DNA测序技术课件.ppt

DNA测序技术,吴子君,2019/12/13,DNA测序技术,第一代DNA测序技术,第二代DNA测序技术,第三代DNA测序技术,第四代DNA测序技术,1、第一代DNA测序技术,传统的化学降解法、双脱氧链终止法以及在它们的基础上发展来的各种DNA测序技术。,第一代DNA测序技术包括：化学降解法、双脱氧链终止法和荧光自动测序技术。,1.1、化学降解法,基本原理:利用特异的选择性试剂，专一性的随机断裂DNA成不同长短的片段。根据试剂的选择性及片段在高分辨力的聚丙烯酰胺凝胶电泳上的区带位置，判断DNA片段末端核苷酸的种类，从而测出DNA的序列。,将双链DNA样品变为单链每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记,以便显示DNA条带分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的降解DNA群体电泳,读取DNA的核苷酸顺序,1.1、化学降解法-技术路线,化学降解法原理图,1.2、双脱氧链终止法（Sanger法）,原理：利用DNA聚合酶，以待测单链DNA为模板，以dNTP为底物，设立四种相互独立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）作为链延伸终止剂。在测序引物引导下，按照碱基配对原则，每个反应体系中合成一系列长短不一的引物延伸链，通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后，从凝胶底部到顶部按53方向读出新合成链序列，由此推知待测模板链的序列。,1.2、双脱氧链终止法（Sanger法）,Sanger法测序原理图,1.2、双脱氧链终止法（Sanger法）,Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。后来在此基础上发展出多种DNA测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。,1.3荧光自动测序技术,荧光自动测序技术基于Sanger原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了DNA测序的速度和准确性。,目前，应用最广泛的应用生物系统公司(appliedbiosystems，ABI)3730系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的DNA测序仪。如ABI3730XL测序仪拥有96道毛细管，4种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记，在通过毛细管时不同长度的DNA片段上的4种荧光基团被激光激发，发出不同颜色的荧光，被CCD检测系统识别，并直接翻译成DNA序列。,第一代测序技术在分子生物学研究中发挥过重要的作用,如人类基因组计划(humangenomeproject,HGP)主要基于第一代DNA测序技术。目前基于荧光标记和Sanger的双脱氧链终止法原理的荧光自动测序仪仍被广泛地应用。,随着人类基因组计划的完成,人们进入了后基因组时代,即功能基因组时代,传统的测序方法已经不能满足深度测序和重复测序等大规模基因组测序的需求,这促使了新一代DNA测序技术的诞生。新一代测序技术即第二代测序技术。,2、第二代DNA测序技术,第二代测序技术，主要包括罗氏454公司的GSFLX测序平台、Illumina公司的SolexaGenomeAnalyzer测序平台和ABI公司的SOLiD测序平台。,第二代测序技术最显著的特征是高通量,一次能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测序,使得对一个物种的转录组测序或基因组深度测序变得方便易行。,第二代测序技术将片段化的基因组DNA两侧连上接头,随后用不同的方法产生几百万个空间固定的PCR克隆阵列。每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成。然后进行引物杂交和酶延伸反应。由于所有的克隆都在同一平面上,这些反应就能够大规模平行进行,每个延伸反应所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行,从而获得测序数据。DNA序列延伸和成像检测不断重复,最后经过计算机分析就可以获得完整的DNA序列信息。第二代测序技术包括：454测序技术、Solexa测序技术和SOLiD测序技术。,2、第二代DNA测序技术,原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的作用下，将每一个dNTP的聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来，通过检测化学发光信号的有无和强度，达到实时检测DNA序列的目的。,2.1、454测序技术,2019/12/13,17,可编辑,Illumina公司的新一代测序仪GenomeAnalyzer最早由Solexa公司研发，利用合成测序(SequencingbySynthesis)的原理，实现自动化样本制备及大规模平行测序。核心技术：“DNA簇”和“可逆性末端终止”。原理：将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面（即Flowcell），这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在Flowcell上形成了数以亿计Cluster，每个Cluster是具有数千份相同模板的单分子簇。然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性终止的SBS（边合成边测序）技术对待测的模板DNA进行测序。,2.2、Solexa测序技术,2.3、SOLiD测序技术,SOLID通过连接反应进行测序。其基本原理是以四色荧光标记的寡核苷酸进行多次连接合成，取代传统的聚合酶连接反应。具体步骤包括：,文库准备,扩增,微珠与玻片连接,连接测序,超高通量是SOLID系统最突出的特点，目前SOLID单次运行可产生50GB的序列数据，相当于17倍人类基凶组覆盖度。,第三代测序技术是以单分子测序为特点的测序技术。以PacBio公司的SMRT和OxfordNanoporeTechnologies纳米孔单分子测序技术。与前两代相比，他们最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增。,3、第三代DNA测序技术,3.1、PacBioSMRT技术,PacBioSMRT技术其实也应用了边合成边测序的思想，并以SMRT芯片为测序载体,与以往的测序技术皆不同，它是基于电信号而不是光信号的测序技术。该技术的关键之一是，他们设计了一种特殊的纳米孔，孔内共价结合有分子接头。当DNA碱基通过纳米孔时，它们使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度（每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的），灵敏的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基。,3.2、纳米单分子测序技术,目前还有一种基于半导体芯片的新一代革命性测序技术IonTorrent。该技术使用了一种布满小孔的高密度半导体芯片，一个小孔就是一个测序反应池。当DNA聚合酶把核苷酸聚合到延伸中的DNA链上时，会释放出一个氢离子，反应池中的PH发生改变，位于池下的离子感受器感受到H+离子信号，H+离子信号再直接转化为数字信号，从而读出DNA序列,3.3、IonTorrent,原位测序技术：传统的核酸测序技术需要将所要测序的DNA或者RNA从细胞或者组织中分离