（化学工程专业论文）全细胞催化合成dβ羟基异丁酸的工艺研究.pdf

全细胞催化合成d 1 3 羟基异丁酸的工艺研究 摘要 d b 一羟基异丁酸( d h i b a ) 是合成卡托普利的关键中间体，同时也是维生素、 香料、抗生素的重要合成原料。生物催化合成d h i b a 具有着原料广泛、不需要 辅酶分离和再生、反应过程中不需要中间产物的分离等优点。本文采用褶皱假丝 酵母催化合成d h i b a ，从生物催化剂的制备、转化底物的选择、发酵条件的优 化和利用反应萃取工艺等几方面进行了研究提高产物收率。 采用褶皱假丝酵母催化合成d b 一羟基异丁酸，由于菌体细胞作为反应的催 化剂，所以其催化活力对反应有着至关重要的影响。本研究采用稀释涂平板法对 菌种进行自然选育，得到高活力菌株。 不同的转化底物对菌体生长和产物d h i b a 的合成有着显著影响，菌体在含 i b a 的培养基中的生长能力大于在含m a 培养基中的生长能力。但在产物d h i b a 的合成方面，以m a 为底物时菌体的合成能力较强，当培养基中i b a 和m a 的 浓度分别为2 0 9 l 时，培养9 6 h 时合成产物d h i b a 的浓度分别为3 9 8 9 l 和 4 5 6 9 l 。以m a 为底物合成d h i b a 比以i b a 为底物时，反应快，产物得率高。 通过单因素实验对反应条件进行了优化，得出最适反应初始条件：m a 浓度 为1 0g l ，葡萄糖浓度为3 0g l ，p h 为7 5 ，温度为2 8 。c 。在该培养条件下，菌 体培养1 2 0 h ，菌体生物量和d h i b a 的产量均达到最大，菌体浓度为1 3 2 3g t , ， d h i b a 的产量为4 9 9 9 l 。通过响应面分析进一步优化反应条件，确立最优反应 条件为：m a 浓度为1 3 6 2 9 l 、p h 为7 5 7 、g l u 浓度为3 3 2 2 9 l ，在该培养条件 下培养1 2 0 h ，菌体量达到1 5 6 4 9 l ，产物浓度达到5 4 3 l 。 利用原位反应萃取耦合工艺对d h i b a 的合成工艺进行改进，研究了不同萃 取体系对菌体生长和产物合成的影响，得出三辛胺和油醇作为萃取体系较好，通 过条件优化得出最优萃取条件为：p h 为5 8 ，有机相与水相的比为1 ：5 ，三辛 胺的含量为4 0 ，在此条件下发酵1 2 0 h ，生物量达到ll g l ，d h i b a 的浓度达 到4 4 5g l ，生成的产物立即被萃取，产物没有被进一步氧化分解。该技术简化 了d h i b a 的工艺路线，提高了产物的得率。 关键词：褶皱假丝酵母d p 羟基异丁酸 甲基丙烯酸反应萃取耦合工艺 s t u d y o nd p - h y d r o x y i s o b u t y r a t ea c i ds y n t h e t i ct e c h n i q u e b y w h o l e - - c e l lc a t a l y s i s a b s t r a c t d p - h y d r o x y i s o b u t y r a t e ( d h i b a ) i st h ek e yi n t e r m e d i a t ef o rs y n t h e s i so fc a p t o p r i l ，a n d i sa l s ot h ei m p o r t a n tr a wm a t e r i a l sf o rv i t a m i n s ，s p i c e sa n da n t i b i o t i c s a sf a ra st h e b i o c a t a l y s i so fd h i b a b ec o n c e r n e d , t h e r ea r es o m ea d v a n t a g e s 、析mr a wm a t e r i a ls u p p l i e d e a s i l y , w i t h o u ts e p a r a t i o na n dr e g e n e r a t i o nf o rc o e n z y m e ，d i s u s i n gt h es e p a r a t i o nf o r i n t e r m e d i a t ep r o d u c t t h ep u r p o s eo ft h ep r e s e n tw o r ki st oi m p o v ey i e l do fd h i b a ，t h e s p e c i f i cm e t h o da d o p t sc a n d i d ar u g o s a st os y n t h e s i z e a tt h es a m et i m e ，t h ep r e p a r a t i o no f b i o c a t a l y s t ，t h es e l e c t i v i t yo fs u b s t r a t s ，o p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o nc o n d i t i o na n du s eo f r e a c t i o n - e x t r a c t i o nt e c h n o l o g ya r ei n v e s t i g a t e d d u et ot h ec a t a l y t i ca c t i v i t yo fc a n d i d a r u g o s a s t h a l l if o rt h ei m p o r t a n te f f e c t so fd h i b a s y n t h e s i s i nt h ee x p e r i m e n t , t h ew a yo fd i l u t i o nc o a t i n gp l a t ew a sa d o p t e dt on a t u r a l ys e l e c t m i c r o b i a ls t r a i n s ，a n dh i g ha c t i v es t r a i nw a so b t a i n e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a ti ti sr e m a r k a b l ei n f l u e n c ef o rt h a l l ig r o w t ha n dd h i b a s y n t h e s i s 、析md i f f e r e n tc o n v e r s i o ns u b s t r a t e s t h eg r o w i n ga b i l i t yo ft h a l l ii nc u l t u r em e d i u mi n c l u d i n g i b ai sg r e a t e rt h a nc u l t u r em e d i u mi n c l u d i n gm a h o w e v e r , t h et h a l l if o rd h i b a s y n t h e s i s w i t hm aa ss u b s t r a t ei sm o r ee f f e c t i v et h a n 、析mi b aa ss u b s t r a t e w h e nc o n c e n t r a t i o no fi b a a n dm ai nc u l t u r em e d i u ma r e2 0 9 l ，c u l t u r e df o r9 6 ha n dt h ec o n c e n t r a t i o no fd h i b ai s 3 9 8 9 la n d4 5 6 9 lr e s p e c t i v e l y m a k e i n gu s eo fm a a ss u b s t r a t et os y n t h e s i z ed h i b ai n c o m p a r i s o n 谢mi b a a ss u b s t r a t e ，i tc a l lb eg o tm o r ef a s tr e s p o n s ea n dh i g hy i e l df o rd h i b a t a k i n ga d v a n t a g eo fs i n g l ef a c t o re x p e r i m e n tm e t h o dt oo p t i m i z er e a c t i o nc o n d i t i o n s ，t h e a d a p t a b l ei n i t i a lr e a c t i o nc o n d i t i o n sw a sa c q u i r e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec o n c e n t r a t i o no f m ai s10 9 l ，c o n c e n t r a t i o no fg l u c o s ei s3 0 9 l ，p h7 5 ，r e a c t i o nt e m p e r a t u r ei s2 8 ca n d c u l t u r e dt h a l l if o r12 0 h ，t h et h a l l ib i o m a s sa n dt h ey i e l do fd h i b aa r eb o t ht h eb e s t ，r i g h tn o w t h ec o n c e n t r a t i o no ft h a l l ii s 1 3 2 3 9 la n dd h i b ar e a c h s4 9 9 9 l b ym e a n so fr e s p o n s e s u r f a c em e t h o d o l o g ya n a l y s i st of t l r t h e ro p t i m i z er e a c t i o nc o n d i t i o n s ，t h eo p t i m u mr e a c t i o n c o n d i t i o n sw a sd e t e r m i n e d t h eo p t i m u mr e a c t i o nc o n d i t i o n si n c l u d e dt h a tt h ec o n c e n t r a t i o n o fm ai s1 3 6 2 9 l ，p h7 5 7 ，t h ec o n c e n t r a t i o no fg l ui s3 3 2 2 9 l ，c u l t u r e df o r1 2 0 h , t h e t h a l l ib i o m a s si s l5 6 4 9 la n dd h i b ar e a c h s4 9 9 9 l u s i n gi ns i t ur e a c t i o na n d e x t r a c t i o nc o u p l i n gt e c h n o l o g yt oi r n p o v et h ed h i b a s y n t h e s i s ，t h e d i f f e r e n te x t r a c t i o ns y s t e mf o rt h ee f f e c to ft h eg r o w t ho ft h a l l ia n dd h i b a s y n t h e s i sw a s o b s e r v e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a to l e y la l c o h o la n dt r i o c t y l a m i n e ( t o a ) a se x t r a c t i o ns y s t e m i sb e t t e r b yw a yo fo p t i m i z i n ge x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s ，t h eo p t i m u me x t r a c t i o nc o n d i t i o n si s a t t a i n e d w h e np hi s5 8 ，t h er a t i oo fo r g a n i cp h a s ea n dw a t e rp h a s ei s1 ：5 ，t h ec o n t e n to ft o a i s4 0 ，c u l t u r e df o r12 0 h ，t h ec o n c e n t r a t i o no ft h a l l ic a l lb eg o t1lg la n dd h i b ar e a c h s4 4 5 g l t h eg e n e r a t e dd h i b ai s e x t r a c t e di m m e d i a t e l y ，a n di sn o tf u r t h e ro x i d i z e da n d d e c o m p o s e d t h ei ns i t ur e a c t i o na n de x t r a c t i o nc o u p l i n gt e c h n o l o g ys i m p l i f i e st h ep r o c e s so f d h i b a s y n t h e s i s ，a n dh e i g h t e nt h ey i e l do fd h i b a k e y w o r d s ：c a n d i d ar u g o s a , d p h y d r o x y i s o b u t y r a t e ，m e t h a c r y l i ca c i d , r e a c t i o na n d e x t r a c t i o nc o u p l i n gt e c h n o l o g y 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。 本人允许论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研 究所等机构将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库或其它 相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：毯姿驽 指导教师签名： 卅年占月f 7 日 b r 口年多月夕日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研 究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和 致谢的地方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：。苏嘎弱 锄扩年易月7 日 勘误声明 致广大读者： 本硕士学位论文全细胞催化合成d b 一羟基异丁酸的工艺研究 在答辩过程中，相关老师指出论文中的图表没有添加对应的英文标 题，应予以修改添加。但由于论文提交时间紧迫，翻译后未来得及经 老师和同学的修改，论文中难免还会有错误和漏洞，由此带来阅读的 不便，本人表示诚挚的歉意。请广大读者予以谅解! 作者：放运考 2 0 10 6 17 西北大学硕士学位论文 1 1 引言 第一章绪论 进入2 1 世纪以来，生物催化作为生物技术的一个重要组成部分，已经成为高新技 术中最具发展潜力的前沿和交叉性学科之一，它与人们的生活息息相关，应用范围遍及 医药卫生、轻工食品、化工能源、环境保护等各个领域。为解决人类的食品、健康、环 境和能源的诸多重大问题提供了科学手段并开辟了新途径。“十一五”时期是世界现代 生物技术进入大规模产业化的重要阶段，生物催化作为现代生物技术的重要组成部分， 对生物技术的产业化起着至关重要的作用。 化学在人类社会发展的历史长河中起着非常重要的作用，它极大提高了人类的物质 文明，但同时造成严重的环境污染，主要包括有毒的有机试剂、重金属离子、碳氮氧化 物等，使人类的生活环境迅速恶化，给人们提出了新的挑战。绿色化学是指用化学的技 术和方法减少和消灭化学过程中产生的有害物质，是从根本上消灭污染，而非污染后治 理【l , 2 1 。生物催化剂使用后可被微生物降解，不需要进一步处理，对环境没有污染，是环 境友好型催化剂；生物催化剂具有高度的立体选择性，能使潜手性化合物只生成两个对 应体中的一种，避免了无用对应体的生成。从而减少废物的排放，这是绿色化学研究的 重要组成部分。因此，生物催化合成手性化合物将成为绿色化学研究的重要领域，具有 很好的发展前景【l ，3 j 。 1 2 生物法合成 1 2 1 全细胞催化合成的意义 在生物催化的手性合成反应中，可以用离体酶或完整细胞作为催化剂。反应中使用 何种形态的酶取决于多方面的因素，如反应的类型、辅酶、辅酶的循环等。许多酶催化 反应需要辅助因子或辅酶才能进行反应【4 ，5 一。细胞能合成这些因子，用全细胞进行转化 则不需要添加这些辅助因子。当用纯酶进行催化反应时则需要添加辅助因子。a t p 、 n a d h 和n a d p h 是最常用的辅酶，它们一般价格昂贵【1 1 ，所以在反应中必须采用另一 种特殊的酶使它们能在原位再生而反复使用。这样降低了反应的经济性，同时还容易产 生新的副产物。 1 2 2 生物法合成的特点 第一章绪论 由于生物催化技术是利用微生物进行生产的一门技术，所以它有自身的特点。 1 、能够定向创造对人类有用的新物质。基因工程技术的出现，使人们可以定向改 造原有的微生物，使其产生对人类有用的物质。 2 、大多数微生物的生长繁殖和代谢生产物都是在比较低的温度下进行的，与化学 反应相比，反应条件温和得多，因此可以节约大量的能源和冷却水，在现代这个提倡低 碳的时代显得尤为重要。同时，微生物适宜的p h 接近中性，减轻了对设备的腐蚀和对 环境的污染。 3 、微生物发酵生产所用的原料通常以碳水化合物为主，这些资源是可再生的，来 源广泛，不完全依赖地球上有限的不可再生资源。 4 、微生物生长繁殖速率快、发酵时间短、转化率高，可以大大缩短生产周期，提 高设备的利用率，降低生产成本。 5 、微生物发酵产生的有毒副产物少，生物制品有可靠的安全性。 6 、微生物通过定向的反应能产生单一的手性对应体，不需要化学的拆分，不对称 合成已成为手性技术发展的主流方向。 1 3 选题意义 1 3 1 卡托普利的用途 高血压已经成为威胁人类健康的主要疾病之一，对其研究已经成为科学研究的热 点。研究发现卡托普利是治疗高血压的最有效地药物。 卡托普利( c a p t o p r i l ) ，又名巯甲丙脯酸，是第一个口服血管紧张素转化酶抑制剂类药 物，抑制血管紧张素i 转化为血管紧张素i i ，具有降低血压作用，对肾性高血压、原发 性高血压及常规药物无法治疗的高血压均有效。它可以单独应用作为抗高血压的首选药 物，治疗轻度或中度原发性或肾性高血压，也可以与其他抗高血压药如利尿药、钙拮抗 药等联合应用叨。卡托普利除了应用于降低高血压外，对慢性心脏功能不全患者能改善 心脏泵血功能，增加血液心脏排出量，并能通过减轻心脏负荷、扩展冠状血管等作用， 降低急性心梗死的死亡率，提高患者的存活机率7 ，引。 1 3 2 卡托普利性质 卡托普利的结构式，如图1 1 所示。 2 西北大学硕士学位论文 o s h 图1 - 1 卡托普利的结构式 f i g 1 - 1t h es t r u c t u r eo fc a p t o p r i l 卡托普利为白色或类白色结晶粉末，有类似蒜的特臭，味咸。在乙醇、氯仿或甲醇 中易溶，在水中能溶。分子量为2 1 7 3 。熔点为1 0 4 1 1 0 。 由图1 1 可以看出，卡托普利有两个手性中心，不同对映体的药物活性也是不相同 的，其中s 型对映体是r 型药物活性的1 0 0 倍以上【l 】，因此药物分子应为( s ，s ) 构型。 传统化学合成法生产非对映混合物( r s + s s ) ，然后用二环已胺成盐后分离得n ( s ，s ) 异构 体产物。在此合成过程中存在着手性化合物的分离难、操作步骤复杂、产率不高等问题。 因此现代合成卡托普利一般采用化学与酶结合的方法【9 】。 1 3 3 卡托普利的化学一酶法合成路线 卡托普利的化学酶法合成是将化学与生物相结合，手性化合物的合成步骤采用生 物法，而其余步骤采用化学法，具体合成路线见图1 2 ： , c 0 2 h i 。似c o c l 0 c a n d i d ar u g o s a 坐譬y s j c 0 2 h 2 c h a o h n h 3 ( a ) o s _ c a p t o p r il 1 s o c l z 2 早刚栅 h 。 叫 ， c 拼 人趴 队 州 第一章绪论 c l o s 。c a p t o p rii ( b ) 图1 - 2 卡托普利的合成路线 f i g 1 2t h es y n t h e t i c a lr o u t eo fc a p t o p r i l 图1 2 所示两种路线都是通过生物化学法合成卡托普利，路线( a ) 采用假单胞菌脂 或黑曲霉脂肪酶拆分0 【甲基p 乙酰硫代丙酸得到( s ) 一型对映体，再经氯酰化后，再与l 脯氨酸反应生成卡托普利。路线( b ) 采用褶皱假丝酵母将异丁酸立体选择氧化为( d ) a 甲 基1 3 羟基丙酸后，再与l 脯氨酸反应后，经巯基化可得到卡托普利【l 】。由合成路线可以 看出( b ) 较( a ) 合成路线更为简单，且利用c a n d i d ar u g o s a 菌种合成d h i b a 时不需要辅 酶分离和再生，既节省成本又减少环境的污染。因此路线( b ) 已成为目前合成卡托普利 的首选方法。其中手性对映体d h i b a 的合成成为卡托普利合成路线中的关键步骤。 1 4d p 羟基异丁酸的研究进展 1 4 1d h i b a 的性质 d p - 羟基异丁酸的结构式： 图1 - 3d p 羟基异丁酸的结构式 f i g 1 - 3t h es t r u c t u r e o fd - p - h y d r o x y i s o b u t y r a t e d p 羟基异丁酸为无色晶体，易溶于水、醇和醚，沸点为1 2 8 1 3 4 c ( 1m m h g ) ，熔 点7 5 。c 7 8 c ，旋光度为 仅】2 4 ：+ 2 8 6 2 ( c = 1 2 3 ，m e t h a n 0 1 ) 1 0 1 。 1 4 2d h i b a 的化学合成路线【1 1 】 -r 4 西北大学硕士学位论文 常旦全 旦 o hoo ho m c h 3 c n rn a l 0 4 图1 - 4d h i b a 的化学合成路线 o r f i g 1 - 4t h es y n t h e t i c a lr o u t eo fd - p - h y d r o x y i s o b u t y r a t e 取5 0 9 的l s 叔丁基二甲基1 环己基2 丁酮溶于1 0 0 m e 的二氯乙烷溶液中，然后 将其加入到冷的4 0 4 m l 的二异丙基乙基胺中，再向其中加入5 3 m l 二环戊基三氟甲烷 磺酸。在o 搅拌2 5 h 后，将溶液降温到7 8 。同时将多聚甲醛加热到1 4 0 使其产生 气态甲醛，并和氩气一起通入到上述溶液中。于6 0 搅拌o 5 h ，然后将其升温至0 c 。 将5 0 m l 甲醇、5 0 m l 磷酸盐缓冲液( p h = 7 ) 和2 0 m l 3 0 的过氧化氢依次加入反应液中， 室温下搅拌0 5 h ，生成丁间醇醛式化合物。 将这种丁间醇醛式化合物在0 c 下溶解到5 4 m l 8 的氟化氢甲氰溶液中，将所得的 溶液在室温条件下搅拌4 h 。加入碳酸氢钠调节p h 至6 后，经过萃取操作得到粗品。萃 取溶剂的配制：将6 8 9 的高碘酸钠加入到体积比为3 0 甲醇水溶液1 0 0 m l 。混合液在 室温下搅拌4 h ，静置分层，可以除去中性的副产物环己烷基甲醛，用气态重氮甲烷处理 下层萃取液，然后进行蒸馏，得到化合物d 1 3 羟基异丁酸甲酯。 1 4 3 d p 羟基异丁酸的生物法合成 本研究采用c a n d i d ar u g o s a 菌种催化氧化底物m a i b a 合成d h i b a ，其本质利用 多种酶进行催化合成反应。 1 4 3 1 生物法合成d h i b a 的研究现状 d h i b a 的合成成为了卡托普利合成的关键，所以对d h i b a 的合成工艺的研究及改 进成为人们关注的热点。生物法合成d h i b a 首先是由h a s e g a w a 等人发现的。h a s e g a w a 等利用c a n d i d ar u g o s ai f o0 7 5 0 菌种于1 9 8 1 年成功催化底物i b a 合成了d h i b a 12 1 3 1 。 利用发酵罐培养d h i b a 的产率达到2 1 7 9 l 。但底物的摩尔转化率不高没有达到5 0 。 同时h a s e g a w a 等【1 4 】也发现利用m a 也, - i p a 合成d h i b a 。但其没有对以m a 为底物合 成d h i b a 进行进一步的研究。1 9 9 6 年l e e 等通过菌种的诱变提高了产物的摩尔转化率， 可以达到9 6 ，但其产率只有3 6 6 9 l 【1 5 1 ，无法满足工业生产。 1 9 9 7 年l e e 等通过控制葡萄糖的量合成d h i b a 其产率可以达到l o o g l ，但转化率 第一章绪论 只能达到5 0 。并且生产强度不高。l e e 等经过进一步研究发现，以m a 为底物其生产 强度可以达到0 8 6 9 l h ，转化率达到7 0 t 1 6 1 。 1 4 3 2 生物催化合成d h i b a 的机理 在1 9 7 2 年，m a r s h a l l 和s o k a t c h 通过理论研究发现v a l i n e ( 高血压肽) 的分解路线 就是d h i b a 的合成路线。其分解路线为：缬胺酸+ a - 酮异戊酸一异丁酰氧基c o a _ 异丁 烯酰氧基c o a _ p 羟基异丁酸c o a - - - , d h i b a t l 7 1 。 由其分解路线可以看出，不但i b a 可以作为合成d h i b a 的底物，m a 也可以用来 合成d h i b a 。并且d h i b a 的合成是在多个酶共同作用下完成的。 具体的合成机理见图1 5 ： c o o h + c o a _ c o o - c o a c o o h + c o a c 0 0 = - c o a h 入咖一二 c o d c o a c o 沪c o a c o o c o a ( 1 1 ) ( 1 - 2 ) ( 1 3 ) 季 入湖一( 1 4 ) 季 h o v 洲( 1 - 5 ) 图1 - 5d h i b a 的生物合成机理 f i g 1 - 5t h es y n t h e t i c a lm e c h a n i s mo fd - p - h y d r o x y i s o b u t y r a t e 其中( 1 1 ) ( 1 3 ) ( 1 - 4 ) ( 1 5 ) 表示以i b a 为底物合成d h i b a 的反应机理，( 1 2 ) ( 1 - 3 ) ( 1 - 4 ) 6 西北大学硕士学位论文 表示以m a 为底物合成d h i b a 的反应机理。从合成机理可以看出，以i b a 为底物的合 成过程也是要先合成异丁烯酰氧基c o a ，而以m a 为底物的合成时m a 直接与辅酶结 合，然后进一步合成d h i b a ，所以合成的速率和转化率主要取决于i b a 与辅酶a 的结 合能力，m a 与辅酶a 的结合能力以及i b a c o a 向m a c o a 转化的能力。 1 4 3 3 生物法合成d h i b a 的过程 生物催化合成d h i b a 的本质是利用酶进行催化反应，它涉及多种酶参与的一个从 头开始合成的生命过程。生物法合成d h i b a 的一般过程如下图1 6 所示 i 生物催化剂的制备 l 原料及其处理 图l - 6 生物反应合成d h i b a 过程示意图 r i g 1 - 6t h es y n t h e t i c a lr o u t e o fd - p h y d r o x y i s o b u t y r a t eb yt h eb i o t e c h n o l o g i c a lm e t h o d 由图1 - 6 可以看出，生物合成d h i b a 的过程主要包括原材料的预处理、生物催化 剂的制备、生物反应操作条件的确定、培养基组分的确定和产物的分离纯化五部分。与 传统化学法合成d h i b a 相比较生物法合成d h i b a 过程的最本质特征是有生物催化剂 参与反应。 1 4 3 4 生物法与化学法合成d h i b a 的比较 以上介绍了化学法和生物法合成d h i b a 的工艺，但它们有着各自优缺点。现在对 这两种方法进行综合比较见下： 7 第一章绪论 表1 - 1d h i b a 合成方法比较 t a b l e1 - 1t h ee o m p a b l i t yo fs y n t h e t i c a lm e t h o do fd p - h y d r o x y i s o b u t y 7 r a t e 由表1 1 可以看出，用生物法合成d h i b a ，使用原料简单，其原料主要是廉价的碳 源、氮源、无机盐、底物以及菌种。在合成过程中又不需要辅酶分离和再生，大大节约 成本。并且在反应过程中一步得到反应产物，不需要中间产物的分离，同时又是环境友 好型，非常适合工业化生产。所以本研究采用生物法合成d h i b a 。 1 5 生物法合成d p 羟基异丁酸的主要研究内容 1 5 1 褶皱假丝酵母菌的自然选育 从化学角度分析，此反应就是利用菌种c a n d i d ar u g o s a 作为催化剂催化氧化底物 m a 合成d h i b a 。其利用菌体c a n d i d ar u g o s a 使m a 的c = c 双键断裂，并在1 3 位连入 羟基，使得a 位的碳具有手性，形成手性化合物。反应方程式如下： 8 西北大学硕士学位论文 图1 7 合成d h i b a 的化学反应式 f i 9 1 7e q u a t i o no ld p h y d r o x y i s o b u t y r a t e 在反应过程中，菌体生长能力和产酶能力起了至关重要的作用，因此需要对菌体进 行筛选和优化反应条件使菌体的量达到最大。 菌体细胞作为发酵反应的催化剂，决定反应进行的情况和程度，以及经济的可行性。 所以对其有着特殊的要求，首先生产菌种应具有在较短发酵周期内生产大量发酵产物的 能力。作为生物催化剂的菌种，要求产酶活力高，耐受底物能力强，反应转化率高。在 发酵过程中不产生或少产生与目标产品性质相近的副产物及其他产物，便于产品的分离 纯化。用于手性合成的生物催化剂生产菌种，要求对映体选择性高。其次要求菌种能利 用多种原材料，并对发酵原料成分的波动敏感性较小，以便利用廉价易得的原材料，降 低发酵成本。同时对需要添加的前体物质( 底物) 有耐受能力，不将底物产物作为一般 的碳源利用。再者要求菌种具有抗杂菌污染，噬菌体感染的能力。其还应该具有着生长 繁殖能力强，有较快的生长速率，遗传特性稳定等优点。但往往菌体在保藏和转接过程 中会出现自然突变、退化，直接影响生产效率。 自然突变会导致两种截然不同的结果，一种是菌种退化而导致目标产物产量或质量 下降，另一种是对生产有益的突变。为保证生产水平的稳定和提高，应经常地进行生产 菌种的自然选育，以淘汰退化的，选育优良菌株。 自然选育是一种简单易行的选育方法，可以达到纯化菌种，防止退化，稳定生产， 提高产量的目的。本研究采用稀释涂平板的方法，进行c a n d i d ar u g o s a 菌株的筛选和纯 化以达到提高产量的目的。 1 5 2 合成d h i b a 的培养基和反应条件的优化 菌体生长需要不断从外界吸收营养物质，经过一系列生物化学作用，获取能量、代 谢形成新的细胞物质，同时排除副产物及废物。不同微生物对营养物质的需求也不一样。 培养基为菌体生长、繁殖、代谢和合成所需产物提供营养物质及原料。除此之外，培养 基也为微生物的生长提供合适的生长环境。合适的培养基必须包含合成细胞质的原料、 满足反应条件、适宜菌体生长的p h 等。因此培养基的组成和配比是否恰当直接影响菌 9 第一章绪论 体的生长繁殖和产物的合成1 8 1 。设计和改进培养基组成以及确定适宜的反应条件是保证 微生物生长和产物合成的关键步骤。 本文考察了不同的转化底物浓度、葡萄糖浓度、p h 以及温度对菌体生长和产物合 成的影响。从这几方面改良培养基的组成和反应条件，以提高产物d h i b a 的量。 1 5 3 反应萃取耦合工艺在d h i b a 合成中的应用 许多生物催化反应都存在产物抑制以及产物后期的分解。利用反应一萃取耦合工艺 可以减少产物的抑制及分解，其原理是利用萃取剂连续的萃取出发酵产物以减少产物的 抑制及分解【1 9 1 。针对生物催化法合成d h i b a 的工艺中存在产物抑制及后期产物的分解 这一问题，本文拟采取反应一萃取耦合工艺对d h i b a 的合成工艺进行改进。 尽管反应一萃取耦合工艺还没有应用到d h i b a 的合成上。但利用该技术生产乳酸、 柠檬酸等有机酸已经有很多的报道【2 0 】。 反应一萃取耦合工艺中萃取体系的选择是十分重要的，主要考虑三方面因素的影响。 第一，选择的萃取体系必须对茵体的毒性较小，菌体在该体系的存在下能正常的生长。 第二，萃取体系对产物有尽可能大的萃取能力，使产物生成后能被立即被萃取与反应体 系分离。第三，还需要考虑的就是萃取剂在水中的乳化性【2 1 ，2 2 】，菌体的培养需要搅拌， 萃取剂高的乳化性不利于菌体的生长和产物的分离。 根据相关报道【2 3 1 ，人们研究了一些有机溶剂对菌体生长的影响，报道了不同菌体对 酯类、醇类、酮类、烷烃以及邻苯二甲酚的耐受性。研究结果大致是相同的长链烷烃、 长链醇和邻苯二甲酚对茵体的生长基本是没有毒性的，其余有机溶剂对菌体都有一定的 毒性。d a v i d 和t h o m p s o n 等1 2 4 】研究发现油醇对大部分的菌体生长是没有影响的。萃取 体系一般是由两部分组成的，一部分被称作载体，是为了增加萃取体系的萃取率，常作 为反应萃取载体的物质有烷基胺和烷基氧磷。另一部分是为了减少载体的毒性而加入 的无毒的纯溶剂，像上述所提到的长链烷烃、长链醇和邻苯二甲酚等。 本研究采用反应一萃取耦合工艺生产d h i b a ，研究不同的萃取体系对菌体生长和产 物合成的影响，初步探索出反应一萃取耦合工艺合成d h i b a 的生产工艺条件。 1 5 4d h i b a 的纯化 产物的纯化一直是生物反应关键的下游技术，由于反应体系的成分复杂，既有发酵 培养基中没有被菌体消耗的底物，还有菌体的代谢副产物，所以产物很难高效快速的分 离。产物d h i b a 的极性比较大、沸点比较高，因此增加了提纯难度。d h i b a 的纯化主 1 0 西北大学硕士学位论文 要有以下两种方法： ( 1 ) 首先利用离心机将菌体除去，再将其配制成( n 地) 2 s 0 4 饱和溶液，用硫酸将其 p h 调整至2 5 。再用三倍的醋酸乙酯进行萃取，将萃取液先在常压下进行蒸馏，除去萃 取液中大部分的醋酸乙酯【2 5 1 ，再在l m m h g 下进行减压蒸馏，收集1 2 8 1 3 4 的产物。 据报道其纯度超过9 5 。 ( 2 ) 首先利用离心机除去菌体，再在发酵液中加入二倍体积含3 h 2 s 0 4 的甲醇溶 液，在8 5 条件下恒温加热5 h 进行酯化反应，冷却后用相同体积的的氯仿萃取。再进 行蒸馏得到d p 一羟基异丁酸甲酯 2 6 】。 1 6 本文研究意义 手性化合物的合成研究具有重要的理论意义和广阔的应用前景，是当今世界性的研 究热点。其中不对称氢化催化、不对称胺化、不对称烃基化、不对称羟基化等在手性药 物合成中的广泛应用【l 】，使这些研究空前活跃。在临床治疗方面，服用对映体纯的手性 药物不仅可以排除由于无效( 不良) 对映体所引起的毒副作用，还能减少药剂量和人体对 无效对映体的代谢负担，对药物动力学及剂量有更好的控制，提高药物的专一性。目前 世界上使用的药物总数约为1 9 0 0 种，手性药物占5 0 以上，在临床常用的2 0 0 种药物 中，手性药物多达1 1 4 种。因而对手性药物的开发具有十分广阔的市场前景和巨大的经 济价值5 1 。 研究表明以纯的中间体手性化合物d b 一羟基异丁酸为底物，可以用来合成卡托普 利，由于底物是纯的手性物质，使合成后的卡托普利成为一种消旋体，药物的分离纯化 成本大大降低，因此d b 一羟基异丁酸的合成成为关键。目前，国内外合成d h i b a 一般 采用化学方法，但化学方法在合成过程中条件苛刻，在手性体拆分过程中得率又不高。 因此利用生物催化合成d h i b a 成为研究的热点。本研究拟系统地从生物催化剂的制备、 底物选择、优化培养基及优化转化条件、反应萃取耦合工艺等几个方面进行研究，欲 确定出生物催化生产d b 一羟基异丁酸的最佳方案，为工业化应用提供基本的数据。 1 7 本文主要研究内容 本研究采用c a n d i d ar u g o s a 菌种催化氧化底物m a i b a 合成d h i b a ，由于d h i b a 是合成卡托普利的关键中间体，同时也是维生素、香料、抗生素的合成原料 2 7 1 。所以对 d h i b a 的合成一直是研究的热点，用化学方法合成d h i b a 过程复杂，产率不高【2 8 】，不 第一章绪论 利于大规模生产。利用生物法合成d h i b a 有着独特的优势，国外已经有很多对其研究 的相关报道，并且已经用于工业化生产1 2 9 1 ，但其在国内还没有相关的研究。本文主要从 以下几个方面进行研究，提供相关数据，为以后的研究和工业化生产提供一定的基础。 1 、生物催化剂的制备，主要是对c a n d i d ar u g o s a 菌株进行自然选育。分别从菌株 生长情况和催化合成d h i b a 的生产能力两方面进行考察，选出优良菌株。 2 、比较以m a 和i b a 为转化底物时对d h i b a 合成的影响。分别考察了菌体在以 m a 和i b a 为底物的培养基中的生长情况、合成d h i b a 的能力、底物的转化率、底物 的选择性和反应的初速率。从这几方面综合考虑，选择较优的转化底物。 3 、研究以m a 为底物进行合成d h i b a 的工艺条件。考察不同转化底物m a 浓度、 葡萄糖浓度、p h 、温度对菌体生长和产物合成的影响。同时也考察了产物d h i b a 的量 对菌体生长的影响。并利用响应面综合分析了底物m a 浓度、葡萄糖浓度以和p h 的相 互影响，得出菌体生长和产物合成的最优工艺条件。 4 、合成d h i b a 的原位萃取一发酵耦合工艺的研究。考察了不同的萃取体系对菌体 生长和产物合成的影响，同时也考察了p h 对反应一萃取过程的影响。选出好的萃取体系 和反应的p h 值。 1 2 西北大学硕士学位论文 2 1 引言 第二章生物催化剂的制备及催化性能的研究 微生物菌种是发酵工业生产成败的关键，为了提高产品转化率和生产强度，必须要 有优良的生产菌种。菌种在保存过程中不可避免地出现自发突变，从而使菌种原有性质 发生改变。主要表现在细胞形态和菌落特征发生改变，生长速率减慢，生产性能下降和 对环境的适应能力减弱。为了提高生产能力，必须对长时间保存的菌体进行分离筛选， 从退化的菌体中选出未退化的菌株，进行繁殖保存。实验室保存的c a n d i d ar u g o s a 菌种 每隔两个月就需要转接一次，在转接过程中，很多已经退化的菌株得到繁殖，使其在菌 体中占有的比率增大直接影响产物d h i b a 的合成。 国外已经有了通过c a n d i d ar u g o s ai f o0 7 0 1 发酵异丁酸和甲基丙烯酸生产d h i b a 的相关报道。从h a s e g a w a 等发现可利c a n d i d ar u g o s ai f o