可控的要求，纳米材料的特性，赋予了电化学生物传感器更有所作为的空间。特 别是近些年来，复合纳米材料的杂化，协同的电化学催化性能，使该电化学传感器备受人 们的关注。 基于上述背景，本论文开展了以下三方面的研究：( 1 ) 壳聚糖负载，化学法合成了稳 定的并具有良好分散的纳米金和铂，采用湿法与碳纳米管进行复合纳米杂化，分别构建了 纳米金与碳纳米管和纳米铂与碳纳米管( c n t ) 复合纳米材料杂化的葡萄糖酶电化学生物传 感器，对其电化学性能进行了研究，并应用于血液样品的分析，结果较满意：( 2 ) 通过电 化学沉积方法，构建了a u p t 合金纳米粒子与c n t 复合纳米材料杂化的葡萄糖酶电化学生物 传感器，对其进行了电化学性能的研究，具有较高的灵敏度和良好的稳定性等；( 3 ) 采用 电化学沉积方法，构建t c u 纳米簇与c n t 复合纳米材料杂化的无酶葡萄糖传感器，对其进 行了物理和电化学表征，以及传感器性能的研究，具有较高的灵敏度，良好的稳定性和选 择性，并应用于血液样品分析，具有较好的回收率。全文共5 章，其主要内容如下。 1 综述了基于纳米材料的葡萄糖电化学传感器的研究进展。提出了本论文的研究背 景、内容和意义。 2 氯金酸( h a u c l 4 ) 分散在壳聚糖( c s ) 溶液中，用硼氢化钠( n a b h 4 ) k t 卫原，制备了c s 负 载的纳米金( a u n p ) 溶胶，通过透射电镜( t e m ) 、红外( f t i r ) 和紫外可见( u v - v i s ) 光谱表征， 表明该金溶胶具有高度的分散性和稳定性。再把羧基化的c n t 分散于该金溶胶中，滴加 于玻碳电极( g c e ) 上，形成了一层复合纳米材料杂化膜( a u n p c n t - c s ) ，对该膜进行了交 流阻抗饵i s ) 和循环伏安( c v ) 等电化学表征，结果表明，该膜中的纳米材料a u n p 和c n t 对h 2 0 2 有明显的电化学协同催化作用。再用戊二醛交联g o d 于该杂化膜上，制备了葡萄 糖酶生物传感器，结果表明，在磷酸盐缓冲溶液中( p h7 0 ) 和较低的工作电位( o 4 v ) 下，检 测葡萄糖，具有较高的灵敏度( 1 6 8 1 a a r e t o o l l ) ，较宽的线性范围( 2 0 1 0 - 5 1 5 1 0 。 m o l ，l ) ，响应速度快( 小于2 s ) 。用该法测定了人血样品中的葡萄糖含量。 3 以c s 为稳定剂，通过n a b h 4 还原h 2 p t c l 6 合成了c s 负载纳米铂( p t n p c s ) ，用t e m 、 x r d 、f t - i r 和u v - v i s 分别对其进行了表征。在p t n p c s 溶胶中加入羧基化的c n t ，形 成了复合纳米材料杂化体系( c n t - p t n p c s ) ；在c n t - p t n p c s 中加入甲基三甲氧基硅烷 ( m t o s ) ，形成了良好分散的有机无机杂化的s o l g e l ( c n t - p t n p c s m t o s ) ，通过扫描电 镜( s e m ) 和电化学方法对其进行了表征，显示c n t 和p t n p 对h 2 0 2 具有显著的协同催化效 应。再在该s o i g e l 中，加入g o d ，滴涂于g c e 上，构建了良好稳定性的葡萄糖酶生物传 感器。研究发现，c n t 和p t n p 对葡萄糖具有良好协同催化作用，在工作电位较低( o 1 v ) 检测葡萄糖，灵敏度高( 2 0 8 | _ t a m m o l f l ) ，线性范围宽( 1 2 x 1 0 - 6 6 0 x 1 0 一m o l l ) ，且无干扰。 4 以壳聚糖( c s ) 为c n t 的分散剂，滴涂于g c e 上，形成 c n t c s 膜，通过电沉积方 法，沉积金铂纳米合金于该膜上，形成了复合纳米材料修饰的电极( a u - p t n p c n t c s g c e ) 。对其进行了s e m 、x r d 、c v 和e i s 等表征，发现a u - p t n p 和c n t 纳米杂化在低电 位下，对h 2 0 2 具有良好的协同催化作用。再在该修饰电极上，通过戊二醛交联g o d 与c s ， 构建了一新型的葡萄糖生物传感器，在低电位下( 0 1 v ) ，该传感器具有高的灵敏度( 8 5 3 g a m m o l l ) ，低的检测限( o 2g m o l l ) ，宽的线性范围( o 0 0 1 7 0m m o l l ) ，快速的电流响应 ( o 6 v t l l - 1 3 1 ) ，在如此高的电位下进行氧化测定，易受到试样中共存 的其它电活性物质干扰，如抗坏血酸和尿酸等；另一方面由于基础电极的面积小而 导致固定的酶的数量较少，且由于酶蛋白多点附着在载体上，引起固定化酶蛋白无 序的定向和结构变形的增加，因为酶的生物活性是依靠其三维空间立体结构来维持 的，这种变形会使酶的活性部分或全部失去，从而造成检测的灵敏度低，重现性差， 寿命短等缺点；再者，产物过氧化氢的浓度较高时易使酶失活，且传感器易受到环 境氧的影响；因此该方法的灵敏度和选择性相对较差。为了避免使用高的极化电位 和试样中共存的其它电活性物质干扰，近年来的研究表明，一方面是引入纳米材料 固定酶可降低极化电位和改善酶催化微环境，来提高灵敏度和选择性，如碳纳米管 ( c n r ) 【1 4 l 和金属纳米材料【1 5 l 等，可在0 0 0 4 v 的较低的极化电位进行检测：另一方面 引入选择性膜，只允许过氧化氢透过，而干扰物质难以透过，来减少干扰，提高选 择性，如聚氨基苯酚【1 6 1 、聚苯二氨m 、聚吡咯【1 8 i 等。 为了克服第一代酶传感器的缺点，在1 9 8 4 年，a n t h o n yc a s s 博士首次报导了关 于介体酶电极 1 9 1 的研究，标志了第二代酶生物传感器研究的开端，也成为了迄今生 物传感器最成功商品的支撑技术。c l a s s 博士将g o d 固定在石墨电极上，以水不溶性 的二茂铁单羧酸为介体，在电极对葡萄糖的响应过程中，二茂铁离子作为g o d 的氧 化剂，并在酶反应与电极反应过程之间迅速传递电子，二茂铁在电极上氧化产生的 氧化电流与葡萄糖的浓度有关。其响应原理为：g l u c o s e + g o d f a d g l u c o n o l a c t o n e + g o d - f a d h 2 ，g o d f a d h 2 + 2 m ( o x ) 一g o d f a d + 2 m ( r e a ) + 2 h + ，2 m ( 耐) 一2 m ( o x ) + 2 e ，如图1 3 ( 中) 。其显著特点有：只需较低的极化电位，就能使介体氧化，因 而减少了其它具有较低氧化还原物质干扰电极的机会；二茂铁离子不与氧起反应， 使传感器对氧不敏感，能够在缺氧或者氧浓度易变化的条件下使用；二茂铁离子与 还原的葡萄糖氧化酶之间的电子传递快，因而电极响应迅速；二茂铁衍生物为水不 溶性，可直接限制在电极表面，无需投放到样品溶液中。研究表明，作为良好的介 体，需要具备以下条件：极易参与有生物活性材料和电极存在的氧化还原反应，在 均相和非均相体系中部能迅速迸行电子传递；还原态不被氧气氧化；氧化态的再生 所需要的电位低，且不受p h 的影响；对生物无毒性，不被生物催化剂作为底物；易 与生物催化剂共固定化；有良好的稳定性。常用的电子媒介体有：二茂铁及其衍生 图1 3 第一代氧受体( 左) ，耦合电子介体的第二代( 中) 和 无电子介体的第三代( 右) 电化学酶生物传感器的电子传递 8 物、铁氰化钾、酞箐染料、钌和锇的联吡啶、金属h 啉化合物、醌一氢醌、有机染料、 四硫富瓦烯和导电有机盐等。但此类传感器依赖于酶与电极之间的电子媒介进行电子 传递，存在氧化还原中间体易流失的问题，仍需进一步改进。最近研究表明，应用纳 米材料固定介体和酶，可提高介体和酶的稳定性 2 0 1 。 第三代直接电化学酶生物传感器是指酶的氧化还原中心与电极表面直接进行电 子移，是一种无酶介体的酶生物传感器。与前两代相比，直接电化学酶生物传感器 既不需要氧分子，也不需要化学分子介体作为电子传递体，通常还不需要固定化载 体，而是将酶分子直接吸附固定到电极表面，使酶的氧化还原活性中心与电极直接 “交流”，能够更快地进行电子传递，从而使酶电极生物传感器的响应速度更快。灵 敏度更高，真正成为“无试剂分析”，其酶催化循环如图1 3 ( 右) 所示。但由于酶的 电活性中心f a d 深埋在酶分子的内部，且在电极表面固定后易发生变形，使酶与电 极之间难以直接进行电子转移，因此采用这一方法来制作酶生物传感器具有一定的 难度。目前文献报道的主要是以过氧化物酶【2 1 l 、血红蛋白【2 2 l 、肌红蛋白2 3 l 和细胞色 素c 讲l 等为主。近年来的研究显示，纳米材料的引入，使酶与电极间的直接进行电子 转移易于实现，例如，h b 、h r p 和g o d 在c n t s o c 电极表面均能进行有效和稳定 的直接电子转移1 2 5 1 ；水金纳米粒子与明胶一起固定葡萄糖氧化酶，制各具有纳米增 强效应的葡萄糖传感器，结果显示，纳米颗粒能够大幅度地提高固定酶的催化活性 和响应的灵敏度，且电极响应迅速，一般在5 s 之内就能测得稳定的电流响应值【2 6 l 。 由此，纳米修饰技术有可能成为直接电化学酶生物传感器的主流。 近年来，随着化学、生物学，材料科学、信息学、微电子加工技术和微电子学 等学科的不断交叉和融合，基于酶的电化学生物传感器将出现以下良好的发展趋势： ( 1 ) 纳米材料享有2 l 世纪最有前途的材料”的美誉，纳米材料是指颗粒大小为纳米 级( 一般在1 1 0 0 n m 之间) 、处在原子簇和宏观物体交界区域内的粒子，又称为超微颗 粒材料。纳米微粒具有大的比表面积，表面原子数、表面能和表面张力随粒径的下 降急剧增加，表现出小尺寸效应、量子尺寸效应、界面与表面效应及宏观量子隧道 效应等特性，从而导致纳米微粒的光、热、磁、敏感特性和表面稳定性等不同于正 常粒子。随着纳米材料制备技术和表征手段的发展，纳米材料在酶生物传感器中的 应用，可改进固定化酶的微环境，增强酶的效力，提高灵敏度和稳定性，为传感器 的发展注入新的活力。特别是碳纳米管，金属和金属化合物纳米材料，成为了酶生 物传感器研究的热点【2 ”。( 2 ) 随着在线实时分析、活体检测和商品化及使用方便的 9 日趋需要，纳米材料的应用和微电子加工技术发展，微电极、超微电极和电极探针 化的研究取得了一定的进展，并将更加深入。j l i h r a p o v i c 3 1 l 制备的超微葡萄糖生物传 感器，尖端大小只有1 0 - 5 0 0 n m ，其尖端先用电化学刻蚀，再以苯酚和2 烯丙基苯酚 为单体，电聚合固定g o d ，可检测皮安级的葡萄糖；g e r h a r d t 【3 2 】课题组研究的多点 微型乳酸酶电极探针可直接插入大脑组织检测乳酸的含量，传感器的尖端只有5 i o t u n ；w i l k i r l s 3 3 i 报道的针型乳酸生物传感器的尖端也只有l n m ；w i l s o n 弘3 5 l 就实时活 体检测的电化学微型酶传感器在介体的选择、样品的复杂性、灵敏度、选择性、阵 列检测、葡萄糖的测定和神经传递过程等方面进行了综合评述；a b e l p 6 i 就活体检测 的微型电化学葡萄糖生物传感器，重点在传感器的尖端界面的生物相容性方面进行 了评述。( 3 ) 微型芯片阵列化，在芯片点阵中的每个微点单元为一个传感器探头，可 实现同时多样品和一个样品多组分的快速分析。如u r b a n 3 7 1 报道的在一个微芯片上集 成了可同时分析葡萄糖、乳酸、谷氨酸和谷氨酸胺的电化学酶生物传感器，样品消 耗的体积只有2 6 t t l ；p i s h k o 3 8 1 通过光刻蚀技术研制了同时测定葡萄糖、乳酸、丙酮 酸的微阵列酶电极，每个单元微点只有6 2 5 r a m 2 。进一步与微流控芯片、毛细管电泳 结合，集分离与测定于一身，可实现高通量的检测。( 4 ) 生物传感器与自动样品采集、 处理、进样和分离技术，液体流路控制技术，数据处理技术和信息技术相结合，实 现自动化、智能化和便携化，操作简单方便，适应野外现场检测和高速分析。( 5 ) 实 现商品化、家庭化，并进一步扩大检测对象和应用范围，如临床诊断、家庭保健、 环境检测、食品加工、工业控制、生物工程和军事等领域。特别是糖尿病患者的福 音实现在家按需快速检测葡萄糖【3 们。 i 2 基于纳米材料的葡萄糖电化学酶生物传感器研究进展 2 0 0 5 年n e w m a n 4 0 1 ，就家庭用血液葡萄糖检测生物传感器的商业前景进行了全面 的综述，目前在市场上的各种各样的生物传感器中，葡萄糖生物传感器占了8 5 的份 额，市场销售额估计为每年5 0 亿美元，主要原因是在发达国家糖尿病的人数增加较 快。市场上现有的葡萄糖生物传感器有4 0 多种，但未能实现真正家庭化的主要原因 有灵敏度不够高、使用寿命短和重现性差等，另一重要原因是在制备商用葡萄糖生 物传感器的丝网印刷技术，由于受到固定酶所使用材料的分散性和稳定性差等因素 影响，而未能取得突破性进展。 1 0 随着纳米材料的制备技术和表征手段的日趋成熟，纳米材料的介入为传感器的 发展提供了无穷的想象空间。利用纳米材料结构的特性，特异的小尺寸效应、量子 尺寸效应、界面与表面效应及宏观量子隧道效应，特殊的电学、磁学、光学和化学 性质，可广泛地应用于酶等生物敏感分子的固定，信号的检测和放大，制备出多功 能的全新的生物传感器。纳米材料的应用，使电化学生物传感器更体现出多功能、 微型化、集成化和一次性快速检测的优点，可实现高通量的实时检测分析，可广泛 应用于食品、环境、战场和人体疾病等领域的快速检测，如：食品中的病原体或农 药残留的快速灵敏检测，环境中污染气体或金属离子等远程检测和控制，人体血液 成份和病原体的快速实时检测( 癌症的早期诊断) ，人体健康的长期监测( 如糖尿 病患者血糖成份等) ，以及战场生化毒剂的快速检测( 如炭疽病毒) 。目前纳米材 料电化学生物传感器正成为研究的热点，受到科学界和商业界的广泛关注。以下就 纳米材料葡萄糖电化学酶生物传感器的研究进展进行评述。 1 2 1 基于金属及金属化合物纳米粒子的葡萄糖酶生物传感器 金属及金属化合物纳米粒子是较早应用于电化学酶生物传感器的纳米材料，具 有高比表面积、高活性、良好的生物相容性、强吸附力及高催化效率等优异特性， 可在增加酶的吸附量和稳定性的同时提高酶的催化活性，使酶电极的响应灵敏度得 到提高 2 9 1 。江丽萍在制备亲水金纳米颗粒的基础上，与明胶一起固定g o d ，制得 具有增强效应的葡萄糖酶传感器，实验表明：纳米颗粒能够大幅度地提高固定酶的 催化活性，提高响应灵敏度，电极响应迅速，在5 s 内可测得稳定的电流响应值。孟 宪伟 4 1 1 利用纳米增强效应，分别以a u 、a g 、p t 、s i 0 2 纳米颗粒与聚乙烯醇缩丁醛( p v b ) 构成复合固定酶膜基质，采用溶胶凝胶法( s 0 1 g e l ) 固定g o d ，组成葡萄糖生物传感 器研究表明，纳米颗粒可以大幅度地提高固定化酶的催化活性，增加电极的电流响 应灵敏度，改进生物传感器的抗干扰性能，使信噪比提高- j 3 2 倍岳波【4 2 1 采用水溶性 高分子材料聚丙烯酰胺( p a m ) 包埋g o d 制备葡萄糖酶电极，传感器的工作电位降低 到o 4 v 以下。冷鹏【4 习把含有金纳米颗粒( a u n p ) 的金溶胶引入到葡萄糖传感器中，试 验表明，a u n p 可以显著提高g o d 酶电极的响应灵敏度，制成的传感器选择性、稳定 性好，方法简便，并探讨了金纳米颗粒主要从以下几个途径对酶电极发生作用：金 属纳米粒子本身具有较强的催化活性，对于氧化还原反应具有催化作用；根据金属 原子簇所包含的原子数少到一定数目时，颗粒本身具有从周围体系中吸取电子而被 还原的特性，因而在g o d 的反应中，纳米颗粒迅速从被还原的g o d ( f a d h 2 ) 获取电 子而使g o d 重新具有氧化性，从而加速了酶的再生速度，提高了酶电极的响应灵敏 度；纳米颗粒巨大的比表面积和较高的表面自由能使大量的g o d 牢固地吸附在纳米 颗粒表面，并在一定程度上纯化了酶的构型，使其不易发生进一步变化而保持活性， 研究制得的a g n p 粒径约1 0 r i m ，与g o d 分子尺寸差不多，它有可能与g o d 内部的f a d 亲水基团作用，引起g o d 构型上的变化，从而使g o d 的活性中，c , , f a d 暴露出来，更 容易与底物结合，从而增加了酶的稳定性和催化活性：a u n p 具有良好的生物相容性， 能够充当固定酶的基底，并且具有良好的导电性，它既可以在电极表面和酶活性中 心之间扩散，又往复传输电子，从而加速g o d 与电极间的电子传递，改善酶电极的 性能。陈洪渊【舳l 课题组把壳聚糖( c s ) 、a u n p 和g o d 一起电沉积于金电极上，发现 a u n p 具有很强的固定酶的作用。s u n 课题组，利用金纳米粒子通过自组装【4 5 l 和s o l - g e l 法固定g o d i z l ，固定g o d 的量分别为4 1 1 0 d 2 m o l c m 2 和4 5 x 1 0 q 2 m o l c m 2 ，比不用 a u n p 时，提高了2 4 倍。w i l l n e r t 47 1 课题组通过自组装把n 羟基琥珀酰亚胺功能化的 a u n p ( 1 4 r i m ) 、f a d 和g o d 固定在金电极上，如图1 4 ，研究发现，能实现葡萄糖氧 化的直接电子转移，且电子交换速率有显著的提高。有无金纳米粒子的电子交换速 图1 4 自组装金纳米粒子和g o d 电极 率分别是5 0 0 0 s 1 和7 5 0 s 。沈国励【4 8 i 课题组通过电沉积，铂纳米线阵列生长在聚碳酸 酯膜上，再吸附g o d 构建了葡萄糖酶电化学生物传感器，检测电位低( o v ) 。灵敏度 高；应用纳米z r 0 2 和c s 包埋g o d 制各了葡萄糖酶电化学生物传感器，酶的活性是用 1 2 戊二醛交联的5 0 2 倍，灵敏度为o 0 2 8 i a m m o l l 4 9 。唐芳琼例利用银纳米粒子( a g n p ) 构建了葡萄糖酶生物传感器，疏水性a g n p 对响应电流的增强作用大于亲水性a g n p 。 陈洪渊l 州1 课题组应用纳米m n 0 2 构建的葡萄糖酶传感器( m n 0 2 n p c s g o d ) 可在维生 素c 存在下无干扰检测葡萄糖；利用层层组装技术( l b l ) ，制备了由纳米普鲁士蓝 ( p b n p ) 和g o d 组成的葡萄糖传感器，检测电位为o i v 5 2 1 ；还合成了纳米苯二甲蓝钴 ( c o p c n p ) 溶胶，与g o d 混合修饰在石墨电极( p o e ) 上，并覆盖一层n a f i o n 膜，在0 5 5 v 电位测定葡萄糖，无干扰【5 3 1 。陈文长v 4 1 利用纳米f e 3 0 4 吸附铁氰化钾和g o d ，固定在 丝网印刷碳电极( s p c e s ) 上，检测葡萄糖的灵敏度达到1 7 4 9 a m o l l 。薛怀酬”j 应用 纳米c a c 0 3 溶胶包埋g o d ，表现出良好的热稳定性，检测葡萄糖响应时间短( 6 s ) 。j u 【5 6 1 利用电沉积方法在g c e 上沉积银d n a 杂化纳米粒子( a g d n a n p g c e ) ，用聚乙烯醇 ( p e g ) 、2 - ( 3 a 环氧己烯基) 乙基四甲氧硅烷( e p o x y ) 和3 一氨基丙基三乙氧基硅烷 ( a p t e s ) 与g o d 混合，滴涂在a g d n a n p g c e 上，构建了葡萄糖生物酶传感器，在 很低的电位f 0 3 v ) 下，检测葡萄糖，具有较高的灵敏度( 3 8 3 t a e m 2r e t o o l l ) 。 i 2 2 基于碳纳米管的葡萄糖酶电化学生物传感器 1 9 9 1 年，日本科学家l i j i m a 用高分辨透射电境( t e m ) 对真空电弧蒸发石墨电极 上的产物进行研究，发现具有纳米尺寸的多层管状物，即多壁碳纳米管 ( m w c n t s ) t 5 7 1 。1 9 9 3 年又发现了单层碳纳米管( s w c n t ) t 卯1 。碳纳米管( c a r b o n n a n o t u b e ，c n t ) 是由碳六元环构成的类石墨平面卷曲而成的纳米级中空管，其中每个 碳原子通过s p 2 杂化与周围3 个碳原子发生完全键合，各单层管的顶端有五边形或 七边形参与封闭。碳纳米管的径向尺寸为纳米量级，轴向尺寸为微米量级，具有较 大的长径比。根据c n t 中碳原子层的数目不同，分为单壁和多壁碳纳米管，如图l - 4 所示。s 、n t 由一层石墨片卷曲而成，管径一般为l - 6 n m ，长度一般可达数十微 米，甚至长达2 0 c m 的s w c n t ，与m w c n t s 相比，s w c n t 具有直径分布范围小， 缺陷少，更高的均匀一致性等特点。s w c n t 存在3 种类型的可能结构，分别为单 臂碳纳米管、锯齿形碳纳米管和手性碳纳米管；m w c n t s 由多层柱状碳管同轴卷绕 构成，层数2 5 0 之间不等，层与层间距约为0 3 4 r i m ，其典型的直径和长度分别为 2 - 3 0 r i m 和0 1 - 5 0 1 m a 。因合成条件的不同c n t 的内径可控制在1 0 n m 左右，外径达几 十个纳米，轴向长度却可达几十微米甚至更长，纵横比在i 0 0 1 0 0 0 范围间。c n t 独 特的理化性质如导体和半导体性质、极高的机械强度、良好的吸附能力、较大的比 表面积和长径比、较多的催化位点等优点，已成为继纳米金之后在电化学生物传感 器中广泛应用的又一新型的纳米材料 2 1 , 2 s 3 9 - 6 0 1 。 圈1 - 5s w c n t ( 左) 和m w c n t s ( 右) 的结构 在制备传感器时，先要对c n t 进行纯化和功能化，并要考虑到分散性。c n t 的纯化： 在c n t 的粗产品中包括无定型碳，金属催化剂，还有部分富勒烯等杂质，所以在使 用前都必须纯化处理，方法主要有：利用氧化剂氧化无定型碳及金属催化剂，再通 过酸化除去金属催化剂，氧化剂可以是直接在氧气氛围内加热氧化【6 1 1 ，也可以通过 强氧化性酸 6 2 1 进行回流处理；或先通过酸化除去大部分的金属催化剂，再利用氧化 反应氧化无定型碳 6 3 1 。在除去无定型碳及金属催化剂后，可以对c n t 在超过1 0 0 0 下进行真空退火处理，可以除去纯化步骤所引起的表面缺陷1 6 4 1 。c n t 的功能化对 i l t t - 6c n t 在硝酸处理前的结构( a ) ，硝酸处理后的结构( b ) ，g o d 连接在c n ti - ( c ) 其在生物传感器的构建具有重要意义。最常用的方法是将c n t 在一定浓度的 h 2 s 0 4 h n 0 3 混合酸中进行回流或超声f 6 5 1 ，这使得c n t 的富勒烯半帽形区被打开并 且在c n t 管壁制造了空穴，长度落在1 0 0 n m 3 0 0 n m 之间，氧化后的c n t 能产生大 1 4 量的羟基和羧基，这些亲水基团的存在有利于酶活性的保存并能够提供适合生物体 反应的微环境。另外，羧基化后的c n t 还可以通过衍生化反应构造其它的官能团。 羧基化后的c n t 可以通过下列反应交联形成酰胺和酯，进一步再功能化， s w c n t - c o o h + s o c l 2 一s w c n t - c o c i ，s w c n t - c o c i + c h 3 ( c h 2 ) i s n h z s w c n t - c o n h ( c h 2 ) 1 5 c h 3 ，这对于蛋白质，酶等交联修饰并构建生物传感器具有重 要作用1 6 6 1 ，例如w a n g 6 7 利用羧基化的m w c n t s 吸附g o d ，如图1 - 6 ，构建了葡 萄糖酶生物传感器。羧基的存在也使得c n t 之间范德华力下降，减少碳纳米管的团 聚现象，有助于c n t 在溶剂中的分散。c n t 稳定地均匀分散可使其在构建传感器时， 在电极上能均匀分布，这有利于酶的固定和电子的传递。c n t 的分散方法可以分为 三种：单一溶剂直接分散，如水、乙醇、氯仿、甲苯四氢呋喃等；可以通过表面活 性剂对c n t 进行分散，例如蔡称心删和w a n g 唧1 分别通过溴化十六烷基三甲基 ( c t a b ) 和n a t i o n 分散c n t 制各了葡萄糖酶生物传感器；利用大分子化合物对c n t 进行分散，如g o r s k i 课题组 7 0 1 利用生物相容性大分子壳聚糖实现了对c n t 的分散， o 5 的壳聚糖可以均匀地分散o 5 3 m m l 的c n t ，这对于c n t 结合各种各样的酶， 进而对生物分子进行检测成为可能。总之，c n t 的纯化，功能化，分散是c n t 用于 生物传感器的重要预处理步骤。对于功能化而言，可以从有机化学的思路利用c n t 表面结构的缺陷修饰各种官能团，用于与其它生物分子的结合；另外功能化的c n t 也可以利用自身的空间效应减少c n t 间范德华力的作用，阻碍c n t 的团聚。c n t 的分散问题涉及到实验过程中的重现性，分散良好的体系也有利于化学试剂与c n t 表面的接触，进而实现进一步修饰，可见功能化与分散两者的作用是相互相承的。 c n t 电化学催化的机理，c o m p t o n 7 1 , 7 2 1 课题组对c n t 修饰电极的电化学催化机理 进行探讨，比较了c n t 修饰的高序热解石墨( h o p g ) 电极与石墨粉修饰h o p g 电极的 电化学行为。提出c n t 的电化学催化与表面缺陷的关系模型。将c n t 开放的管端可 以看成是边界面( e d g e p l a n e ) ，把管壁看成基平面( b a s a l p l a n e ) ，如图l 一7 ( 左) 。c n t 修 饰电极就是这种混合电极的阵列。b a s a l p l a n e 具有与h o p g 裸电极相似的性质，在电 活性物质里面得到比较平缓的氧化还原峰，e d g e p l a n e 贝f j 与超微电极相仿，氧化还原 峰尖而细。在宏观操作中，可以把c n t 修饰电极看成是这两种电极有机结合的结果， 如图1 7 ( 右) 。根据这个模型，只要能在电极表面制造相似的表面缺陷，就会具有相 近的电催化性质。进一步通过研究，发现石墨粉修饰电极及c n t 修饰电极对肾上腺 素的催化效果非常相近，这很可能是因为石墨粉同样能在电极表面制造与c n t 相类 似的表面缺陷所致。c n t 大的比表面积，良好的导电性和电催化活性，可以功能化 的表面缺陷，惰性的内表面，使得c n t 在电化学中的应用与构建酶生物电化学传感 器，具有良好的性能。 图1 7 石墨粉和c n t 的e d g e p l a n e t u b a s a l - p t a n e ( 左) ，石墨粉 和c n t 修饰电极在l m m o l l 的铁氰化钾中的伏安循环( 右) 碳纳米管修饰的电极具有良好氧化还原可逆性：将m w c n t s 悬浊液滴加于处理 后的玻碳电极表面，待溶剂挥发后形成m w c n t s 修饰电极。在p h 6 3 的磷酸缓冲液中 ( o i m o u l ) 进行循环伏安扫描。m w c n t s 修饰电极有一对氧化还原峰，且峰电流与 扫描速率成正比，表明这是一对表面波。随着底液的p h 值增加，蜂电位会发生负移， 说明电极反应有质子参加。峰电位的变化值与p h 值之间存在一直线关系且该直线方 程的斜率为6 4 m v p h ，表明参加电极反应的质子数与电子数相同。这一表面波来自 于c n t 表面羧基的氧化还原，并且是一个4 电子，4 质子的电极反应过程。其电极反 应式表示如下：氧化还原过程：m w c n t s - c o o h + 4 e + 4 h + m w c n t s c h 2 o h + h 2 0 。将c n t 修饰电极和玻碳电极分别在0 1 m o l 的亚铁氰化钾溶 液中作循环伏安扫描。亚铁氰化钾铁氰化钾电对是接近理想状态的准可逆电对，对 于一个具有理想表面状态的电极来说，它的峰电位差( a e p ) 接j 丘5 9 m v ( 2 5 0 c ) 。经过仔 细处理后的玻碳电极的a e p 为8 7 m v ，而碳纳米管修饰电极的艮仅) q 6 4 m v 。表明c n t 修饰电极的表面结构更接近于理想状态t 7 3 i 。 碳纳米管可降低氧化还原反应的过电位，提高检测的灵敏度：w a n g 等a l l 4 】用碳 纳米管与聚四氟乙烯颗粒( t e f l o n ) 和g o d 混合构建葡萄糖生物传感器( c n t t e f l o r d c k ) d ) ，研究发现，该电极在较低的电位下对葡萄糖有显著的电催化活性，表明t e f o n 1 6 与c n t 的粘结并未削弱c n t 的电催化性能；同时制备了石墨粉、t e f l o n 和g o d 混合的 电极( g r a p h i t e t e f l o n c o d ) ，比较了两电极在不同的工作电位下对葡萄糖的响应电 流，发现前者在0 1 0 6 v 范围内具有良好的电流响应，而后者只有在0 6 v 有一很弱的 响应电流，如图1 8 ，表明c n t 能显著的降低氧化还原反应的过电位并具有优异的电 化学性能。又如w a n g 6 7 】利用c n t 吸附g o d 方式，制备了a l | c n t g o d 传感器，如图 1 - 9 ，在+ o 4 5 v 时对葡萄糖有灵敏的响应，而裸g c e 电极在该电位几乎无响应。 琏文|憾黑 图1 - 8g r a p h i t e t e f l o n g o d ( a ) 和m w c n l 丌e n o n ，g o d ( b ) 对2 m m o l l 葡萄糖的时间一电流曲线，应用电位0 6 v ( a ) 和0 iv ( b ) 图1 9a u m w c n t s - g o d ( 左) ，在0 4 5 v 对2 m m o l l 葡萄糖的响应曲线( 右) a n m w c n t s 4 7 j o d ( a ) ，a l | ( b ) 利用碳纳米管增强酶的固定化能力和活性：c n t 特殊的中空管状结构具有较大 的比表面积，经酸处理后的c n t 具有更多的活性位点，功能化的羧基容易与蛋白质 上的氨基结合，因而将c n t 用于酶分子的固定，可以增加固定的分子数量，从而增 强反应信号。碳纳米管对生物分子活性中心的电子传递具有促进作用，能够提高酶 1 7 ：”蛐拍拈址唱埔惦酗 ；a 分子的相对活性。同浓度下，c n t 修饰电极的比表面积大，离子扩散阻碍相对石墨 电极小，电子传递更快，所以电极表面的离子浓度更低，扩散速度更快，因而响应 电流更大。w a n g 6 1 利用h n 0 3 和h f 的混合液打开m w c n t s 的顶端，得到开端的c n t ， 再将其浸入在含g o d 的缓冲溶液中，使g o d 吸附在m w c n t s 的表面和进入其中空管 内，如图1 6 ，固定化的g o d 具有很好的稳定性，在4 0 c 的磷酸盐缓冲溶液中储存4 个 月后，仍然能够保持初始活性的8 7 。g u 锄【7 4 l 利用m w c n t s 功能化的羧基与g o d 的 氨基经过一步交联反应，可稳定的固定g o d ，如图1 1 0 。d o n g 7 s ) 利用m w c n t s 与 离子液体( i l ) 混合修饰到玻碳电极上，再吸附g o d ，构建了g o d c n t i l g c e 传感器， 删铲嚼 g o d 的表面吸附量为( 3 7 7 ：- - 0 3 5 ) x 1 0 “m o l c m 2 ，在缓冲溶液中经过5 0 0 圈的连续伏安 循环扫描，其伏安循环响应曲线仍然保持稳定，在4 0 c 的磷酸盐缓冲溶液中储存l o 天 后，仍然能够保持初始活性的9 2 ，表明该传感器固定的酶量大且稳定。于巧玲【2 0 1 利用二茂铁( f c ) 分子内大楗与c n t c o o h 的s p 2 杂化形成的6 元环，以兀兀电子的形式 相互重叠相互作用，固定在电极上，再应用葡萄糖氧化酶( g o d ) 的氨基与羧基相互作 用，来固定g o d ，制备了g o d f c c n t 传感器，其表观米氏常数 ，m 狮= 1 7 7 1 0 “ m o f l ，说明固定在c n t 上的g o d 对葡萄糖的亲和力较大，仍能保持良好的活性。 d a v i s l 7 6 1 成功的将g o d 物理吸附在氧化过的s w c n t 上，并测试了经g o d s w c n t 改 性的玻碳电极的伏安性质，发现其催化响应电流信号比未用s w c n t 修饰的玻碳电极 大1 0 倍，表明固定化的g o d 具有良好的活性，并通过原子力显微( a f m ) i 羽像分析表 明，g o d 与s w c n t 问的吸附结合相当强。 利用碳纳米管可进行直接电子传递：电流型酶传感器是生物传感器领域中研究 最多的一种类型。它所要解决的中心问题就是使反应能够在恒电位下快速进行，将 电子从反应中心转移到电极表面，形成响应电流。解决生物活性中心与电极表面问 的电子转移问题是电流型生物传感器成功的关键。第一代电流型酶传感器是以氧为 电子传递介体的，具有背景电流大、响应特性差、易受环境中氧浓度的影响、干扰 大等缺点。第二代电流型酶传感器用一些非生理的氧化还原媒介体代替氧，加强了 酶与电极间的电子传输，起到了酶与电极间的电子开闭器作用，加速了电极反应， 降低了环境干扰，克服了第一代电流型传感器的上述缺点，但其中的氧化还原媒介 体容易流失。利用酶与电极之间的直接电子传递来构建第三代酶传感器，它不仅可 以帮助我们理解氧化还原行为的内在规律，还可用于开发出无介体型生物传感器。 g u i s e p p i e l i e 等人【7 7 1 研究了葡萄糖氧化酶在s w c n t 上的直接电子传递，提出了以下 假说。在g o d 的吸附过程中，由于s w c n t 的纳米级拓扑结构以及和酶具有相似的长 度尺寸，允许酶吸附且不会改变其整体的生物学形状和功能，并且s w c n t 靠近酶的 活性中心，在其电子隧道距离以内。这种情况和用一根长的尖锐的针刺入气球，而 球并未破裂类似。针一旦刺入了球的外皮，就能与球的内部发生相互作用。同样， 一些s w c n t 能够刺穿包裹在g o d 的糖蛋白外壳，达到氧化还原活性中心，进行直接 电子传递，而这在普通电极表面是难以做到的。蔡称心【2 5 ，删用c t a b 分散c n t ，再与 g o d 混合，滴加在玻碳电极上，制备了g o d c n t g c 电极，该电极在0 1 m o l lp b s ( p h 6 9 ) 溶液中循环扫描得到c v 曲线，发现g o d 直接电子转移反应的氧化还原峰电位分 别为e ；产o 4 3 8 v ，e p c = - 0 4 7 4 v ，a f p = 3 6 m v 。是一对几乎对称的氧化还原峰，然而， 若将该电极浸在3 m o l l 盐酸胍溶液经2 4 h 后，则原来的氧化还原峰便几乎消失，由此 推想，这一对氧化还原峰的出现当归属于g o d 分子中的氧化还原活性d e ( f a d ) 与电极 表面发生直接电子转移所产生的，b p g o d 分子在c n t g c 电极表面的固定过程中， f a d 并没有从分子内部脱落出来。因为浓的盐溶液( 如3 m o l l 盐酸胍溶液) 虽然能将 f a d 从g o d 分子内部剥离出来并使固定在电极表面的g o d 分子发生完全的脱附而失 去电化学响应，但却不能使吸附在电极表面自由的f a d 分子( 相对于g o d 分子内部的 f a d 而言) 完全脱落。当用n a t i o n 将f a d 固定在c n t g c 电极表面形成的f a d c n t g c 电极在盐酸胍溶液浸泡4 8 h 后，其伏安响应还能保持浸泡前的6 8 ；即使浸泡1 2 d 后， 仍能保持2 4 。这迸一步说明，g o d 分子吸附在c n t g c 电极表面的过程中，其氧化 还原中心没有脱落，分子没有变性。 利用碳纳米管可制备阵列型c n t 修饰酶传感器：一般情况下制取c n t 时，c n t 是自由生长，会发生随意弯曲，并互相缠绕，这无论对其性质研究，还是对其实际 应用，都造成了很大的影响。因此，制备取向高度一致、管径均匀、不含杂质的c n t 阵列成为一个热门课题，而这些c n t 阵列具有优异的电学性能，是制作高灵敏性酶 传感器的重要材料。w a l l a c e 7 8 1 课题组在高温下进行热解，制得在石英玻璃基底上垂 1 9 直生长的c n t 阵列。先在c n t 阵列上溅射一层a u 薄膜，再通过电沉积方法，把g o d 和吡咯沉积在阵列c n t 上，形成一层电聚合物( p p y ) 包埋g o d 的膜，制得了一高灵敏 度和高选择性的葡萄糖酶生物传感器。s o t i r o p o u l o u 等t 7 9 l 报道了通过c v d 方法，在p t 基体上生长出c n t 阵列，分别利用酸和空气氧化c n t ，使其端口羧基化，再吸附固 定g o d ，制备了电流型葡萄糖酶生物传感器，实验结果表明酸化法制得的c n t 酶传 感器在灵敏度、线性范围以及使用寿命上都大大优于空气氧化法制得的c n t 酶传感 器，这是因为酸化更利于使c n t 开口和形成羧基，为酶进入c n t 内部及其固定提供 了稳定的环境；通过在无氧环境下分析c n t 的电子传输能力，发现缺氧并不影响酶 的催化性能，c n t 阵列同时起着固定酶和电子媒介的作用。l o h t 即1 用钴作催化剂，在 图1 1 1c n t - n e e s 的构建 钽片基体上，通过c v d 方法生长出m w n t 阵列，再固定于普通的p t 工作电极上，然 后通过电极表面聚合的3 ，3 - 二氨基联苯胺( d a b ) i 舌i 定g o d ；他们用金刚石与m w n t 作了对比，发现m w n t 的修饰效果远优于金刚石的修饰效果，通常检测过氧化氢时 需外加较高的电压，使抗坏血酸、尿素等在此电位上也被氧化；而使用d a b 作为氧 化还原中间体，则大大降低了氧化电压，避免了干扰物的影响；推断，m 、w n t s 同 时起着传递电子和降低工作电压的作用。若c n t 阵列中的每根c n t 之间互不缠连， 且间隔足够远，则可制作由数百万根纳米电极构成的纳米电极阵列州锄oe l e c t r o d e e n s e m b l e s ，n e e s ) ，它所产生的感应电流与电极数量成正比，因此n e e s 在信噪比和检 出限上都有极大提高，l i n 等【8 1 1 在复盖铬的硅基体的表面定向生长c n t 纳米电极阵 列。再利用c n t 管端的羧基通过交联固定g o d ，制备了葡萄糖酶生物传感器，如图 1 1 1 ，该传感器在低电位下( 0 2 v ) 能很好地把葡萄糖与其它干扰物区别开来，具有良 好的选择性。 1 2 3 基于纳米金属及其化合物与碳纳米管协同作用的葡萄糖酶生物传感器 纳米金属及其化合物具有良好的生物相容性和催化活性，广泛应用于生物传感 器，但由于纳米金属及其化合物易受到污染和腐蚀泄露，这对传感器的稳定性和响 应带来不利。而纳米金属及其化合物与c n t 相结合，由于c n t 具有较高的比表面和 催化活性，使得纳米金属及其化合物具有较高的分散性，导致这复合纳米材料具有 很好的催化活性和稳定性。两者的结合，制备生物传感器，发挥其良好的协同作用， 使得传感器的活性面积进一步增加，更加稳定，而且灵敏度更高、选择性更好并具 有良好的重现性等，成为了近几年来研究的热点。 贵金属如p t ，对许多化学反应都有很高的催化活性，在微电极上沉积纳米级p t 薄膜能增加电极的表面积，从而加强物质的传输，可制成更宽检测范围的传感器， 修饰在c n t 上更加体现了其优良的催化活性，制备的传感器性能明显的得到改善。 l u o n g 【3 2 l 先采用氯铂酸与柠檬酸钠反应制得粒径为2 7 i l l i l 左右的纳米铂( p t n p ) 颗粒， 然后利用n a t i o n 对碳纳米管的良好分散，经湿法与溶胶p t n p 混合，贝i | p t n