国内外食品微生物检测方法.ppt

2019/12/13,国内外食品微生物检测方法,2019/12/13,微生物检验标准方法的必要性和重要性,有法可依有法必依执法必严违法必究,有法可依有章可循有据可查有错必纠有洞必补,对食品中的致病微生物进行监测是国家意志的体现,2019/12/13,准确、可靠的检验结果是正确评价和保证食品安全性的先决条件，也是国际贸易上公平交易的有力科学依据。在食品微生物检验领域中，检验规程规范化和分析方法标准化是检验结果可信性的重要保证。,避免“公说公有理，婆说婆有理”；避免“仁者见仁，智者见智”,2019/12/13,内容,第一部分国内外食品微生物标准检验体系第二部分微生物检验快速检测系统第三部分方法的选择第四部分微生物检验方法的编写第五部分食品微生物检验方法的验证和确认,2019/12/13,第一部分国内外的食品微生物标准检验体系,一、术语和定义1、标准方法：指国际、区域、国家发布的经过严格确认的以及公认的方法。标准方法包括参考方法和公定方法。（1）参考方法：指适用于特殊待验目标的经过国际或国家公认的检验方法。对于食品微生物检验而言，典型的传统的参考方法是培养法。（2）公定方法：指知名的技术组织或机构（如AOAC）公布的检测方法。2、非标准方法：标准方法中未包含的需要确认后才能采用的方法。,可替代方法：指用来检验某一特定产品中某种目标微生物的与相应参考方法等效的方法（ISO16140:2003），如快速检测试剂盒和自动化系统。值得说明的是，并非所有的可替代方法都是标准方法。,2019/12/13,二、国内外食品微生物检测体系,2019/12/13,食品中常规指示菌和致病菌的关系,2019/12/13,常规指示菌和致病菌的“危害分类”,2019/12/13,食品微生物检测方法,2019/12/13,2019/12/13,2019/12/13,2019/12/13,MPN法适用于污染程度低，含有受到损伤的加工食品，目标微生物数量低，否则，应用直接计数方法,间接计数法最大可能数量（MPN）,2019/12/13,三、区分几个关系,1、国家标准与行业标准的关系？食品微生物检验的国家标准是GB/T4789，其为基础标准，行业标准方法原则上应与其一致，至少不能与国家标准相矛盾。进口产品用GB?出口产品用SN?2、国家标准与国际标准的关系？为了公平贸易，国家标准应与国际标准接轨。应考虑优先使用国际标准。现状。实例：2004年USDA来青进行等效性评估。3、国内国家标准/行业标准与他国国家标准/行业标准的使用？根据ISO/IEC17025的规定，如果进口国要求使用他国国家标准/行业标准，原则上要满足客户的要求，否则，需与客户协商。即使国内国家标准/行业标准与他国国家标准/行业标准等效或等同，也必须与客户协商和沟通，只有做客户统一的情况下方可使用。,2019/12/13,第二部分微生物快速检测系统,2019/12/13,第一节主要微生物检验快速检测系统,一、以免疫学为基础的检验法,2019/12/13,免疫磁珠检验法的优点:特异性好灵敏度高1CFU所捕获的菌是活菌快速、操作步骤简便可快速处理较大量样品,2019/12/13,2019/12/13,2019/12/13,2019/12/13,二、以分子生物学为基础的检验法,2019/12/13,PCR技术将是众多食品微生物快速检测中被认可的一枝独秀的快速检测技术之一。但须注意：如何减少培养基成分的干扰？死菌的干扰和风险？等等,2019/12/13,2019/12/13,三、生化鉴定系统,2019/12/13,2019/12/13,四、根据酶触反应及代谢产物快速检测细菌,2019/12/13,2019/12/13,2019/12/13,五、其他部分自动化系统,2019/12/13,BIOLOG自动微生物鉴定系统,BIOLOG,OmniLog&OmniLogPlus,MicroLog1,MicroLog2,MicroLog3(MicroStation),OmniLog,MicroLog,2019/12/13,第二节微生物快速检测系统的局限性,大部分快速方法适用于检测单一微生物，适用于质量控制程序中快速筛选大量食品样品中所存在的特殊病原体或毒素。然而，快速检验方法所得阳性者，仅仅是可疑，必须用标准参考方法予以证实，虽然证实试验需要几天，但不能予以限制。,快速检验方法的评估结果表明，其对于某类食品的性能优于其它食品，很大程度上是由于食品成分干扰所致，有些食品成分对于快速方法中所应用的技术是比较麻烦的。例如，每一食品成分可能抑制DNA杂交或Taq聚合酶，但对抗原-抗体相互作用没有影响，反之亦然。既然方法的灵敏度、特异性和精确性依赖于待验食品，那么进行比较研究以确保某一特殊检验方法能有效分析此类食品是明智的。,2019/12/13,基于DNA检验方法的特异性通过短的探针来显示，因此用特殊探针或引物检测毒素基因，阳性结果仅仅表明某细菌具有该基因序列，以及某细菌可能是产毒的，不能从客观上说明该基因得以表达，并产生毒素，例如在梭菌和葡萄球菌中毒病例中，DNA杂交和PCR仅能检测到基因的存在，但不能用来检测预先形成的毒素是否存在。随着某一快速方法更加频繁的使用，其好处和局限性同时变得更加明显。使用者在选择和彻底评估这些快速方法时，必须保持谨慎。,2019/12/13,FDA认可使用的检测系统和试剂盒,检测和鉴定食源性病原菌的微量生化复合试剂盒微生物自动鉴定系统核酸杂交分析（分子生物学）方法免疫学分析方法其它商品化快速检测方法和培养基,第三节微生物快速检测系统的认可,一、USDAFDA认可情况,2019/12/13,34,可编辑,2019/12/13,2019/12/13,2019/12/13,2019/12/13,2019/12/13,2019/12/13,2019/12/13,二、AOAC、NMKL、AFNOR、NORDVAL、MICROVAL的认可情况,2019/12/13,第三部分方法的选择,1客户要求；2方法的准确性；3方法的特异性；4方法的实用性；5方法的稳定性；6方法的灵敏度；7方法的检测限和测量限；8实验室硬件条件（仪器、设备、场地设施、人员资质等）；9商业快速检测系统的供应保证、价格、认可程度和售后服务。,2019/12/13,通常情况下，实验室应采用满足客户（注：对于企业实验室，其所在单位为其内部客户）需要并适用于所进行的检测的方法，包括在抽样的方法。应优先使用以国际、区域或国家标准发布的方法。当认为客户提出的方法不合适或已过期时，实验室应通知客户。,当客户未指定所用方法时，除优先使用国际、区域、国家或知名的技术组织发布的标准方法外，还可选择非标准方法，但必须对所选择的非标准方法进行严格验证、确认和审批，如能满足实验室的预期用途，并经客户同意，也可使用。,2019/12/13,第四部分微生物检验方法的编写,标准方法的一般构成和编写顺序：1资料性技术要素：封面、目次*、前言、引言；2规范性一般要素：名称、范围、规范性引用文件*；3规范性技术要素：术语和定义*、符号和缩略语、食品微生物检验(原理*、培养基和试剂、设备和材料、采样*、制样、增菌培养、筛选、鉴定和确认等)、结果判定（判定方法和判定标准）、结果报告*、规范性附录*；4资料性补充要素：资料性附录*、参考文献*、索引*。上述构成要素不是任何一项标准都需要全部包括的，标有*者可根据标准化对象的特征和制定标准化的目的而取舍。,第一节标准方法的编写,2019/12/13,2019/12/13,2019/12/13,第二节非标准方法的编写,一般要求以接近国家标准（如GB/T1.12000）或行业标准推荐方法的格式进行编写。等同、修改采用国际标准或国外先进标准时，其编写格式和方法可与被采用的标准一致。力求标准结构严谨、层次分明、主题突出，简单易懂。,一、非标准方法的编写原则,2019/12/13,二、非标准食品微生物学检验方法的基本编写格式,（1）封面每项非标准微生物检验方法应该有封面，封面的内容有“（单位）（部门）非标准方法”字样和非标准方法的标志（注：选择性的）、中文名称、英文名称（注：选择性的）、非标准方法的唯一性编号、代替非标准编号（注：选择性的）、发布日期、实施日期、标准的审批部门等（见附录1示例2）。（2）正文内容一般包含下列内容，必要时可增减相关条目：目的、范围；方法提要或原理:简述所用方法的主要步骤及采用的基本原理；设备和材料：标明规格和型号；培养基和试剂：必须符合GB/T4789.28和SN/T1583的规定；检验程序：画出主要的检验程序框图；操作步骤：包括试样制备（含稀释或按特定条件的制备）、培养（含前增菌培养和增菌培养，分离培养等，可根据需要取舍和分步描述）、初步鉴定（可根据需要取舍）、确证鉴定（含进一步的生化反应和血清学分型，可根据需要确定试验内容）毒素试验（可根据需要取舍）、动物试验（可根据需要取舍）；结果报告；其它（包括内部质量保证要点、生物防护要求；）；附录（资料性附录和规范性附录）方法来源（如参考文献、仪器设备方法等）。,2019/12/13,三、非标准方法的审批,2019/12/13,第三节标准操作程序的编写,标准操作程序（standardoperationpractices，SOP）是用来指导某个具体过程、事物所形成的技术性细节描述的可操作性文件，国内常常称之为“作业指导书”，二者没有本质区别。SOPs的编写及使用是实验室成功质量体系中的一部分，因为它能为操作人员提供正确完成一项工作的信息，从而保证不同操作人员都能在一定的不确定度范围内得到相同的微生物检验结果。实验室应关注以下四个方面SOPs：1方法类：包括食品微生物检验方法中不详细或不完善部分的补充，期间核查、方法确认及比对等；2设备类：重要或复杂设备的使用、操作规范（如设备制造商提供的技术说明书不够明细等）；3样品类：取样、制样和样品处置的“实施细则”等；4数据类：定量检测结果的表达、异常数据的剔除、测量结果不确定度的评定等等。SOP是技术性的文件，并不要求必须制订。,一、定义和分类,2019/12/13,二、食品微生物检验SOP的编写依据,目前，在国内，尚未检索到关于食品微生物检验SOP的编写导则及相关要求；在国外，美国环境保护署(EPA)(/quality/sops.html)和美国农业部销售司(AMS)(/science/mpo/)均发布关于微生物检验SOP的编写导则及相关要求，前者是后者的蓝本：EPAQA/G-6GuidanceforPreparingStandardOperatingProcedures(SOPs)；EPASOPADM-02-02StandardOperatingProcedureforPreparationandReviewofStandardOperatingProcedures(SOPs)；USDAMDP-ADMIN-07PreparationandMaintenanceofStandardOperatingProcedures(SOPs)。以上文本均可从相应网站免费下载，同时EPA和USDAAMS制定了一系列与微生物检验相关的SOPs，这些SOPs的编写结构和格式值得借鉴和参考。,2019/12/13,SOP的格式方法一：参照美国农业部农业销售司(AMS)的微生物数据程序/science/mpo/sops.htm方法二：参照美国环境保护署（EPA）的EPAQUALITYSYSTEM/quality/sops.html,2019/12/13,三、SOP的基本编写格式,下面结合一个实例，介绍一下编写微生物检验SOP的基本格式和要求：（1）封面编写单位：中英文对照。标题：测定对象测定项目测定方法名称(中英文对照)；测定对象：以产品为主，采用最常规的产品名称（可参照国际、国家或行业的产品标准）；测定项目：应写明具体被测项目；当被测项目为多项时，应一一列出，超过8项时，可只写出前3个项目。编写人及时间：为保证SOP内容的全面性和准确性，由实验室内具有一定资质的使用者编写；审核人及时间；批准人及时间：批准人一般为实验室的技术负责人；文件编号：唯一编码；受控状态：是否受控；修订号：第次修订；发放序号。（2）正文内容一般包含下列内容，必要时可增减相关条目：目的；范围；方法提要或原理:简述所用方法的主要步骤及采用的基本原理；程序提纲：包括培养基和血清、设备和玻璃器皿、取样、测试样品的制备、测试样品和最初悬浮液、非选择性前增菌、选择性增菌、筛选、可疑典型菌落的分离和纯化、生化鉴定、血清学确认和血清型、确认；安全性；质量保证；参考文献；特殊程序：与对应；结果表达和测试报告；附录（资料性附录和规范性附录）。,2019/12/13,SOP实例,USDA：MDP-DATA-01MicrobiologicalDataandResultsReportingEPA：QC-02-02Air-SurfaceMonitoringofMicrobiologyLaboratories山东CIQ：SOP沙门氏菌的检测方法,2019/12/13,第五部分食品微生物检验方法的验证和确认,一个实验室拟用某一食品微生物检验方法前，无论是标准方法还是非标准方法，皆应对其进行严格验证或确认。详见食品微生物实验室质量管理手册,2019/12/13,第一节验证和确认导则,在GB/T19000：2000质量管理体系基础和术语中，验证被定义为“通过提供客观证据对规定要求已得到满足的认定”，确认被定义为“通过提供客观证据对特定的预期用途或应用要求已得到满足的认定”。在ISO/IEC17025中中,确认被定义为“通过核查并提供客观证据，以证实某一特定预期用途的特殊要求得到满足”。从以上定义可以看出，验证要保证“做得正确”，而确认则要保证“做的东西正确”。验证注重“过程”，确认注重“结果”。,一、概念,2019/12/13,二、微生物检验方法验证和确认的依据,美国官方分析化学家协会(AOAC)，执行标准为：“AOACInternationalMethodsCommmitteeGuidelinesforValidationofQualitativeandQuantitativeFoodMicrobiologicalOfficialMethodsofAnlysis-2002”；国际标准化组织(ISO)，执行标准为：ISO/TR13843：2000Waterquality-Guidanceonvalidationofmicrobiologicalmethods和ISO16140:2003Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs-Protocolforthevalidationofalternativemethods；NordVal：NV-DOC.D2005-01-01Protocolforthevalidationofalternativemicrobiologicalmethods；新加坡认可委员会(SAC)：C&BandENV002MethodValidationofMicrobiologicalMethods。此外，可参考GB/T18510-2001煤和焦炭试验可替代方法确认准则。,2019/12/13,三、验证和确认试验技术,用于验证和确认食品微生物检验方法性能的试验技术包括：使用参考菌株进行核实；与其他方法所得的结果进行比较；实验室间比对；对影响结果的因素作系统性评审；根据对方法的理论原理和实践经验的科学理解，对所得结果不确定度进行评定。以上验证和确认食品微生物检验方法性能的试验技术，可概略分为两大类：实验室间验证/确认试验（协作试验）和实验室内验证/确认试验（单一试验）。实验室间验证/确认试验是指在若干实验室内由不同操作者进行的验证/确认试验，而实验室内确认试验是仅在特定的实验室内进行的验证/确认试验。,2019/12/13,四、对试验人员的要求,验证和确认食品微生物检验方法的人员,必须符合以下要求：A掌握方法中试样处理的原理；B掌握方法中食品成分对微生物的干扰以及微生物的增菌原理；C掌握方法中目标微生物分离、纯化、鉴定和确认的原理；D对仪器的构造要有基本了解；E对仪器/试剂盒的工作原理有基本了解；F能熟练使用仪器/试剂盒；G熟悉仪器/试剂盒的维护和性能确认方法；H熟悉方法所使用的试剂、材料和仪器/试剂盒；I熟练掌握分析步骤的每一个步骤；J了解方法的关键所在；K能熟练进行分析结果的计算；L掌握方法能独立进行数据处理，并判断结果的准确性。,2019/12/13,五、对协作实验室的要求,如果进行实验室间验证/确认试验（协作试验），协作试验室必须符合以下要求：A按ISO/IEC17025认可，并且进行协作试验所需技术在实验室认可范围之内，必须提供一份实验室认可证书和认可范围；B令人满意地进行实际样品的分析。C有操作和处理分析物或相关混合物及适用对象的经验；D不能将试验转包给其他实验室；E有独立的质量保证体系和程序文件，应能提供一份组织结构图，应能提供一份标准操作程序的提纲提要；F拥有必需设备，并进行了规范的维护和校准，应能提供相关记录；G有培训和资格确认记录，应能确保食品微生物检验方法的验证和确认人员符合前文要求；H有内部质量控制和外部质量评估措施，必须提供这些措施的记录；I有适当的令人满意地记录和保护数据的系统。,2019/12/13,第二节食品微生物检验方法的验证,建议实验室在以下情况下对检验方法进行严格的验证：1.拟用经过完整确