（制糖工程专业论文）抗凝血微晶纤维素硫酸酯的制备及其构效关系研究.pdf

摘要 缡要 爨蘸，摅凝痰药甥凌蝰痰帮医翔意分子奉孝辩镁域都鸯广泛应瘸。鉴予常罱抗 凝血药物艇素具褥一定剥佟用，毫教黪素替代品的磅究委弓| 起广泛关注。开发舆 有抗凝血涯一睦的缍维素徼生物不但符合生态环境科学发晟趋势，星霹键述纤维豢 功能化研究的发展。 本研究根据多糖类肝素分予量的特点，选取分子爨较，l 、的纤维豢产熬一一微 晶纤维素( m c ) 为服料，制各了具有突如抗凝血活性的微晶纾维素硫黢酸镳鼓 ( n a c s m c ) ，在对n a 。c s m c 的结构与抗凝血效果进行研究的基础上，揭示了受 电荷密度、含硫缴、硫酸酯基取代度、特性粘度、分子量和溶液构象等结构条侈 对n a - c s m c 抗凝舰活性的影响规律，并对n a c s m c 的抗凝血机理作了研究。主要 研究内容和结论如下： 1 确定n a c s m c 的简便、高效制各工艺并对其抗凝血活憷进行表征 通过m c 的没润、酗化剂的制备、硫酸酯化反应和产物质处理等四个步骤， 制备了n a ，c s m c 。以临床上常用的三个凝血指标，即全血复钙时间( r t ) 、活化 部分凝血活酶时间( a p t t ) 和凝血酶时间( t t ) 作为n a ，c s m c 抗凝衄活性的评 价指标，通过优化，得到分别使r t 、a p t t 和t t 达到最大值的制备条件。并通 过珏c n m r 结构分析，揭示了n a c s m c 中硫酸酯基分布情况为c 6 位完全取代和 c 2 位部分取代。 2 研究n a c s m c 的抗凝瓶活性与其结构特性的关系及其规律性 采用臻艏糖凝胶龟泳分祈、凝胶过滤和离予交换分离，获得具有不同硫酸酯 取代度的n a c s m c ，轿究了负电荷密度和硫酸酯取代度与其抗凝啦活性的关系。 结巢表明，受电荷密发越大或硫酸醅取代度越商，n a c s m c 对a p t t 和竹的延 长俸用越突出、对凝盘因予h a 帮x a 活性酩棉制彳管用越强。 聚究7 分予量、特性鞑度( 阳】) 耪溶液构象等与n a c s m c 抗凝血活性的关系。 结巢表唆，分子量越大，n a - c s m c 抗凝盘活性越强；阳】在1 0 9 0 9 m l 范围肉， a p t t 积t 譬均隧秘】增艇褥增大，在9 0 1 3 i g m l 藏匿内，a p t t 隧阳】静增加呈 下降趋势；指如n a - c s m c 瓣槐象爨褰级螺旋转能为低级螺旋结构，可一定程度撬 毫其抗凝血活性。 采用定向磙酸酝他法勰i r 、”c n m r 等结稳分婿方法，揭暴了巯羧酯基取代 模式与n a c s m c 抗凝呶活性的关系。发瑰c 2 位菝酸黪基不仅具有突出兹攘裁x a 活性的作用，且对c 6 位硫酸照基抑制i i a 活性和延长t t 鬟鸯增强效癍。 华南理工大学工学博士学位论文 3 探讨n a - c s m c 的抗凝盘效果及葜终用机理 将n a - c s m c 的抗凝血效果与野素进行比较，显示n a c s m c 对r t 、a p t t 的 延长作用和对x a 活性的抑制作用比胖素更强。分别在不同体系中研究了n a - c s m c 对i i a 和x a 活性的拇制作用，揭示了n a c s 凇主要是通过a t n i i i a 和a t i i i x a 途径产生抗凝血作用的机理。 关键词：微摄纤缝素；纾缍素硫酸酯；抗凝血；构效关系 毪 a b s t r a c t a tp r e s e n t ，a n t i c o a g u l a n t sh a v eb e e nb r o a d l yu t i l i z e di nb o t hc l i n i ca n dm e d i c a l m a c r o m o l e c u l a rm a t e r i a lf i e l d s h o w e v e r , t h e r ea r es o m es i d ee f f e c t sw i t hh e p a r i n ， w h i c hi sac o m m o na n t i c o a g u l a n t t h e r e f o r e ，t h ed e v e l o p m e n to fl l e w s u b s t i t u t e d a n t i c o a g u l a n t sf o rh e p a r i nh a sa t t r a c t e dm u c h a t t e n t i o n ，t h ee x p l o i t a t i o no fc e l l u l o s e d e r i v a t i v e sw i t h a n t i c o a g u l a t i o n a c t i v i t y w i l lm e e tt h et r e n do f e c o l o g i c a l e n v i r o n m e n ts c i e n c ea n d h e l p t o b r i n g a b o u ta l la d v a n c ei n c e l l u l o s e f u n c t i o n a l i z a t i o n r e g a r d i n gt o t h em o l e c u l a rw e i g h tc h a r a c t e r so fp o l y s a c c h a r i d eh e p a r i n o i d s ， m i c r o c r y s t a l l i n ec e l l u l o s e ( m c ) w i t hl o w e rm o l e c u l a rw e i g h tw a su s e da ss t a r t i n g p o l y m e rf o rp r e p a r i n go fm i c r o c r y s t a l l i n ec e l l u l o s es u l f a t es o d i u m ( n a - c s m c ) w i t h h i g ha n t i c o a g u l a t i o na c t i v i t y i tc a nb es e e nf r o mt h er e s u l t st h a tt h ea n t i c o a g u l a t i o n a c t i v i t y o fn a c s m cw a si n f l u e n c e db yt h es t r u c t u r ec o n d i t i o n s ，s u c ha sa n i o n i c d e n s i t y ，s u l f u rc o n t e n t ，s u l f a t i o ns u b s t i t u t i o nd e g r e e ，i n t r i n s i cv i s c o s i t y ，m o l e c u l a r w e i g h ta n di t sc o n f o r m a t i o ni ns o l u t i o n t h ea n t i c o a g u l a t i o nm e c h a n i s m o fn a c s m c w a sd i s c u s s e d t h em a i nc o n t e n t sa n dr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 f i n do u tas i m p l e ，e f f i c i e n tp r e p a r i n gr o u t ef o rn a c s m ca n dc h a r a c t e r i z a t i o nf o r t h ea n t i c o a g u l a t i o na c t i v i t yo fn a c s m c n a - c s m cw a sp r e p a r e db yf o u rs t e p si n c l u d i n gm ci m m e r s i o n ，t h es u l f a t i o n a g e n tp r e p a r a t i o n ，s u l f a t i o n a n d p r o d u c t a f t e r t r e a t m e n t t h r e ei n d e x e si n c l i n i c ， i n c l u d i n gr e c a l c i u mt i m e ( r t ) ，a c t i v a t e dp a r t i a lt h r o m b o p l a s t i nt i m e ( a p t t ) a n d t h r o m b i nt i m e ( t 玲w e r eu s e da st h ee v a l u a t i o nc r i t e r i o nf o ra n t i c o a g u l a t i o na c t i v i t y o fn a - c s m c t 魏ep r e p a r i n gc o n d i t i o n sw e r e o p t i m i z e df o rm a x i m i z i n g r t a p t ta n d t t i tw a sf o u n df r o m ”c n m rt h a tt h es u l f a t er a d i c a li nn a - c s m cw a so fc o m p l e t e s u b s t i t u t i o na tc 6a n d p a r t i a ls u b s t i t u t i o na tc 2 。 2 s t u d yo nt h es t r u c t u r e a n t i c o a g u l a t i o na c t i v i t yr e l a t i o n s h i po fn a c s m c n a c s m c w i t hd i f f e r e n ts u b s t i t u t i o nd e g r e e d s ) o fs u l f a t er a d i c a lw e r e p r e p a r e d a n dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e na n i o n i cd e n s i t y ，d sa n da n t i e o a g u l a t i o na c t i v i t yw e r e s t u d i e d b yu s i n ga g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s ，g e l f i l t r a t i o nc o m b i n e dw i t hi o n e x c h a n g es e p a r a t i o n t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tw i t ht h ei n c r e a s i n go fa n i o n i cd e n s i t y a n dd s ，t h ep r o l o n g a t i o no fa p t ta n dt t ，t h ei n h i b i t i o no fn a c s m co nt w o a n t i c o a g u l a t i o nf a c t o r si i aa n dx a w e r ei n c r e a s i n g m 华南理工大学工学博士学位论文 _ - _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ e e _ _ 口_ _ _ 一i i i i i _ _ _ _ - _ l t h er e l a t i o n s h i p sb e t w e e nm o l e c u l a rw e i g h t ( m w ) ，i n t r i n s i cv i s c o s i t y n 】， c o n f o r m a t i o ni ns o l u t i o na n da n t i c o a g u l a t i o na c t i v i t yw e l s t u d i e d 。r e s u l t si n d i c a t e d t h a tt h ea 娃t i c o a g u l a t i o nw a si m p r o v e dw i t ht h ei n c r e a s eo fm w 。a p t ta n dt tw e r e p r o l o n g e dw i t ht h e i n c r e a s e o f n 】v a r y i n g i n l o - 9 0 m l g ，w h i l et ts h o w e da d e c r e a s i n gt e n d e n c yw i t ht h ei n c r e a s eo f 【n 】v a r y i n g i n9 0 - 1 3 0 m l g i tw a sp o i n t e d o u tw h e nt h ec o n f o r m a t i o no fn a - c s m cw a st r a n s f e r r e df r o m h i g h l e v e lh e l i c a lt ol o w l e v e lh e l i c a l 。t h ea n t i c o a g u l a t i o na c t i v i t yo fn a c s m cc o u l db ee n h a n c e dj ns o m e e x t e n t ， t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ns u l f a t i o ns u b s t i t u t i o n p a t t e r n s a n d a n t i c o a g l l l a t i o n a c t i v i t yw a sf o u n db ya d o p t i n gr e g i o s e l e c t i v es u l f a t i o n ，i ra n d “c n m r t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h e r ew e r en o to n l yas t r o n gi n h i b i t i o no fs u l f a t er a d i c a la tc 2o nx a 。b u t a l s oo nh aa n dt h ep r o l o n g a t i o no ft tf o rc 6s u b s t i t u t i o n 3 i n v e s t i g a t i o no fa n t i c o a g u l a t i o ne f f i c a c ya n dt h ea n t i c o a g u l a t i o nm e c h a n i s mo f n a - c s m c t h e p r o l o n g a t i o no f r ta n da p t t ，t h ei n h i b i t i o n so nx aw e r es t r o n g e rt h a nt h a t o fh e p a r i nb yc o m p a r i n gt h e i ra n t i c o a g u l a t i o ne f f i c a c y t h ei n h i b i t i o n so fn a m c s m c o i li i aa n dx ai n v a r i o u s s y s t e m s w e r e a n a l y z e d i t w a s r e g a r d e d t h a tt h e a n t i c o a g u l a t i o nm e c h a n i s mo fn a - c s m cm a yb em a i n l yv i aa t i i i l l aa n da ti i i - x a p a t h w a y k e y w o r d s ：m i c r o c r y s t a l l i n ec e l l u l o s e ，c e l l u l o s es u l f a t e ta a t i c o a g u l a t i o n ，s t r u c t u r e a c t i v i t yr e l a t i o n s h i p ， i v 华南理工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研 究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用黪内容外，本论文 不包含馁何其他个入或集体已经发表或撰骂的成果佟品。对本文的研 究做出耋要贡献的个入和集体，均已在文中以明确方式标鲳。本入完 全意识到本声明的法律后采由本人承担。 作者签名： 了耐每 日期：2 0 0 3 年0 6 月1 3 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权华南理工大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 接等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，槎年鼹密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密翻。 ( 请在以上相应方框内打“4 ”) 作者签名： 导师签名： 移渺 日期：2 0 0 3 年0 6 月1 3e | 日期：2 0 0 3 年0 6 月1 3 日 文中重要代号的索号l 代号英文全称 含义 a c d a g u a t i i i a p t t a d ( h ) a d ( 醅) a d ( m ) c t a c t b d m f d s d s e d s n 融# d s o 4 6 d s 0 9 1 d s l 1 3 l m w 热 m c m w ( u m w ( m ) m w ( h ) n a 。c s m o a m i c i t r a t e dd e x t r o s e a n 酶d r o g l u c o s eu n i t a n t i - t h r o m b i ni i i a c t i v a t e dp a r t i a lt h r o m b c i p l a s t i nt i m e a n i o n i cd e n s i t y ( h i g h ) a n i o n i cd e n s i t y ( m i d d l e ) a n i o n i cd e n s i t y ( l o w ) a f t e rc o n f o r m a t i o nt r a t t s f o r m a t i o n b o f o r ec o n f o r m a t i o n1 h n 8 f o r m a t i o n d e g r e eo fs u b s t i t u t e d s ( e l e m e n t a la n a l y s i s ) d e g r e eo fs u b s t i t u t eo f 0 4 6 d e g r e eo fs u b s t i t u t eo f0 9 1 d e g r e eo fs u b s t i t u t eo f0 9 1 l o wm o l e c u l a rw e i g h t h e p a r i n s m i c r o c r y s t a l l i n ec e l l u l o s e m o l e c u l a rw e i g h t ( l o w ) m o l e c u l a rw e i g h t ( m i d d l e ) m o l e c u l a rw e i g h t ( h i g h ) n a - c s m ，。， n a - m c s n a - m c s ( c 6 ，2 s ) n a - m c s ( c 6 s ) n a - m c s f c 2 s ) h ei i h e p a r i nc o f a c t o ri l p tp r o t h r o m b i nt i m e r tr e c a l c i u mt i m e p l y a - m e t t t h r o m b i nt i m e 鞫橼敞铺抗凝( 全斑) 脱水麓葛糖萃嚣 抗凝血酶l i l 活化部分凝血活酶时问 商负电荷密度 中等负电衙密度 低受电荷密度 构聋转化菇 构象转化前 n 。n 一二甲基甲酰胺 ( 硫酸酯基) 取代度 幽元素分析法测得的取代度 虫棱溅共摄法测褥盼取代度 取代度为0 4 6 取代度为0 , 9 1 取代度为1 1 3 低分予量群素 馓磊终维素 低分子量擞晶纤维索硫酸穗 中等分子量微晶纤维素硫酸酪 高分予量微晶纤维素硫酸酯 直接硫酸酯化锎得的微晶纤维素硫酸酪 徽晶纤维素定秘虢酸醋 抗凝血瓣性是强的微晶纡缎紊虢酸酪 c 6 ，2 发生取代的微晶纤维索硫酸醮 c 6 发生取代的徽晶纤维素硫酸酯 c 2 发生取代的微晶纤维素硫酸酯 肝素辅禹子i l 凝盘酶娠时闻 复钙时间 酰氯酯化徽晶纤维素 凝血酶时间 三蹬 三琶! 蓬茎莲! 堑 第一章绪论 一i i i i i i _ _ - _ e - - _ 自_ - _ _ _ _ - - _ _ - _ _ _ _ - - - _ _ - _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ - _ _ _ 第一章绪论 1 + l 拭凝血药物的磷究概述 1 1 1 凝血与抗凝血 一般来说，凝盘过程可分为三个阶段：第一阶段是血液系统中的凝瘟因子被 激活象戏凝敷酶原激酶；第二黔段是在凝斑酶原激酶的佟爝下，凝敷酶原转忧为 凝悫酶；第三黔段，透过凝盘酶豹作用，纤维蛋丞暴转交为纾维蛋自，形成盘液 凝块。逶豢认为，血液凝固是一系列因子连续激活的结果m 。其中的第一阶段最 为复杂，点摄了凝血过掇蛉绝大部分时间，可暹过内源蛙凝搬系统积钋源馊凝巍 系统这鼹条途径来实现。内源性凝斑系统即内在提供的凝血溅酶，虫虫渡本身懿 成分，即斑浆因子、血小板及c a “形成；而羚源蠼凝血系统即铃部提供盼凝血活 酶，由组织凝血活酶、血浆因子及c a “形成。很多血浆因子都可参与这薅个系统 中凝血活酶的形成。 在正常状态下，人体血液系统中存在凝血与抗凝血过程的动态平衡，但在某 些生理阶段，如新生儿时期和妊娠期，或在病理状态下，如手术后或患商血脂等， 则会出现凝血过程占主导的情况，以致整个血液系统处于高凝状态，从而引发临 床上常见的一种病症弥散性血管内凝血( d i c ) 。d i c 是由多种病因引起的 一种复杂的病理过程，对身体危害十分严重，例如，在妊娠后期患d i c 易导致胎 盘早期莉落和羊水栓塞等严重后果；而对于普通病人若长期处于高凝态，则会导 致器官缺飘缺血，严蘑者会造成器官功能衰竭1 2 1 。目前，d i c 是临床上较为常见 的一种综合症，抗凝治疗是针对d i c 的一种有效治疗方法，据估计，每年1 0 0 0 个病人中就有2 4 个病入需要接受抗凝治疗f ，j 。 抗凝治疗就是针对凝血过程，采用有效药物阻止凝血过稔的各个阶段，从而 达捌抗凝斑的目的。目前所采甭的抗凝治疗主要有三条途径：一楚钎对凝血过獠 第一阶段，通过与维生素k 发生拮抗经竞争，阻碍对维生索k 的利用，祆雨使凝 盘因子l i 、v i i 、i x 及x 翡合成受阻；二是针对凝血过程的第一、二阶段，抑制凝 盘酶原激活耪豹形成，隧碍凝盘酶淼转变为凝斑酶；第三条途径是针对凝盘过程 翡第三阶段，将高凝状态下产生的纤维鬣自原溶解，从焉达到抗凝盘的罄豹。针 对以上抗凝治疗的途径，目前所采用豹抗凝血焚物可大致分炎三类：一蹩维生素 k 始摭药物，妇香豆索及其衍生物等挠凝血药物；二是翳豢或类肝素药物；三是 溶纾药物，如尿激酶、镶激酶却肾上黥疫震激素等。程颞窍拭凝巍药物中，_ | l 手素 是用途最广且抗凝盘散果最为突堪的一种。 华南疆工大学工学簿士学位论文 1 1 2 抗凝血药物的应用及其开发 抗凝血药物除了在临床上确于抗凝治疗d i c 综合症、阻止手术后赢管内凝血、 治疗深度静脉栓塞戳及预防心臃系统凝盘的发生外，在体外瞧有着广泛的用途。 一方露，撬凝血药耱广溅用于盘液离俸透析与体辩保存* ，；舅一方面，抗凝血药 物在医愿材料领域也有着广泛韵应用m 。俸为翟用高分子枣孝料，除了要求材料本 身无毒、不引起生懿体病变移具有必要的强度辫，还应其有藏好的生物褶容性。 大多数裹分子材料与生物体相接触拜寸，多少会产生凝威现象，这说明材料不具有 血液攘容矬和组织相容性。篦蓠，撵高高分子材料的盘液褶容性鞠组织相容性怒 普通离分予材料迈自医用高分子糖料的一道门鹱。一般焉言，具有甍好斑液相容 性的材料也具有良好约组织相容性，因此，提鹰材料的虚液相容性，使材料表面 产生抗凝血童乍用，是医用高分子燃料研究中鲍燕要课题。改善材料抗凝敷性能静 方法主要是在材料表霭接枝或受载抗凝盔物质。翳素盎于是有反应活牲离、抗凝 血活性突如等优点，是高分子材料领域中用褥最多的一秽抗凝剂。耳藏，肝素化 高分子材料已广泛用于人造器官、血液透析膜、手术器械等医疗卫生领域”，。 不论在临床上还是在体外抗凝的应用中，肝素都是县藏用途最为广泛的一种 抗凝血药物。然而，在应用过程中发现肝素存在着一定的缺陷，主要表现在三 个方面：其一是临床实践表明，长期或过量摄入肝素会引起出血不止、血小板减 少等不良反应博”，另外，肝素的生物利用率及其明显的剂量效应依赖关系也有待 解决。而且，肝素本身具有一定的纤溶作用，长款使用肝索会弓l 起人体内a ti u 减少，引发局部栓塞，产生所谓的肝素依赖性疾痫m ，：肝素的另一个不足之处在于 其结构复杂多变，肝素是一类非常复杂的糖胺聚糖( g l y c o s a m i n o g l y c a n s ，g a g s ) ， 由葡萄糖醛酸 g i c a ) 和葡萄糖胺( g i c n h r ) 以d 1 , 4 糖甙键连接起来的重复二 糖单位组成，其中，二糖单位的个数在1 0 3 0 个不等，分子量为4 0 0 0 2 0 0 0 0 , 2 一o 硫酸。l 艾杜糖醛酸( i d o a ) 及6 - o 一硫酸一n 一硫酸一c - dg i c n h r 是其中的主 要单糖，由它们组成的三硫酸二糖的重复单位构成了肝素的所谓“规则区”，是肝 素的主要部分，另矫钓单糖残基，如船l i d o a 、6 - 0 一乙酰一n 一硫酸- 舡dg l c n h r 、 b dg l c a 及3 , 6 双o 硫酸n 硫酸a - dg i c n h r 以很低的频率出现于“非籁则区”， 一定数西的无硫酸亿的g i c n h r 及2 - o 一硫酸，a - dg i c a 的存在，使得肝素中出现 了十稀不同韵单糖，觚而使肝素的结构变得异常复杂，蓟舀前为止，肝索的精确 结构还不清楚【j 2 - ，这为肝素构效关系的研究带来不便。另外，不同来源的肝素在 结构和抗凝血活性上蓑剐较大，稻离一来源的群素，其结构和抗凝直效果也不稳 定m ，：瓤素静第三个不足之处在予，翳索源予动物赃器，可能会携带一些致病蓉， 危害人体健康f i ，。 因此，积极寻找黟素替代品基成为抗凝巍药物研究中黪一个重要熬方| 句”“。 2 第一章绪论 _ _ 一1 1 i i i 1 _ i 钟对以上瓣捌举的群素存在的不足，抗凝血药物戆开发主器集中在以下三个方面： 其一，对已有的抗凝物嫒或翳素进行结构修馋，提赢其抗凝血活经或蹲低其截作 题：其二，秀发非嚏爨动物来源的脬素替代晶；其三，半合拔或合成结构明确的 抗凝药物。 八十年代初，有人发现，从鼹素中分离褥到的低分予量缀分，具有与未分级 肝素相同的抗x a 作用m i ，但其所弓l 起的出血可能性小。这一发现嚣始了低分子 量腮索( l o wm o l e c u l a rw e i g h th e p a r i n s ，l m w h s ) 的裂究。l m w h s 是将普通 肝素降解而得到的分子量较小的组分，其平均分子量为4 0 0 0 6 5 0 0 ，与簧通肝素 相比，l m w h s 不仅克服了前者的不足，还表现出良好的抗血栓活性，因此， l m w h s 的开发为寻找抗凝血药物提供了一条新的思路。另外，有研究表明对 抗凝血活性较低的抗凝血组分进一步硫酸化会提高其抗凝血活性。例如，s c h o e n 等人对肝索中低亲和组分进步硫酸化后，可增强其对a t i i i 的结合能力，从而 增强其抗凝血活性【1 7 1 ；m a r u y a m a 等对抗凝皿活性较低的硫酸软骨素( c h o n d r o i t i n s u ! f a t e ) 进行硫酸化修饰后，其抗i l a 的活性达到4 0 u r l i t s m g ，与l m w h s 相当。 针对肝素可能会携带动物病原菌的危险，研究者们在抗凝血药物开发过程中， 积极开发其它非动物来源的抗凝血裼质，例如，海洋生物是抗凝盘物质的另一个 重要来源，藻类中也富含抗凝物质。1 9 9 4 年，m u l l o y 等人从海藻毋t e c h i n u s v a r i e g a t u s 中分离出硫酸化褐藻多糖，并对其抗凝血活性迸行了研究；从海参 中提取的辅参酸性粘多藉s j a m p ，舀前在国矫已用于临床试验一；也有从植物中 提取的抗凝裙质，如有研究报道生姜醇提锈具有一定的抗凝血活性m ，紫苏也是 提取抗凝囊物质的原材料 2 2 1 。但直接从自然界中提取分离得凳的抗凝盅物矮一般 结构复杂，难以确定其结构，即使潮类生物的不嚣个体用溺释方法崩得静抗凝物 质，其抗凝血活经也霹能不同，鼹爨，人们开始转向诧学合成抗凝血药物。 o h 圈1 - l 翳素的五聚糖结构豳 f i g 1 1s t r u c t u r eo f h e p a r i np e n t a s a c c h a r i d e 摄据对肝素抗凝趣活性的研究，目前普遍认为，野素蛉活性中心菇一个具有 五聚糖结构鲍片断( 如图1 - i 所示) 2 3 1 ，为此，研究者尝泼化学合成翳素活性片 华南理正大学工学博士学位论文 娅。1 9 8 4 年，s i n a y 等人以单糖必原料化学会成了肝素五聚糖，尽镑翳合成的 肝素五聚糖模拟片断抗凝血活性十分突出，徨由于整个过程过于复杂磷未被广泛 应用。对肝索构效关系的研究发现，孵素结构中的硫酸酯基和多糖主链是其发挥 抗凝血活性的关键结构因素m ，这启发人们可以通过对多糖进行硫酸醮亿修饰得 到抗凝血物质。这种以天然产物多糖缄其衍生物为原料，遴过硫酸醍化或其它化 学修饰方法获得具有抗凝血活性的产物的方法被称为半合成法或化学修饰法c 2 4 ， 这种方法由于具有操作简单、产物结构确定等优点，已成为抗凝血药物开发的一 个重要的研究方向。 类肼素( h e p a r i n o i d ) 是指结构上与肝素相似，且具有抗凝血活性的一类物 质的总称n 7 】。许多由半合成法制得的抗凝血活性较突出的物质在结构上都与肝素 相似，具有多糖骨架结构和一定数量的硫酸酯基 2 8 1 ，因此，这种具有抗凝j 衄活性 的硫酸醑化多糖及其衍生物可被称为多糖类肝素。 l 。1 3 多糖类肝素抗凝血药物的研究 多糖类肝素的研究始予2 0 世纪8 0 年代，r i c k e t t s 等人对右旋糖酐进行硫酸 酯化修饰，合成了硫酸酯化右旋糖酐( d e x t r a ns u l f a t e ) 1 2 9 1 ，其抗凝血活性尽管不 及肝素，毽它在一定程度上克服了肝素的不足，不会引起出血，因此，茸前在临 霖上也有应掰。继硫酸亿右旋糖酐之衙，甲壳素和壳聚糖西箕络构与肝素褶似也 被广泛用来作为半合成抗凝血物质的原料，经过了胺化、脱乙酰化和硫酸翡化等 多种修锋手段制得不同靛甲壳索衍生物 3 0 - 3 2 ，键萁抗凝血活後均不理想。a l b a n 等 以从微生物中提取的凝结多糖( c u r d l a n ) 为原料，用s 0 3 - 嘴涟硫酸酯化半合成了 撬凝血静器1 ，3 葡聚糖硫酸酯c u r s ，葜在体肉戆抗凝血活性与萎手素褶当m ，；2 0 0 2 年，a l b a n 等以黑色酵母a u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n 5 的胞外多糖p u l l u l a n 为原料，半 会成了具骞描1 ，4 1 ，6 蘩骧糖结构黪硫酸酯化多糖，其抗凝盘活性与肝素楣选”“。 纤维素是自然界中广泛存在的一种可再生匏多糖资源，它与肝素一样，具有 b ，( 1 ，4 ) 一糖贰键连接藤成的葡聚糖圭链结构，另钋，纤维素蛉化学结构明礁、规整， 可修饰性强，是一秽重要的化学改性原料。以纤维素为鼹料，采用酸酸翡化半合 成法制各具育抗凝血活性的多糖类艇素，这一研究的可行性已被初步证实雌”1 ， 但还有待于更深入硪究。 多糖类肝素的半合成方法主要是以多糖的硫酸酯他反应为基础，同时结合具 体多糖的特性和实际产物需求而定。由于多糖结构中含有大量反应性强的醇羟基， 在适当的反应条件下，这些羟基可与硫酸酯化剂发生酯化反应，生成多糖硫酸酯。 由于多糖结构中的羟基有伯羟基和仲羟基之分，加上空间位阻的存在m ，所以， 多糖中的羟基被硫酸酯纂取代的难易程度不一。如何提高硫酸酯取代度或根据实 际需要获得具有指定取代模式的多糖硫酸酯，是半合成多糖类肝索抗凝斑药物研 4 第一章绪论 究中羼嚣蟾豹主要趣题啪l 。 1 1 4 多糖类肝素药物的抗凝血作用视理 多糖类翳素结构对其抗凝血惩瞧的影响较大，主要在于薅方面，其一是带负 电荷的硫酸醑基，其二是多糖主链结构。此钋，多数研究者认为，特定躲溶液构 象也是多糖类肝素产生抗凝血活性赝必需的m j $ 1 。 硫酸照基对多糖类脬素产生抗凝血活性约更献首先在于其所豢的负电苟。与 肝素一样，绝大多数多糖类肝索主要通过与血浆中的两种凝呶酶抑制剂抗凝 血酶h i ( a n t i - t h r o m b i n i i i ，简称a t i i i ) 和肝素辅因子i i ( h c p a r i n c o f a c t o r i i ，简称 h c i i ) 结合，诱导凝皿酶抑制剂的构象发生变化，从而有利于其对凝血因子i i a 和 x a 的活性产生抑制。在多糖类肝素与凝血酶抑制剂的结合过程中，多糖类肝索结 构中带负电荷的硫酸酯基与凝血酶抑制剂结构中带正电荷的氨基酸残基( 如丝氨 酸、赖氨酸和脯氨酸等) 通过静电吸引相互作用，非特异性地结合1 。除了负电 荷效应以外，硫酸酯基对多糖类孵素抗凝盘活性的发挥还具有特异性的作用，例 如，含有磷酸酯基的纤维素衍生物，尽管具有更强的负电荷密度，但其抗凝血活 性不妇纤维素硫酸酯，因此，硫酸酯基在促进多糖类肝索抗凝血活性方面具有 其它负电衙基团所不其备的特健1 4 0 。”。至于硫酸酯基如何特异性地参与抗凝血过 程，目前尚无报道，还有待避一步研究。 多糖类j 手素的多糖主链结构在其发挥抗凝缸活性遥程中有两方面的作用：冀 一，为多糖类肝紊与a ti i i 结合提供必要的能爱；其二，为凝血酶掭制帮与凝血 酶的结合提供模板作用。对翳素的磷究发现，野素约活性五聚藉片断为其与a t i i i 静结合提供了9 0 静能璧。就外，在通i 重a ti i i h a 途径产生抗凝矗作簿的过 程中，多糖类肝素首先与a ti i i 结会，结合后豹产物主要起催化a ti i i 与i i a 结 合的作用，i i a 先与结合7a ti 联戆多糖类肝素结合，然蜃沿繁多糖主链与a t i i i 相遇而结含，形成稳定的三元复会物。在这一过程中，多糖类肝素的多糖圭链起 模板作用泔l 。 多糖类翳素的溶液擒象在其捷凝虫活性中的终用已雩譬到认同，倒鳃，对硫酸 酯化海藻多糖的抗凝斑活性研究表明，硫酸酯化海藻多糖瀑要在合适的空阔构象 支持下，才能表现出赢的抗凝血活性【3 8 ，；m a r u y a m a 等对硫酸软骨素进一步硫酸化 后可提高其抗凝斑活性，认为，这越能在一定程度上与其溶液构象改变有关”“。 但是，多糖类肼素的溶液构象对凝血过程的哪一阶段产生影响以及影响程度如何， 究竟何种溶液构象对其抗凝血活性是有利的，目前还没有相关的研究报邋。 多糖类肝素的结构对其抗凝血活性发挥起惹重要的作用，但对于不同的多糖 类肝素，其结构对活性的影响规律不同，因此，构效关系也有差别，为了考察抗 凝物质的负电荷密度与其抗凝血活性的关系，h u r s t 等人以肝象为研究对象，通过 华南理互大学工学博士学位论文 离子交换柱层析分离，褥到负电藏密度各不相同鲍多种组分，并分别磺究其抗凝 血堰性，研究结果表明，随着负电旅密度的增螺，翳素的抗凝效价从8 li u m g 增 歪2 4 3i u m g ，表明，肝素随着其分子结构中负电荷密度的增加，其抗凝斑活性 明显增强【4 4 1 。 有关分子量与抗凝血活性关系的研究显示，分子量对凝血指标t t 的影响较 大i “。a l b a n 等人通过对分子量与b 1 ，3 一葡聚糖硫酸酯抗凝血活性关系的研究， 认为，存在着使之产生抗凝血活性的极限分子量范围( 大于3 0 k d ) 1 4 7 。 硫酸酯基的取代度及其在糖链上的分布情况( 即硫酸酯取代模式) 也直接影 响多糖类肝素的抗凝血活性，例如，g u l i e l m o n e 等人对植物中提取的两种组分的 抗凝途径进行分析，发现造成两组分在抗凝途径上存在差异的主要原因是其硫酸 醑取代度不问 艚j ；只有当硫酸酯取代度大于l 时，岩藻聚糖才具有明显的抗凝血 活性h q ：s c h o e n 等人对肝索中低亲和组分迸一步硫酸酯化，可增强其对a ti i i 的结合能力，从而进一步抑制i i a 和x a 的活性1 1 7 ；但t o i d a 的研究指出，当硫酸 醣化修饰后* 于素的硫酸取代度达到3 时，其抗x a 的活性完全丧失，该研究还以 硫酸酯化的硫酸皮肤素为对照， 芷实了这一研究结果洲；m u l l o y 等人研究了硫酸 酯基的驳代模式对硫酸皮肤素抗凝盔活性的影嫡，研究发现，尽管取代发相同， 餐c 6 位硫酸酯取代所鼗示的抗凝斑活性大予c 4 位取代m ，；有关褐藻多糖抗凝血 满性的研究撩出，其抗凝盘活性与c 2 位和c 3 位的硫酸酯基水平有关，而c 4 位 豹硫酸醅基辩其抗凝盘活性贡献不大m l ：对翳素豹研究表贸，c 3 位的。一硫酸酯 基是肝褰与a ti i i 的结合区，羼魏，对肝素的抗凝血活性贡献最大n ”，还有研究 指出，肝素孛c 2 位的酸酸酯基对诱导a ti i i 构象的转变也相当重要”“。 i ，1 ，5 抗凝血活性的表征方法 抗凝甥质的抗凝效应一般取决予其活性大小耱抗凝血途径哪l 。 物质的挽凝血活性大小一般用凝羁法来测定娜m ，。凝固法是通过囊虫渡( 或 血浆) 中添加抗凝物质，观察其在套种条件下的凝血时间，然后根据凝盘时间的 大小初步判断其在相应条件下抗凝衄活性的大小。一般来说，凝血时阉越长，抗 凝物质的抗凝血活性越强。目前，凝固法常用鲍指标有：全斑凝血对闯、复钙时 间( r e c a l c i u mt i m e ，r t ) 、活化部分凝血活酶时间( a c t i v a t e d p a r t i a lt h r o m h o - d l a s t i nt i m e ，a p t t ) 、凝血酶原融阊( p r o t h r o m b i nt i m e ，p t ) 和凝舡酶时闻 ( t h r o m b i nt i m e ，t t ) 等。 全血凝血时间是指m 液离体至完全凝固所需的时间，它代表血液由接触异物 至生成少量凝血酶而使纤维蛋白原转变为纤维蛋白时所经历的时间。由于多种因 素( 如取血条件、实验标本的来源) 都对凝血过稷产生影响，因此，全舡凝血时 间是一个很不敏感的实验指标。r t 是指脱钙全血加氯化钙至形成凝块所需的时 6 第一章绪论 闫，叉称霉钙化时闼，遮一指标与金盘凝威露闼蹶代表黪意义相同，哥以通过它 初步判断液测的物质是否具有抗凝妞活性，其灵敏性高于全盘凝血时阚。正常入 虫r t 走1 2 0 - 1 8 0 s ，只有趣过这一毽1 8 0 s 以上时才能说唆技添加的物质具有抗凝 血活性。p t 是指血浆与脑浸液混台，加氯亿钙后所测得的凝霜时间，可犍它看成 组织凝照活酶存在时鲍复钙时阕。p t 代表生成终源凝血淫酶、凝血酶和终维蛋色 这三个连续反应所需时阈，它受到鳃织凝血活骢、c a “、v 、v i i 、x 、凝血酶原、 纤维蛋白原等七个因子的影购，其中组织凝血活酶秘c a 2