（微生物学专业论文）转基因培养料与平菇间基因水平转移现象的研究.pdf

学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 摘要 基因漂移现象是指生物的目标基因向附近野生近缘种的自发转移的现象。根据农 作物种植面积推理，中国多于一半的棉籽壳是转b t 基因抗虫棉棉籽壳，其中绝大部分 都用于平菇的栽培。如果棉籽壳中转基因外源基因向外界生物自然转移就会产生基因 漂移。因此，研究b t 基因的去向就显得十分重要。 1 、本研究利用转基因棉籽壳栽培平菇，了解转基因棉籽成分对平菇生长的影 响。结果表明，两种培养料栽培的平菇在产菇外观形态等特性上没有太大差异，说明 转基因棉籽壳可以作为栽培平菇的配料。 2 、本实验成功比较了c t a b 法、s d s c t a b 法以及磁珠提取法三种提取平菇基因 组d n a 的方法，并通过紫外分光光度计，限制性酶切及p c r 检测来衡量基因组质量。 结果表明，s d s c t a b 法以及磁珠提取法提取的平菇d n a 能够满足分子水平操作的要 求，两者相比，前者成本较低，后者产率较高。考虑到成本原因在后续实验中选用 s d s c t a b 法进行外源基因检测。 3 、考虑到成本原因在后续实验中选用s d s c t a b 法提取平菇基因组进行外源基 因检测，利用p c r 方法成功从几代平菇组织中检测到c a m v 3 5 s 启动子片段、n o s 终 止子片段、s a d 棉籽内标基因片段，b t 基因片段( c r y l a b e ) ，说明平菇栽培过程中细 胞可能接受外源d n a 片段。 4 、利用t r i z o l 法提取平菇子实体r n a 以及r t - p c r ，检测在转录水平上是否发生 基因漂移现象。结果表明，在转录水平上平菇没有接受外源片段。 关键词：转基因棉籽壳；平菇栽培；基因漂移；生物安全 t h es t u d yo fg e n ef l o wb e t w e e nt h eg e n e t i c a l l ym o d i f i e dc r o p sa n dt h e p i e u r o t u so s t r e a t u s a u t h o r ：y a hy a h s u l 州s o r ：h o n g t a ot i a n m a j o r ：m i c r o b i o l o g y a b s t r a c t g e n ef l o wi st h et r a n s f e ro fa u e l e so fg e n e sf r o mo i l ep o p u l a t i o nt oa n o t h e r a c c o r d i n gt ot h ea c r e a g eo f c r o p s ，m o r et h a nh a l f o f c h i n a sb tt r a n s g e n i cc o t t o nu s e df o rm u s h r o o mc u l t i v a t i o n a m o n gt h e s e ，l o t s o ft h e mu s e dt oc u l t i v a t em u s h r o o m f o r e i g ng e n eo ft r a n s g e n i ci n s e c t - r e s i s t a n tc o t t o nf l o wt ot h e o u t s i d e t h e r e f o r e ，i ti sv e r yi m p o r t a n tt os t u d yt h ef a t eo fb tg e n e 1 卫坞c u l t u r e s c o n t a i n i n gm o n 15 9 8 5w e r eu s e dt oc u l t i v a t e 只o s t r e a t u su n d e r s t a n d i n gt h e c o m p o s i t i o no fg e n e t i c a l l ym o d i f i e dc o t t o n s e e d 硒er e s u l t ss h o w e dt h e r ew a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e i ny i e l da n db e s i d e so t h e rc h a r a c t e r i s t i c so fm u s h r o o m i ti n d i c a t e dt r a n s g e n t i cc o t t o ns e e d sc o u l db e u s e da si n g r e d i e n t s 2 c o m p a r i n go ft h ec r a bm e t h o d ，s d s - c t a be x t r a c t i o nm e t h o da n de x 仃a c t i o nm e t h o d 、以t l i m a g n e t i cb e a d s ，m e a s u r i n gt h eq u a l i t yo ft h eg e n o m eb yu vs p e c t r o p h o t o m e t e r ，r e s t r i c t i o ne n z y m e d i g e s t i o na n dp c rt e s t s 1 1 圮r e s u l t ss h o w e dt h a tt h es d s - c 1 = a bm e t h o da n de x t r a c t i o nm e t h o dw i t l l m a g n e t i cb e a dm e e to p e r a t i o n a lr e q u i r e m e n t s ，t h ef o r m e rl o w e rc o s tw h i l et h ey i e l dh i g h e r 3 c o n s i d e r i n gt h ec o s t ，w ed e c i d et oc h o o s es d s - c t a bm e t h o dt oc o n t i n u et h er e s e a r c h e x p l o r e d t h ef r a g m e n t so ff o r e i g nd n a b yp c r ，t h em u s h r o o ms p a w ns e v e r a lg e n e r a t i o n sc o u l db ed e t e c t e dt h e f r a g m e n t so f c a m v 3 5 sp r o m o t e r ，n o st e r m i n a t o ra n ds a d i n t e r n a ls t a n d a r dg e n ec o t t o n s e e d ，b tg e n e f r a g m e n t s ot h ec e l l so fm u s h r o o ma c c e p t t e df o r e i 印d n ad u r i n gt h em u s h r o o mc u l t i v a t i o np r o c e s s 4 e x t r a c t i n gr n a o fm u s h r o o nf r u i t i n gb e d ya n dd e t e c t i n gw h e t h e rt h e r ew a st h ep o s s i b i l i t yo f g e n e t i cd r i f tb yr t - p c r n er e s u l t ss h o w e dt h a tt h em u s h r o o md o n ta c c e p ta n yf o r e i g i lf r a g m e n t sa t t h et r a n s c r i p t i o n a ll e v e l k e yw o r d s ：t r a n s g e n i cc o t t o n s e e d s ；c u l t i v a t i o n o fp l e u r o t u s o s t r e a t u s ；g e n ef l o w ； b i o s a f e t y 目录 l 引言1 1 1 转基因作物的研究应用与现状1 1 2 我国转基因棉花研究应用现状_ 2 1 3 转基因抗虫棉的研究与应用3 1 4 物种间的基因漂移现象。3 1 5 转基因生物安全检测5 1 5 1 转基因检测研究现状5 1 5 2 核酸的提取和纯化6 1 5 3p c r 检测策略6 1 6 我国平菇栽培的现状7 1 7 本研究的目的意义8 2 材料与方法9 2 1 实验材料与设备一9 2 1 1 供试菌种与原料9 2 1 2 培养基与缓冲液9 2 1 3 主要试剂9 2 1 4 主要仪器设备1 0 2 2 实验方法1o 2 2 1 平菇养殖1 0 2 2 2 平菇基因组提取方法的研究一1 2 2 2 3 平菇组织中有关外源基因的d n a 片段检测1 4 2 2 4r n a 水平分析外源片段1 7 3 结果与分析。1 9 3 1 转基因棉籽壳培养料对平菇生长的影响1 9 3 2 不同平菇组织形态2 0 3 2 1 平菇菌丝体形态2 0 3 2 2 平菇子实体形态2 0 3 3 平菇基因组提取方法的比较2 1 3 3 1d n a 的纯度及浓度2 1 3 3 2d n a 分子的完整性2 2 3 3 3 平菇基因组d n a 的酶切鉴定2 3 3 3 4 平菇基因组的p c r 扩增分析2 3 3 4 平菇细胞外源片段的检测2 4 3 4 1 特异性引物进行p c r 验证2 4 3 4 2 特异性p c r 对平菇外源片段的检测2 5 3 4 3 蓝白斑筛选阳性克隆2 7 3 4 4 菌落p c r 鉴定2 8 3 5r n a 水平检测外源片段2 9 3 5 1o d 2 6 0 o d 2 8 0 的比值的测定2 9 3 5 2 电泳检测平菇总r n a 2 9 3 5 2r t - p c r 检测平菇外源片段3 0 4 讨论3 2 4 1 平菇栽培的研究3 2 4 2 平菇组织切片的研究3 2 4 3 平菇基因组提取的比较研究3 3 4 4 外源片段的检测3 4 4 5 转录水平检测外源片段3 6 5 结论。3 8 参考文献3 9 在读期间发表的学术论文4 3 作者简介4 4 致谢4 5 转基冈培养料与平菇间基冈水平转移现象的研究 1 引言 1 1 转基因作物的研究应用与现状 转基因植物是指通过基因工程手段对从动物、植物或微生物中分离出的目的基 因，导入到植物的基因组中，从而获得稳定遗传给下一代的一类植物，从而可以使原 有性状发生一定程度的改变，在农作物育种方面取得比较理想的效果，符合人类目标 的新种质。经基因工程改造后的育成的农作物新品种，具有高产、抗虫、耐旱、质优 等特性，在解决当今世界所面临的人口膨胀条件下的食物短缺、环境恶化、资源匮乏、 效益衰弱等问题发挥了巨大作用【1 1 。同时，随着现代分子生物学技术的不断发展和相 关技术领域的不断创新，基因工程应用范围越来越广，推动了生物技术产业的进一步 发展，将成为2 1 世纪最具发展前景的高新技术领域和国民经济的支柱产业之一。 自世界首例转基因植物即转基因烟草于1 9 8 3 年问世以来，共有近6 0 种植物数万 种转基因植物转化品系进入田间试验，转基因生物技术受到发达国家的高度重视， 1 9 8 6 年，首次批准了转基因植物抗虫和抗除草剂的转基因棉花进行田间试验。孟 山都公司于1 9 8 4 年正式成立生命科学研究中心，研究农作物转基因技术，并第一个 拥有b t ( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ) 杀虫基因的专利权，培育了转b t 基因抗虫棉。9 0 年 代中期，孟山都公司与美国最大的棉种经营公司岱字棉公司联合，所培育的转基 因棉花迅速推广至世界各地，并于1 9 9 6 年进入中国境内，成为我国首个大面积种植 的转基因作物。至2 0 0 1 年底，各国正式批准的各类转基因植物达1 3 0 个品种，其中 绝大部分都与病虫、杂草的防治等有关。 据国际农业部生物技术应用咨询服务中心( i s a a a ) 统计，转基因农作物商业化 种植从1 9 9 6 年1 7 0 万h m 2 增长到1 0 2 0 0 万h m 2 ( 图1 ) ，同时种植转基因植物的国家 从6 个增至2 2 个，全球种植面增加了近5 0 倍( 图2 ) ，全球转基因行业发展速度之 快，超出人们预料【2 1 。目前，大面积商业化种植转基因植物仍以抗除草剂、抗虫转基 因作物，如玉米、大豆、油菜和棉花等为主p 4 j 。 随着转基因植物的大面积商品化，生态安全性问题成为争论的焦点p j 。环境安全 性问题主要是转基因植物释放到田间以后转基因是否会漂移到环境中使生态环境受 到破坏，打破原有生态种群的平衡。包括：转基因生物对农业和生态环境的影响；产 生转基因植物杂草、“超级害虫的可能性；转基因向非靶标生物漂移的可能性；转 基因生物是否有毒；其他生物食用转基因食品后会产生过敏性反应；转基因生物是否 会影响生物种类的多样性【6 - 1 0 。这些考虑与担忧不仅由于目前转基因技术不成熟性以 及其产品质量安全的不确定性，并且源于转基因技术对人类社会生活影响的不可预见 性，这些都需要长期的实践研究来证明。对于转基因生物安全性的评价，应作为转基 因生物安全检测的核心内容。 河北农业大学硕+ 学位( 毕业) 论文 图i 全球转基因作物总面积百万公顷( 引白c l i v ej a m e s ，2 0 0 6 ) t a b l e lg l o b a la r g ao fb i o t e c hc r o p s 图2 全球转基因作物分布( 引自c l i v ej a m e s ，2 0 0 6 ) t a b l e 2g i o b a ls t a t u so f c o m m e r c i a l i z e db i o t e c h 1 2 我国转基因棉花研究应用现状 2 2 0 世纪9 0 年代，我国棉铃虫连年危害猖獗，不仅造成了巨大的经济损 觏 黪 獠 耘 瓣 瓣 鳜 辫 羧 螽 转基冈培养料与平菇间基因水平转移现象的研究 在防止棉铃虫期间使用了大量化学杀虫剂，使得农田中化学危害污染严重，由此引起 的环境污染以及害虫产生抗药性后再度猖獗问题更难以应对。为了解决棉铃虫的危 害，并积极应对国际转基因技术竞争，在国家“8 6 3 ”计划和农业部转基因专项支持下， 我国科学家郭三堆等根据苏云金芽孢杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ) 杀虫晶体蛋白 c 巧i a b 和c 巧i a e 杀虫优势结构域氨基酸序列，采用植物优化密码子，人工合成了 g f mc r y l a 杀虫基因，构建了高效表达载体，并利用农杆菌介导法和花粉管通道法 将g f m c r y l ab t 杀虫基因导入棉花，创造出具有自主知识产权的第一代单价转基因 抗虫棉，使我国成为第一个能够独立自主研制转基因抗虫棉的发展中国家，并且处于 世界转基因作物商品化种植的前列【1 1 1 。 棉花是一种重要的世界经济作物，成本低廉，产出量大，棉籽油和棉籽是重要的 植物和蛋白质来源，对带动我国经济增长起到了至关重要的作用。而虫害对我国农作 物经济的影响又是不可估量的。因此，对转基因抗虫棉的研究，如通过转基因技术将 外源基因导入棉花是增强抗虫性、抗除草剂、抗病能力的有效手段。在科技高速发展 的2 1 世纪，我国还将加快转基因食品研究开发与商品化应用。我国作为拥有1 3 亿人 口的农业大国，正在加快使用基因工程手段育种，加快产业调整力度，以确保我国粮 食等主要农产品安全、生物安全和生态环境安全，从而保障我国现代农业可持续及有 效解决“三农问题”的重点战略需求。 1 3 转基因抗虫棉的研究与应用 由于9 0 年代过度使用农药导致环境污染等众多问题，目前随着分子生物学技术 的不断进展，科学工作者开始利用基因克隆、d n a 操作等技术将b t 菌中的毒蛋白克 隆到工程菌中，从而出现了转b t 基因抗虫棉，经过数年的发展，直到现在转b t 基因 作物以及成为全球商品化程度最快的转基因抗虫作物。仅就b t 抗虫基因而言，迄今 已分离到4 万多个b t 菌株，有近1 3 0 个不同的b t 基因被克隆和测序，新的b t 基因 还在不断被克隆和分离。 b t 即苏云金芽孢杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ) ，它是一种革兰氏阳性土壤芽孢杆 菌，它可以分泌一种毒蛋白，在形成芽孢过程中，能产生一种对鳞翅目昆虫有毒杀作 用的杀虫晶体蛋白。伴孢晶体是b t 杀虫活性的主要来源，它可能由几种晶体蛋白即 6 内毒素组成，当被敏感昆虫摄食后，在碱性的肠道条件下溶解并被蛋白酶激活成毒 性多肽，此类毒素作用于中肠上皮细胞，破坏细胞的渗透平衡，引起细胞裂解，最终 导致昆虫死亡【1 2 】。b t 的不同亚种具有不同的晶体蛋白基因，1 9 9 5 年，c r i c h m o r e 等提 出了以b t 杀虫蛋白氨基酸序列的同源性为依据对b t 基因分类，第一等级用阿拉伯数 字表示，同源性在4 5 左右；第二等级用大写英文字母表示；同源性在4 5 - - - ，8 0 之 间同源性在8 0 0 旷9 5 之间的，用表示小写字母表示；同源性达9 5 及以上的，为第 四等级，用阿拉伯数字表示。 1 4 物种间的基因漂移现象 3 河北农业人学硕十学位( 毕业) 论文 基因漂移现象指的是一种生物的目标基因向附近野生近缘种的自发性转移，导致 附近野生近缘种内在的基因发生变化，分为水平基因转移，抗原性基因转移以及基因 重组，这些都属于基因变异的重要来源【l3 1 。病毒可以在物种间进行基因转移，细菌可 以通过整合到一些死亡的细菌上，从而与存活的细菌进行基因交换，并且在物种之间 通过质粒的形式进行交榭1 4 l 习。 表1 3 中给出了在微观世界中基因转移发生在水陆两地的可能性。游离性的核酸 片段经胞外酶裂解释放到环境中，从而形成了细胞外d n a 基因库【1 7 】。游离性的 d n a 有几种情况存在，如存在于水环境中或附着在土壤中的固体物质表面等。这些 胞外d n a 可以转化到感受态细胞中，或者被细胞吸收，但由于缺乏同源性或d n a 修饰不能被整合入受体基因组中，这类d n a 被胞外酶或胞内酶降解，产物可以被当 做营养物质吸收。 - ln u t r i e n t sl h e t e r o l 0 0 y d n ar e s t r i c t i o n 匦圆 图3 游离d n a 在水中环境与土壤环境的转换模式图( 引自l o r e n z ，m g1 9 9 2 ) t a b l e 3s c h 锄eo fg e n tt r a n s f e rb yf r e ed n ai nt h ea q u a t i ca n dt e r r e s t r i a le n v i r o n m e n t 植物d n a 的水平转移可以从理论上首先概括为有效性，即导入植物的外源基因 在植株腐烂或经动物消化后仍能保持所导入基因的有效长度，并且受体细胞能够吸收 外源d n a 。但是转基因作物的d n a 并非以质粒的形式释放到环境中的，而且实验室 进行的转化实验如p e g 介导法或电转化法都很难在自然条件下进行的，必须存在其 他转移方法如定植、受体细胞吸收、防止外源d n a 片段被降解等。s c h u b b e r te ta l 等曾报道植物d n a 在动物消化道内的残留组分能够通过胃肠道转移，饲养8 h 后， 小鼠血液中检测到植物d n a 片段。小鼠经喂养转基因大豆后，没有检测到大豆内源 基因片段和e p s p s 基因片段【l 引。小鸡经喂养b t l 7 6 玉米后，在血液、肌肉、肝脏、 肾脏中检测到1 9 9 b p 的植物叶绿体基因片段，并未检测到b t 基因片段，在排泄物和 4 转基冈培养料与平菇间基因水平转移现象的研究 蛋中未检测到外源基因片段【1 9 1 。用转b t 基因玉米饲喂猪，在所检测组织样品中检测 不到玉米特异性d n a 片段，但能检测到植物性叶绿体片段【2 u j 。j e n n i n g se ta l 于2 0 0 3 年曾研究报道了经饲喂转基因大豆的猪肉中，没有检测到大豆内源基因片段和转入基 因片段。同年，j e n n i n g s 也报道了饲喂转基因棉籽和转基因玉米的牛，通过p c r 和 s o u t h e m b l o t 检测牛奶、肝脏、肾脏中的外源片段，结果发现除检测到玉米内源片段 外，其他基因片段均未检出【2 1 1 。 d n a 分子能在极端环境中存活。在生物体内d n a 可以经消化，机械力剪切，水 解作用以及胃肠道酶的作用分解瞄】。在体外和自然环境中，微生物间的基因漂移现象 是很常见的【2 3 ，h i 。在细菌间基因转移现象中，土壤间的水平基因转移现象是较为普遍 的【2 5 , 2 6 】。1 9 9 6 年k m n i e l s e n 和e g e b h a r d 等研究报道了转基因植物与土壤中不动杆 菌b d 4 1 3 之间的基因转移现象【2 。7 1 。j w h o n ge ta l 在2 0 1 0 年通过使用真菌核糖体间 隔分析技术与定量p c r 技术研究了真菌菌群与土壤中金属离子之间的关系1 2 引。 1 5 转基因生物安全检测 1 5 1 转基因检测研究现状 随着转基因生物研究的日益扩大化，目前国外报道的转基因检测方法主要分为： 在核酸水平上进行检测以及在蛋白水平上进行检测两大类。核酸水平上的检测方法是 基于核酸为靶对象建立的，其中应用最广的要属聚合酶链式反应( p c r ) 技术，其灵 敏性高，特异性强，简便快速已收到国际接受和认可。而检测结果是否具有可信性的 前提和基础为提取到质量较高的核酸，因此，合适、科学高效的核酸提取方法的建立 在很大程度上决定了转基因产品检测的准确性。 由于不同样品的形式各不相同，以及来源和加工程度各不相同，决定了不同实验 样品核酸提取的多样性，不可能有一种能够适合所有样品及其核酸提取的方法，每一 种核酸提取方法的适用性及重复性会因不同样品而异，一种特定的d n a 提取方法的 性质依赖于被研究样品的性质。因此，对于样品性质的外在性质的不同，以及化学成 分、组织结构的内在差异，在提取样品基因组d n a 时需要针对样品选择不同的方法， 或相应的对方法进行调整。正如本实验研究对象是平菇，其中含有较多的多糖及酚类 等次生代谢产物，从而会影响d n a 的纯度及后续的分子生物学实验。因此，针对本 研究对象的特点，建立一种简单、快速、高效的基因组d n a 提取方法成为整个检测 过程中的关键步骤之一。 核酸制备包含样品细胞的裂解和纯化两个步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂 解体系中的过程，纯化则是使核酸与裂解体系中的其他成分，如蛋白质、盐及其他杂 质彻底分离的过程。分离纯化核酸总的原则是保证核酸一级结构的完整性和排除其他 分子的污染。因为遗传信息全贮存在一级结构中，并且核酸一级结构还决定其高级结 构的形式以及和其他生物大分子结合的形式。对于核酸纯化应达到以下三点要求：一 些生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染；核酸样品中不存在对酶有抑制作用 5 1 河北农业大学硕十学位( 毕业) 论文 的有机溶剂和高浓度的金属离子；d n a 分子的提取应去除r n a 。 1 5 2 核酸的提取和纯化 每一种样品材料d n a 的分离纯化都由以下几个步骤构成：破碎细胞；去除蛋白 质、多糖等大分子物质；沉淀核酸；去除盐类、有机溶剂等杂质；纯化干燥。从生物 材料中提取核酸首先需要裂解细胞，并且使细胞中的核酸酶失活，从而分离得到细胞 碎片中目标核酸。其次在充分裂解细胞的同时，也要充分温和保护目标核酸。即尽量 减少化学因素( 如过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏) ，以及其他物理因素( 如 机械剪切力、高温、反复冻融等) 的影响。实验室常用的经典的裂解液基本都含有去 污剂，如s d s 、t r i t i o nx - 1 0 0 、t w e e n2 0 ，以及盐n a c l 、e d t a 等。去污剂的作用在 于使蛋白质变性。破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，使得核酸游离在裂解体 系中。盐的作用在于提供一个合适的裂解环境，同时抑制样品中的核酸酶对核酸的一 级结构的破坏，维持核酸结构的稳定( n a c l 等) 。裂解液环境中也可以加入蛋白酶， 促使核酸与蛋白质分子相分离。从而通过纯化得到纯度较高的d n a 分子。 完善的r n a 提取方纯化方法主要包括以下几个关键点：样品细胞或组织的有效 破碎；蛋白复合体的彻底变性；内源性r n a 酶的有效抑制；r n a 与d n a 的有效分 离；对于含有较多次级代谢产物的杂质的有效去除。其中最关键的一步是如何有效抑 制r n a 酶活性。实验室普遍采取的r n a 提取方法有t r i z o l 法、异硫氰酸胍一酚法、 苯酚法和氯化锂沉淀法。从而建立完善的r n a 提取和纯化方法，为进行后续的 r t - p c r 、定量p c r 打下基础。 1 5 3p c r 检测策略 目前国际上对于g m o 及其产品的检测技术通常分为：以表达蛋白为目标的检测 方法；另一种是以外源d n a 为目标的检测方法。其中，以p c r 技术为基础的g m o 定性检测根据其特异性的不同至少分为4 类一筛查法、基因特异性方法、构建特异性 方法和转化事件特异性方法。 内参照基因是p c r 定性和定量不可缺少的参照物，在定性检测中，主要用于对 p c r 反应体系稳定性的校准和显示p c r 反应体系中是否含有反应抑制剂，以及d n a 模板的量是否达到检测的要求。随后，通过筛查p c r 是对转基因产品中的通用元件 进行检测，包括启动子、终止子和标记基因为特异性扩增片段，例如，c n m 乃船启 动子、n o s 终止子、以及n p t i i 、g u s 等标记基因。由于相同的通用元件和标记基因 经常会被用于多种转基因产品的研究与生产中，从而大大降低了筛选p c r 检测的特 异性，仅鉴定筛选基因已经不能满足转基因产品检测的要求，所以只能用于转基因产 品检测的初步筛选，以确定是否含有某种转基因成分。相比较而言，以目的基因为特 征序列的基因特异法更具有特异性，它是指对目的基因进行检测。以插入外源基因的 6 转基因培养料与平菇间基因水平转移现象的研究 特异性d n a 片段作为目的检测片段，如c r y l a c 、c r y l a b 等基因，从而确定是否含 有某种外源基因成分。 转基因棉花在全世界商业化的有8 个品种，种植面积最大的是抗虫转基因棉花。 在转基因抗虫转基因棉花中共同的特性即含有c a m v 3 5 s 启动子基因、n p t 口基因、 n o s 终止子，在抗虫转基因棉花中还有苏云金杆菌6 内毒素c r y l a c 基因。图4 所示 为本实验中使用的转基因抗虫棉m o n l 5 9 8 5 所引入的外源元件。外源基因c 巧i a c 来自苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种( 召t h u r i n g i e n s i ss u b s p k u r s m l a ) ，目标片段有 c 巧i a c 、c r y 2 a b ，由增强的c a m v 3 5 s 启动子等信号区调控。此外，选择性标记基 因有a a d 、咒p 以、u i d a 基因。 蹦 i 。飘 图4m o n l 5 9 8 5 的检测信息( 引i ；i g m od e t e c t i o nm e t h o dd a t a b a s e ) t 曲l 。4m o n l5 9 8 5i n t r o d u c e de l e m e n t s 1 6 我国平菇栽培的现状 础g d ll l 平菇( po s t r e a t u s ) 属于丝状真菌，是真菌植物门的子实体，属于丝状异养型生 物。菌丝体内不含叶绿素，不能通过光合作用产生必须的养分，只能靠菌丝体前端分 泌的胞外酶( 即多种酶的总称) 来分解和摄取自然界中营养成分，或从人工配制的培 养基中摄取营养物质来满足自身需要。同时，平菇栽培过程中需要大量的水分，以满 足自身的营养需求。对人类健康而言，平菇是一种蛋白质含量高，营养丰富，对提高 免疫力的作用，尤其优质平菇更是作为食用菌类保健品的重要来源。 优质菌种对改善平菇单产和质量起到了举足轻重的作用，决定了平菇菌种在食用 菌产业中的重要地位。食用菌的栽培原料非常广泛，以农作物下脚料为主要的栽培基 质，其中棉籽壳营养丰富是理想的栽培原料，利用棉籽壳栽培平菇，简便可行，节约 能源，生物转化率高。由于转b t 基因抗虫棉在我国大面积种植，充当食用菌培养料 的棉籽壳则必定占较大比重。而大量积累b t 基因是否会对周边环境产生不良影响， 值得我们深思。转b t 基因抗虫棉在提高棉花产量及品质方面有显著效果，同时由于 导入了b t 基因对鳞翅目害虫有明显的毒杀作用。也就是说转基因抗虫棉不仅在靶性 状( 如抗虫性) 方面发生变化，在非靶性状方面也可能出现相应的变化。因此，探索 b t 基因的流动方向具有很大的研究价值。 虽然转基因抗虫棉在治理棉铃虫害过程中起到了至关重要的作用，但它对生态环 境的影响是不可忽视的。如转基因食品中抗生素选择标记基因水平转移至病原菌而产 7 河北农业人学硕士学位( 毕业) 论文 生抗药性等一些非预期效应的影响。为了明确转基因棉对食用茵的影响，进一步研究 转基因棉花生物安全特性，国内科学研究人员对转基因培养料栽培平菇的情况有过一 些报道。2 0 0 5 年，徐宝梁等利用不同棉籽含量、转基因棉籽和非转基因棉籽栽培平 菇，并观察其对平菇生长产生的影响，结果发现b t 蛋白随着时间变化，贮存一年后 b t 蛋白含量会有明显降低，通过p c r 检测到了平菇菌种中存在部分外源片段【3 3 1 。同 年，王因霞等研究了使用转基因棉籽壳作培养基栽培平菇过程中对平菇害虫的影响， 结果表明由于外源b t 基因的导入，可能对棉花原有的缩合单宁及棉酚的代谢过程产 生一定影响，而这些代谢物质可能抑制一些幼虫如平菇厉眼菌蚊幼虫的生长，因此转 基因成分对不同昆虫的影响存在差别【2 9 1 。2 0 0 7 年于莉等利用转基因油菜籽栽培侧耳， 探索了转基因油菜籽d n a 的降解情况，进一步研究了侧耳同工酶的变化情况等。 由于核酸属于水溶性物质，根据相似相溶原理，d n a 分子可以溶解于水中，在 平菇组织中，水分可以通过平菇的导管运输至各个部位，此时的d n a 分子流是否会 成为影响基因漂移的主要因素有待我们探索研究。本研究利用转基因棉籽配制培养料 栽培平菇，了解培养料中的转基因成分对平菇生长的影响，通过分子生物学检测技术 研究转基因作物对非靶目标生物体影响的机理和机制，探索转基因棉籽壳在平菇栽培 生态系统中的安全性问题【3 0 】。 1 7 本研究的目的意义 近些年来，随着转基因抗虫棉的大面积推广与使用，抗虫转基因棉在农业生产中 暴露出一些问题，比如转基因抗虫棉的生物安全性问题，对非靶目标生物的影响等。 关于对转基因抗虫棉的生物安全性评价的研究报道较为全面，如对非靶标虫害种群的 影响，对天敌昆虫、有益生物的影响，对农田生态系统的影响以及基因漂移的影响。 但是，对于使用转b t 基因棉棉籽壳作为培养基与食用菌之间的基因转移现象的研究 尚未见具体报道。 本论文利用转基因棉籽为主要培养料栽培平菇，通过切片对平菇组织进行心态 学观察，建立转化事件等一系列研究，从而探索转基因成分与平菇间基因漂移现象， 研究转基因作物对非靶目标生物体影响，为转基因植物及非靶生物的分子检测提供了 一定依据，从而探讨转基因棉籽在平菇栽培生态系统中的安全性问题。同时，建立了 针对平菇这类食用菌的高效、快捷的基因组提取方法，为今后建立新型基因组提取试 剂盒的开发提供技术支持。 8 转基冈培养料与平菇间基因水平转移现象的研究 2 1 实验材料与设备 2 1 1 供试菌种与原料 2 材料与方法 转b t 基因棉花品种m 9 5 及其棉籽壳，普通棉籽壳为n g l l ，均由中国农业大学 食品科技学院提供。平菇菌种由中国农业大学食品科技学院食用菌实验室提供。 2 1 2 培养基与缓冲液 ( 1 ) 母种培养基：p d a 基本培养基：马铃薯1 5 0g 、麸皮5 0g 、琼脂2 0g 、葡萄 糖2 0g 、水1 0 0 0 m l 、p h 值自然。将马铃署去皮，洗净，切成小块，放入锅中加水 1 0 0 0m l 煮沸2 0m i n ，然后用纱布过滤取其汁液，用清水补足1 0 0 0m l ，然后加入 琼脂和葡萄糖加热使其溶化，用玻璃棒将培养基搅匀，然后分装到试管。用于平菇 母种的栽培； ( 2 ) 原种培养基：转b t 基因棉籽壳7 0 、麸皮2 6 、糖1 、石膏1 、石灰2 ，料水比为l ：1 2 1 4 ；普通棉籽壳7 0 、麸皮2 6 、糖l 、石膏1 、石灰 2 ，料水比为l ：1 2 1 4 。将称好的棉籽皮和麸皮充分混合均匀，将糖、石灰、石 膏、溶于水中来搅拌培养料，使其含水量达6 0 - - 6 5 ，用手取一把拌好的培养料用 力握，手指间有水滴出现，但不滴下即可，这时料含水量达6 0 ，料堆3 0 分钟后 准备装瓶。用于平菇原种的栽培； ( 3 ) c t a b 缓冲液( 十六烷基三甲基溴化铵) ：1 0 0 m m o l l t r i s - h c i ( p h8 o ) ，6 m o l l n a c l ，2 0m m o l le d t a ，2 0g lc t a b ；苯酚氯仿溶液1 ：l ( v v ) 。1 0 x p c rb u f f e r ， 1 0 0m m o l l i r i s h c l ，5 0 0m m o l lk c l ，1 5m m o l lm g c l 2 ，0 2 8 巯基乙醇( v v ) ； ( 4 ) 2 s d s 缓冲液( 十二烷基硫酸钠) ：蛋白酶k ( 2 0m g m l ) ，1 x t e 缓冲液，lm t r i s h c i ( p h 8 o ) 1 0 0m l ，5 0 0m me d t a ( p h8 o ) 2 0m l ； 2 1 3 主要试剂 ( 1 ) d l 2 0 0 0d n a m a r k e r ( 3 0 0n g 5 肛l ) ，大连宝生物工程有限公司； ( 2 ) 大肠杆菌株d h 5 a 、质粒p g e m te a s y ( 图2 1 ) 、r n a s e 、溶壁酶( 5 0 0u m l ) 、 t a qd n a 聚合酶( 5u # t l ) 、各1 0m m o l l 的四种脱氧核糖核苷酸( d a t p ，d c t p ，d g t p ， d 1 - r p ) 混合液，购自s i g m a ( 美国) 公司； ( 3 ) 甲基绿染色剂购于上海如吉生物技术有限公司； ( 4 ) 其它试剂或溶剂均为分析纯或生化纯； ( 5 ) 质粒抽提所用的溶液： 溶液i 【5 0m m o l lg l u c o s e ，1 0m m o l le d t a ( p h 8 0 ) ，2 5r n m o l lt r i s - h c l 9 河北农业大学硕十学位( 毕业) 论文 ( p h 8 o ) 】， 溶液i i i s d s ，0 2m o l ln a o h ， 溶液i i i 6 0 5m o l k a c ，1 1 5 h a c ，2 8 5 d h 2 0 ( v v ) 】， d n a 抽提缓冲液：0 3 5m o l l 葡萄糖，0 1m o l lt r i s h c l ，0 0 0 5m o l le d t a2 p v p ( k 3 0 ) ( w v ) ，0 1 d i e c a ( w v ) ，使用前加入2 1 3 - 巯基乙醇( v v ) 。 ( 6 ) i n v i t r o g e nt r i z o l 试剂： ( 7 ) 7 5 乙醇( 用d e p c 处理水配制7 5 乙醇，然后装入高温烘烤的玻璃瓶中， 存放于低温冰箱) ； ( 8 ) 溴化乙锭( 1 0m g m l ) ：在1 0 0m l 水中加入lg 溴化乙锭，磁力搅拌数小时， 用铝箔包裹容器或棕色瓶盛放，于室温保存； ( 9 ) t e 溶液( p h 8 o ) 1 0 0m l 体系：1 0m l t r i s c 1 母液( 1m o l l p h 8 o ) ，2m l e d t a 母液( 0 5m o l lp h 8 o ) ，定容1 0 0m l ，配置成t r i s c 1 浓度为1 0 0m m ，e d t a 浓 度为1 0m m 高压灭菌，室温保存。 2 1 4 主要仪器设备 ( 1 ) b x 4 1 p 日本奥林巴斯专业偏光显微镜，上海赖氏电子科技有限公司； ( 2 ) 电热恒温水浴锅h h s y 2 h u i ，北京市长风仪器仪器公司； ( 3 ) a s p 3 7 0 0 型紫外分光光度计，美国a c t g e n e 公司； ( 4 ) f a l 0 0 4 1 3 电子天平，上海越平科学仪器有限公司； ( 5 ) d y y - 6 c 型电泳仪，北京市六一仪器厂； ( 6 ) p h x 型智能生化培养箱，宁波莱福科技有限公司； ( 7 ) p c r 仪，b i o r a da l d 1 2 4 4 ； ( 8 ) 紫外投射仪g e l d o c i tp n9 5 0 4 4 1 0 2 ； ( 9 ) e n f o 9 8 0 1 7 9 振荡摇床； 、 2 2 实验方法 2 2 1 平菇养殖 平菇生长发育的过程分为菌丝体的营养生长阶段和子实体的繁殖生长阶段。使用 转b t 基因棉花的棉籽壳作为平菇养殖培养料，和普通棉花培养料进行比较，初步研 究转基因成分对平菇生长发育的影响。 2 2 1 1 母种制备 将做好p d a 培养基7 支试管为一把加牛皮纸捆成一把( 共计1 4 支) ，放进加好 1 0 转基因培养料与平菇间基冈水平转移现象的研究 水的高压锅内，然后盖好锅盖，拧紧螺丝，开始加热，灭菌，将灭好菌的试管放在桌 子上摆成斜面。使培养基前端在试管1 3 处，培养基凝固后，用于接种。接种工作在 超净台中进行，将无菌的试管和母种、接种工具、