（环境工程专业论文）乙酰胆碱酯酶的分离纯化及固定化技术研究.pdf

a b s t r a c t ab s t r a c t t h e a c e t y l c h o l i n e e s te r a s e ( a c h e ) i s a k i n d o f i m p o rt a n t b i o - f u n c t i o n s u b s t a n c e . i t c a n s e l e c t i v e l y c a t a l y z e t h e s u b s tr a t e o f a c e t y l c h o l i n e t o h y d r o l y z e , b u t i t s c a t a l y s i s a c t i v i t y c a n b e r e s t r a i n e d b y o r g a n i c p h o s p h o r u s o r t h e o x a m i n i c a c i d e s t e r p e s t i c i d e s . a c c o r d i n g t o t h e c h a r a c t e r i s t i c , a f a s t d e t e c t i o n t e c h n o l o g y o f p e s t i c id e r e s i d u e w a s r e g a r d e d t o b e i m p o rt a n t gr a d u a l l y . b u t t h e s o u r c e o f a c h e w a s o n e o f i m p o rt a n t f a c t o r s w h i c h a ff e c t e d t h e d e v e l o p m e n t o f p e s t i c i d e r e s i d u e f a s t d e t e c t i o n t e c h n o l o g y . t h e i m p o rt e d e n z y m e i s e x p e n s i v e , a n d t h e c o u r s e o f im p o rt i n g n e e d s m u c h t i m e . i n a d d i t i o n , d i s s o c i a t i v e e n z y m e i s u n s t a b l e , e a s y t o lo s t a c t i v i t y a n d i t c a n t b e u s e d a g a i n . h o w e v e r , m o b i l i z e d e n z y m e i s o f h i g h u s e f u l v a l u e . i n t h i s a rt i c l e , t h e p u r i fi c a t i o n a n d m o b i l i z a t io n t e c h n o l o g y o f a c h e w a s s t u d i e d . f ir s t l y , t h e a c e t y l - c h o l i n e s t e r a s e e n z y m e ( a c h e ) p u r i f i c a t i o n t e c h n o l o g y w a s s t u d i e d . t h e a c h e e n z y m e s o u r c e o f f e t a l b o v i n e s e r u m w a s s e p a r a t e d a n d p u r i fi e d b y a m m o n i u m s u l f a t e f r a c t i o n a l p r e c i p i t a t i o n , s e p h a d e x g - 1 0 0 g e l c o l u m n f i l t r a t i o n a n d d e a e - c e l l u l o s e c h r o m a t o gr a p h y . t h e s d s - p a g e a n a l y s i s o f t h e p u r i fi e d e n z y m e p r e p a r a t i o n s h o w e d o n e b a n d b y p r o t e i n s t a i n i n g . s e c o n d l y , t h e a c e t y l - c h o l i n e s t e r a s e e n z y m e ( a c h e ) i m m o b i l i z a t i o n t e c h n o l o g y w a s s t u d i e d . c r o s s - l in k i n g w a s a b r o a d l y u s e d e n z y m e i m m o b i l iz a t i o n t e c h n o l o g y . i n t h i s a r ti c l e , t h e a ff e c t i o n f a c t o r s o f i m m o b i l i z e d a c h e a c t i v i t y f o r e x a m p l e p h , t h e c o n c e n t r a t i o n o f b s a , g a a n d g e l a t i n w e r e s t u d i e d . t h e i m m o b i l i z e d a c h e b y c r o s s - l i n k i n g m a i n t a i n e d m o r e t h a n 6 0 p e r c e n t a c t i v i t y a f te r b e i n g p l a c e d 加r o o m t e m p e r a t u r e f o r 6 m o n t h s . t h e i m m o b i l i z e d e n z y m e a c t i v i t y r e c o v e r y b y c r o s s - l i n k i n g w a s l o w e r b e c a u s e t h e b i - f u n c t i o n a l r e a g e n t g a w a s h u rt f u l l y to a c h e . n o w a k i n d o f p h o t o - c r o s s l i n k a b l e p o l y m e r p v a - s b q g o t r e c o g n i t i o n o n e n z y m e i m m o b i l i z a t i o n . a h i g h e r p r o d u c t i o n t e c h n o l o g y r o u t e w a s e x p l o r e d i n l a b o r a t o r y a n d t h e p r o d u c t w a s u s e d t o i m m o b i l i z e a c h e . t h e i m m o b i l i z e d a c h e b y p v a - s b q h a s h i g h e r e n z y m e a c t iv i t y r e c o v e ry a n d m o r e t h a n 7 0 p e r c e n t a c t iv i t y w a s g o t t e n a f t e r b e i n g p l a c e d i n r o o m t e m p e r a t u r e f o r 6 m o n t h s i a b s t r a d t h i r d l y , t h e p r o p e r t i e s o f t h e a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e p u r i fi e d f r o m b o v i n e s e r u m w e r e s t u d i e d w i t h s p e c t r o p h o t o m e t e r . t h e y i n c l u d e d : t h e o p t im a l p h , t e m p e r a t u r e , s e d i m e n t c o n c e n t r a t i o n , e n z y m e c o n c e n t r a t i o n , r e a c t i o n t i m e , k m v a l u e , s t a b i l i t y a n d e ff e c t o f o r g a n ic c o m p o u n d o n t h e e n z y m e a c t iv i t y .t h i s s t u d y l a y a f o u n d a t i o n f o r d e v e l o p i n g t h e b i o s e n s o r f o r m o n i t o r i n g p h o s p h o r u s a n d c a r b a m a t e p e s t i c i d e s r e s i d u e . k e y w o r d s : a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ; p u r i f i c a t i o n ; i m m o b i l i z e d e n z y m e n 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，同意如下 各项内 容:按照学 校要求提交学位论文的印 刷本和电子版本;学校有权保存学 位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、扫描、数字化或其它手段保存 论文;学校有权提供目 录检索以及提供本学位论文全文或者部分的阅览服务: 学校有权按有关规定向国家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子版;在 不以赢利为目的的前提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术 活动。 学位论文作者签名: 年月日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名:学位论文作者签名: 解密时间:年月日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下: 内 部5 年 最 长 5 年 ， 可 少 于 5 年 ， 秘密*1 0 年 ( 最长1 0 年， 可少于1 0 年) 机 密 * 2 。 年 ( 最 长 : 。 年 ， 可 少 于 2 0 年 )成态全 .二介 认 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明: 所呈交的学位论文， 是本人在导师指导下， 进行 研究工作所取得的成果。 除文中己经注明引用的内容外， 本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、 已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体， 均已在文中以明确方式标明。 本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名: 年月日 第一章 概述 第一章 概述 我国是农药生产和使用大国， 化学防治在农业害虫防治中具有效果好、见效 快、使用方便、经济等优点。目 前， 中国常用的农药中， 有机磷和氨基甲 酸醋类 的高毒农药占总农药用量的 7 0 % 以上。但随着害虫抗药性的产生， 农药的用量也 不断增大。从而在蔬菜和果品生产中农药残留己成为突出问题，人畜长期食用 有农药残留的食物， 农药残留在人体中积累， 造成毒害， 这一现象称为农药残毒。 残毒对 人 类健康的 影响已 非同 小 可， 必须引 起高 度重视【1 -0 j 。 农药残留已 成为 近年 来威胁百姓安全的一大突出问题， 农药残留不仅越来越成为威胁餐桌安全的 “ 隐 形杀手”， 而且祸及农产品出口， 且有愈演愈烈之势。为了确保人类的健康和安 全，加强农产品中农药残留的监督和检测显得尤为重要。传统的农药残留检测 方法主要是气相色谱法和高效液相色谱法等，但仪器昂贵，操作过程复杂、费 时及检测成本高， 也不适用于现场监测( 71 乙酞胆碱酷酶( a c h e ) 是一种重要的工具酶。 它能够选择性地催化底物乙酞 胆碱水解， 且其催化活性能被有机磷或氨基甲酸醋类农药所抑制。利用这一特性 可制成胆碱酷酶生物传感器， 用于测定有机磷农药含量、底物含量及酶活性等。 因而， a c h e 在环保、医学、 农业、 军事等领域具有重要用途。 近年来，为控制农 药的使用， 实现农产品的安全生产， 针对有机磷和氨基甲酸酷类农药残留 测定的 胆碱酶 抑制技术近年来越来越受到重视s 13 1 。该技术具有操作简便、快速、结果 稳定、 不需昂 贵仪 器 和适合现场监测等 特点u n 该酶广泛存在于各种动物组织中，如脑、红血球、鱼肉组织和动物血清中。 但从动物组织中 提取的粗酶液中除了 含有a c h e 外， 还有其他多种酶类存在， 这会 显著影响到酶的动力学特性， 其中一些酶是解毒酶， 能够催化水解农药， 也有一 些醋酶能 够作为a c h e 的替代靶标， 起到保护a c h e 的作用【 ie ib j所以， 如用粗酶 液作为a c h e 酶源来测定a c h e 的动力学特性和抗抑制性所得的结果， 不能 真实地 反映出底物与酶以及毒剂与酶的作用关系， 如果能用分离纯化后的酶液作为酶 源， 则能避免这些问 题，因此有必要加强对生物中 a c h e分离和纯化的研究。此 外，由 于游离酶性质不稳定， 极易失活， 不能重复使用， 只有固定化酶才具有使用 价值。 研制胆碱醋酶生物传感器的前提条件是 a c h e的固定化， 即 利用物理或化 第一章 概述 学方法将a c h e固定在各种载体上。 与游离酶相比， 固定化酶具有稳定性强 ， 重现 性 好 ， 能 重 复 使用 等 优点 。 因 此 ， 酶 的 固 定 化 技 术 研究已 成 为 酶 工 程的 重 要 组 成 部分， 也是吸引众多学者进行研究的热点。 第一节 酶的分离纯化方法研究进展 酶的分离纯化是采用各种生化分离技术，诸如离心分离、过滤与膜分离、 萃取分离、沉淀分离、层析分离、电泳分离以及浓缩、结晶、干燥等，使酶与 各种杂质分离，达到所需要的纯度，以满足使用的要求。 酶的分离纯化技术多种多样，选用的时候要考虑如下几个方面:目 标酶 分子特性及其他物理、化学性质;酶分子和杂质的主要性质差异;酶的使 用目 的和要求: 技术实施的难易程度; 分离成本的高低: 是否会 造成环 境污染等圈。 1 . 1 . 1沉淀分离 沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶在溶液中的溶解度降 低，从溶液中沉淀析出， 而与其他溶质分离的技术过程。 沉淀分离的方法有多种，诸如盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀 法、复合沉淀法、选择性变性沉淀法等。 其中，盐析是最经典的方法， 现在还 被广泛使用.一般粗抽提物经常用盐析的方法进行粗分离。以下介绍两种常用 的沉淀分离方法。 ( 1 )盐析沉淀法 盐析法是利用不同蛋白 质在不同的盐 浓度条件下溶解度不同的特性， 通过 在酶液中添加一定浓度的中性盐， 使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与 杂质分离的过程。 在蛋白 质盐析中， 通常 采用的中 性 盐有 硫酸 钱、 硫酸 钠、 硫酸钾、 硫 酸镁、 氛化钠和磷酸钠等。其中以 硫酸按在水中的溶解度大而且温度系数小 ( 如在 2 5 时， 其溶解度为7 6 7 g / l ; 在0 时， 其溶解度为6 9 7 g / l ) 不影响酶的 活性， 分离效果好，故普遍应用硫酸馁进行盐析侧。 盐析法的优点:不会使酶失活;沉淀中夹带的蛋白质类杂质少;沉淀物在 第一章 概述 室温长时间放置不易失活，缺点是沉淀物中含有大量盐析剂。 经过盐析得到的酶沉淀，含有大量盐分，一般可以 采用透析、超滤、或层 析等方法进行脱盐处理，使酶进一步纯化。 ( 2 ) 有机溶剂沉淀法 有机溶剂之所以能使酶沉淀析出，主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的 介电常数降低。例如，2 0 时水的介电常数为8 0 ，而8 2 %乙醇水溶液的介电常 数为 4 0 . 溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而 易于凝集，同时， 对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质 分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。 常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醉、丙酮、异丙醇、甲醇等。有机溶 剂的用量一般为酶液体积的2 倍左右，有机溶剂的含量约为7 0 %，但是不同的 酶和使用不同的有机溶剂时，使用浓度亦有所不同。 有机溶剂沉淀法析出的酶沉淀，一般比盐析法析出的沉淀易于离心或过滤 分离;不含无机盐;分辨率也较高:但是有机溶剂沉淀法容易引起酶的变性失 活，所以必须在低温条件下操作，而且沉淀析出后要尽快分离，尽量减少有机 溶剂对酶活力的影响。 1 . 1 . 2离心分离 离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的 物质分离的技术过程。 在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不 同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。 离心分离的效果好坏受到多种因素的影响。除了上述离心机的种类、离心 方法、离心介质以及密度梯度以 外，在离心过程中，应该根据需要，选择好离 心力 ( 或离心速度) 和离心时间。并注意离心介质的p h 值和温度等条件。 1 . 1 . 3层析分离 层析分离是利用混合液中各种组分的物理化学性质 ( 分子的大小和形状、 分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等)的不同，使各组分以不同的比 例分布在两相中。其中一个相是固定的称为固定相，另一个相是流动的，称为 第一章 概述 形状和颗粒大小的影响。此外，还受到电 场强度、溶液p h 值、离子强度及支持 体的特性等外界条件的影响. 在酶学研究中，电泳技术主要用于酶的纯度鉴定、酶分子量测定、 酶等电 点测定以及少量酶的分离纯化。电泳的方法多种多样，主要有以下几种在:纸 电泳、薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳、自由电泳、等电聚焦电泳等。 1 . 1 . 5过滤与膜分离 过滤是借助于过滤介质将不同大小、 不同形状的物质分离的技术过程。过 滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高 分子膜等， 可以根据需要选用。 根据过滤介质的不同， 过滤可以分为膜过滤和非膜过滤两大类。 ( 1 )非膜过滤 采用高分子膜以外的 材料，如滤纸、滤布、纤维、多 孔陶瓷、 烧结 金属等 作为过滤介质的分离技术称为非膜过滤。包括粗滤和微滤。 ( 2 )膜过滤 大部分微滤以及超滤、反渗透、透析、电渗析等采用高分子膜为过滤介质， 称为膜过滤，又称为膜分离技术。 根据物质颗粒或分子通过薄膜的原理和推动力的不同， 膜分离可以 分为 3 大类: 加压膜分离、电 场膜分离、 扩散膜分离。 1 . 1 . 6苹取分离 萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。萃取分离 中的两相一般为互不相溶的两个液相。有时也可采用其他流体. 按照两相的组成不同，萃取主要分为以下几种:有机溶剂萃取、液膜萃取、 双水相萃取、超临界萃取。 1 . ， . 7结晶 结晶 是 溶质以晶体形式从溶液中析出 的 过程。 酶的结晶是 酶分离纯 化的一 种手段。它不仅为酶的结构与功能等的研究提供了适宜的样品，而且为较高纯 第一章 概述 度的酶的获得和应用创造了条件。 酶在结晶之前，酶液必须经过纯化达到一定的纯度。如果酶液纯度太低， 不能进行结晶。 通常酶的纯度应当在5 0 % 以 上， 方能进行结晶。总的趋势是酶的 纯度越高，越容易进行结晶。要说明的是，不同的酶对结晶时的纯度要求不同。 有些酶在纯度达到 5 0 % 时就可能结晶，而有些酶在纯度很高的条件下也无法析 出结晶。每经过一次重结晶，酶的纯度均有一定的提高，直至恒定为止。此外， 在结晶过程中还要控制好温度、p h值、离子强度等结晶条件，才能得到结构完 整、大小均一的晶体。 酶结晶方法有很多，主要有以 下几种:盐析结晶、有机溶剂结晶、透析平 衡结晶、等电点结晶。 1 . 1 . 8浓缩与干燥 浓缩与干燥都是酶与溶剂 ( 通常是水) 分离的过程。 在酶的分离纯化过程 中是一个重要的环节。 浓缩是从低浓度酶液中除去部分水分或其他溶剂而成为高浓度酶液的过 程。干燥是将固体、半固体或浓缩液中的水分或其他溶剂除去一部分，以获得 含水分较少的固体物质的过程。 第二节酶的固定化研究进展 随着酶学研究的不断深入和酶工程的发展，工业化生产的酶越来越多，酶 的应用也越来越广泛。然而在使用酶的过程中，人们也注意到酶的一些不足之 处。例如:酶的稳定性较差，容易变性失活。酶一般都是在水溶液中与底 物反应，反应结束后，即使酶仍有较高的活力，也难于回收利用。这种一次性 使用酶的方式，不仅使成本较高，而且难于连续生产。 酶反应后成为杂质与 产物混合在一起， 无疑给进一步的分离纯化带来一定的困难。 为此，人们针对酶的不足寻求其改善方法。 其办法之一就是固定化技术的 应用。 固定化酶的研究从上世纪5 0 年代开始， 1 9 5 3 年德国的格鲁费和施来思采 用聚氨基苯乙烯树脂为载体，经过重氮化法活化后，分别与淡肤酶、淀粉酶、 胃蛋白 酶，核糖核酸酶等结合，而制造成固定化酶。6 0年代后期，固定化技术 第一章 概述 迅速发展。1 9 6 9年，日 本的千烟一郎首次在工业生产规模应用固定化氨基酞化 酶从 d l - 氨基酸连续生产 l - 氨基酸，实现了 酶应用史上的 一大变革。 此后，固 定化技术迅速发展，促使酶工程作为一个独立的学科从发酵工程中脱颖而出。 此后， 在1 9 7 1 年召开的第一次国际酶工程学术会议上， 确定固定化酶的统一英 文名 称为i m m o b i l i z a t i o n e n z y m e a zi ，固定 化酶及其应用 研究开始在世界范围 迅猛发展， 研究领域涉及到生物工程、医药工程、食品 工程、生命科学、高分 子材料、 化学工程等许多 相关学科1， 。 将酶固定化制成酶膜是酶工程领域的重大进展之一。 对酶膜的要求是: 尽可能长久的保持酶的活性; 力求实现高密度的酶含量，但是为了使响应速 度尽量快，酶膜宜薄，通常为数十至数百微米厚:可反复多次使用;易于 系统化或仪器化; 易与反应体系分开。 1 . 2 . 1固定化酶的特点 与游离酶相比，固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的 同时，还呈现稳定性高，对抑制剂的敏感性降低，有的酶具有了 抗蛋白 酶分解 的特性:酶与产物的分离回收容易、可多次重复使用;可以对反应进行精确控 制，反应可随时中止、启动，恒态反应可保证产品的质量稳定;适应多酶系同 时反应或继时连续反应;连续操作及自 动化控制、工艺简便，且产品中不会带 进酶蛋白 或细胞， 提高酶的 利用效率，降低生产成本等一系列优点。它在应用 上和理论上的巨大潜力吸引了诸多领域的科研机构及企业科技部门研究人员的 注意力，成为现代酶工程领域的研究热点，在固定化载体与固定化方法的研究 上都取得了 诸多进展，固定化酶的 种类也日 益扩展一j . 1 . 2 . 2 酶的固定化方法 固定化酶是指在一定空间内呈封闭存在的酶，具有能连续地进行反应，反 应后可以回收重复使用的特点。酶的固定化方法很多，目前使用较广泛的固定 化方法主要有包埋法、吸附法、交联法、共价法等。其中包埋法和吸附法固定 化生物活性单元时，虽然对生物活性伤害较小， 但生物活性单元易脱落， 稳定 性差， 而共价交联法则可克服上述不足阁。 第一章 概述 1 . 2 . 2 . 1吸附法 吸附 法是最简单、 最直接的酶固定化方法，即 用物理方法将生物活性物质 吸附在载体表面上而使酶固定化的方法， 简称为吸附法。 物理吸附法常用的吸 附剂又活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、经基磷灰石等。 吸附法是一种常用技术，物理吸附的最大优点是不需试剂，只需很小的活化和 清洗步骤， 而且对酶的损坏要比 其他化学方法小。 但这种方法对p h 改变、 温度、 离子强度和底物有很大的敏感性，因此使用这种方法要求的条件比较高。而且 使用此法酶和载体的结合力较弱，酶易受外界因素的影响而脱落，所以在应用 上受到一定的限制。 1 . 2 . 2 . 2凝胶或聚合物包埋法 此法是将生物活性分子包埋在凝胶或聚合物结构的格子里。该法要求条件 温和， 有各种可利用的凝胶或聚合物 ( 聚丙烯酞胺、淀粉、明胶、和琼脂等) ， 适用于各种生物活性分子，是一种常用技术 0 0 , w o n 等用海藻酸盐对脂肪酶 进行包埋法固定化，得到的固定化酶具有很高的催化活性。但是，这种方法有 两个主要缺点:对底物和产物存在较大的扩散势垒，导致高分子量的底物反 应受阻， 如核糖核酸酶、 胰蛋白酶和葡聚搪酶; 有些凝胶孔隙， 其大小可使酶 漏出，因而使酶膜的酶活性不断降低。解决这个问题可用戊二醛将包被在格子 里的酶进行交联。 图 1 . 3酶分子固定在载体上的结构示意图 f ig , 1 . 3 1 l e s t r u c t u r e o f i m m o b i l i z e d a c h e o n c a r r i e r 1 . 2 . 2 . 3交联法 用吸附和凝胶包埋法制作的酶膜，在使用过程中，前者常发生酶的解吸， 第一章 概述 后者常出现酶从格子里漏出。交联法常用来补充上述两种制作酶膜方法的不足。 该法是用双官能团或多官能团试剂作为交联剂，使酶分子之间发生交联 从而实 现酶的固定化。 常用的交联剂有戊二醛、 双一 重氮联苯胺一 2 , 2 一 二磺酸、 甲 苯一 2 - 异氰酸、己 二异氰酸和 1 , 5 一 二氟一 2 , 4 一 硝基苯等。这种方法形成酶膜的 条件不 易掌握，在制作时必须精心控制 p h 、离子强度、温度和反应时间。此外，交联 法由于反应条件比较激烈，在固定化过程中涉及酶分子的化学反应，因 而酶失 活较为严重。 1 . 2 . 2 . 4共价键法 采用共价键将生物活性分子连接到载体上远较吸附法困 难， 但它能 提供稳 定的固定化生物活性分子。共价键连接通常包括三个步骤:载体的活化、酶的 祸联、未结合酶的除去。上述每一步都必须确定最佳实验条件，这些条 件依赖 于载体、生物活性成分和祸联试剂的性质。在酶和载体之间的共价键是 通过酶 中不起催化作用的功能基团 来实现的。常利用蛋白 质的氨基酸侧链中亲核功能 基进行偶联。这一类基团有氨基、狡基、轻基、酚基、咪哩基和疏基等。在低 温、 低离子强度和生理范围内的p h 时可发生理想的偶连。共价键连接最 大的优 点是酶膜在使用时酶不能从载体上脱落下来。另外由于形成共价键的方法种类 多，因此有可能从中选择不损害酶活性点的祸联方法。常用的共价结合反应如 下: 澳化氰法: - oh cnh, g -nhi -0 h 1 ”牙 - o- o h 申 ，俪阳 碳二亚胺法: s 0 月、， 叠氮法 + h ,n e - 务ha，一 补 rin.c.h.1皿 十 七。 钾.a h m i -一 ，一 .协一柔 喝 二 m oo .,十-% 第一章 概述 三氯均三嗦偶联法 ，人 1 . 2 . 2 . 5电聚合法 近年来许多研究者对电聚合物膜进行了 研究。 在酶聚合物单体、介体和辅 酶同时存在时，通过恒电位或电位循环扫描法使单体电氧化或还原聚合在基体 电极上。聚合过程中，由于吸附或静电作用，酶或介体等其它物质同时嵌入聚 合膜中，与传统的固定化方法相比，有以下几个优点: a .简单，电化学聚合和酶的固定化可一步完成并直接固定于载体表面。 b .聚合层厚度和酶的聚合量容易控制和调节， 从而制得重现性好的电极。 c .有些高分子膜具有选择性透过某些物质的功能，可起到降低干扰，防止 电极污染的作用。 在电化学聚合生物传感器中使用的电聚高分子膜有导电的和非导电的两 类。导电的高分子主要有:聚毗咯、聚邻苯二胺、聚苯酚及其衍生物。聚合过 程是在中性或微酸性水溶液中进行，单体如毗咯， 则将电 位置于十0 . 6 v时，毗 咯单体就可在电极上电 氧化聚合。因为聚毗咯是导电的，聚合膜可随着电氧化 的进行而不断生长，通过控制电量则可随意控制聚合膜的厚度。电化学聚合高 分子膜固定酶具有制作简单，响应快速，抗感染能力强等特点，为近年发展起 来的一种非常有效的新方法。 1 . 2 . 2 . 6新型的固定方法 随着科学的飞速发展，一些高科技手段也应用于的酶固定化已成为引人注 目的研究方向。光化学固定法的原理是用带有热活性基团和光活性基团的化学 连接组分将各种类型化合物的分子偶联到医用高分子材料表面， 来达到改性表 面的目 的，它不但机械强度高，稳定性好，而且又有生物材料的性能，具有许 多优点:( 1 ) 由于光化学固定法是将浸涂到材料表面的光活性物质在光线作用下 偶联基材表面的， 因此能对复杂形状的医用装置的表面进行改性， 提高其生物兼 容性; ( 2 ) 光化学固定法可以 在“ 掩蔽曝光” 条件下进行特定位置的改性; ( 3 )由 于用光化学固定法改性医用高分子材料表面的反应是在室温或体温下进行的， 第一章 概述 不会使生物分子或细胞失活， 因而能最大限度地保持其原有天然活性， 因此可用 于将生 物分子、 细胞 连接 到高分子材料上， 扩大 应用范围 8 7 -7 6 光聚合物聚乙烯醇苯乙烯毗陡 ( p v a - s b q )在紫外光的照射下可发生聚合， 从而可将酶包埋在聚合物中，这种方法对酶的活性伤害较小，而且操作简便在 国内外的酶固定化过程中倍受到推崇;通过光化学法制得的性能良 好的固定化 膜，可望在生物传感器中得到应用。 第三节本论文的主要研究内容 农药残留的快速检测技术对防止急性食物中毒事件的发生具有重要意义。 在世界各国开发的农药残留快速检测技术当中，乙酞胆碱酷酶抑制显色技术占 有重要的地位。本论文主要研究以下问题: ( 1 ) 乙 酞胆碱酷酶的分离纯化研究 以 价格低廉、来源广泛的牛血清为原材料，对乙酞胆碱醋酶的分离纯化 技术进行了探索，即通过三步法即硫酸按沉淀、 凝胶柱层析、d e a e 一 纤维素柱层 析纯化，得到纯的乙酞胆碱醋酶。 ( 2 ) 乙酞胆碱酷酶的固定化研究 分别采用传统的交联法和在实验室合成出的光交联试剂聚乙烯醇苯乙 烯 毗吮 ( p v a -s b q ) 对乙酞胆碱酷酶进行了固定化研究，并对固定化条件进行了 系统的考察。 ( 3 )乙 酞胆碱醋酶的理化性质研究 对乙酞胆碱酷酶的部分酶学性质进行了 研究， 分别考察了a c h e最适 州 值、温度、底物浓度、酶浓度、反应时间、动力学性质、稳定性及化学物质对 其活性的影响。 第二章 乙酞胆碱醋酶的纯化 第二章 乙酞胆碱醋酶的纯化 胆碱酷酶( c h o l i n e s t e r a s e , c h e ) 是乙酞胆碱醋酶( a c h e ) 和丁酞胆碱酣酶 ( b u c h e ) 的总称，a c h e作为一种由 蛋白 质分子构成的生物催化剂， 其主要生理功 能是将神经系统突触部位传导神经兴奋的化学物质乙酞胆碱迅速水解为乙酸和 胆碱， 以维持神经系统的正常生理功能， b u c h e的功能尚有待进一步阐明，两类 c h e 均对酞基胆碱底物表现高度专一性， 能水解神经递质乙酞胆碱， 还具有酞胺 酶和肤酶活性【别” . 有机磷、 氨基甲酸醋类农药对胆碱醋酶有强烈的抑制作用， 对人体具有较高 毒性。近年来，为控制农药的使用， 实现农产品的安全生产， 针对有机磷和氨基 甲 酸醋 类农药残留 测定的 胆碱酷酶抑制技术越来越受到重视18 - 13 ) 酶抑制法常用的酶源有:牛、猪等家畜的肝脏醋酶、人血浆或血清、马血 清、 蝇或蜜蜂头部的 脑酷酶、 兔或鼠 的梭酸醋酶等116 ) 。从动物组织中 提取的粗 酶液中除了有c h e 外， 还有其他多种酶类存在， 这会显著影响到酶的动力学特性， 其中 一些酶是解毒酶， 能够催化水解农药， 也有一些酷酶能够作为 c h e 的 替代靶 标， 起到保护c h e 的作用。所以实验中用粗酶液作为c h e 酶源来测定c h e 的动力学 特性和抗抑制性所得的结果， 不能真实地反映出底物与酶以及毒剂与酶的作用 关系， 如果能用分离纯化后的酶液作为酶源， 则能避免这些问题。因此有必要加 强对生物中a c h e 分离和纯化的研究。 根据文献报道，国内外已经就以下生物中的c h e 进行了分离、纯化或者部分 纯化: 家蝇、麦二叉蚜、黄猩猩、果蝇、烟草天蛾、尖叶库蚊、黄粉甲、美洲 簇叶 蛾、 豆荚 草盲 蜻、 马铃薯叶甲 、 骚 扰角蝇o 、 棉铃虫圃: 眼睛蛇 毒 液146 ) 挠 足 动 物14 1-41)挠足 动 物、 玉米 螟 虫 ( 3 、日 本 鹤 鹑d .、 飞 蛾146)蝗 虫461 、 麦 穗 鱼脑;赤子爱胜t i 等.本实验以来源广泛的牛血清作为乙酞胆碱醋酶的 酶源， 对其进行了分离纯化技术研究。 第二章 乙ffi t 胆碱醋酶的纯化 第一节 酶活力测定原理及酶活力单位定义 2 . 1 . 1化学试剂及设备 二硫代双对硝基苯甲 酸 ( d t n b ) 、碘化硫代乙 酞胆碱 ( a t c i )为f l u k a 公司 产品;磷酸氢二钠、磷酸二氢钠为国产分析纯:u v - 7 2 1分光光度计，上海第三 分析仪器厂。 考马斯亮蓝g - 2 5 0 ， 天津市密欧化学试剂开发中心: 牛血清白蛋白 ( b s a ) , s i g m a 公司产品;乙 醇， 天津市化学试剂一厂; 磷酸， 天津市化学试剂 六厂。加样头和单道路移液器。 2 . 1 . 2酶活力的测定原理 本实验依据e l l m a n 法1+h ， 即 碘化硫代乙 酞胆碱( a t c i ) 在胆碱脂酶( a c h e ) 作用下，被水解成硫代胆碱和乙酸，硫代胆碱可与二硫双对硝基苯甲酸 ( d t n b ) 反应生成黄色产物，该产物在紫外波长 4 1 2 n m处有最大吸收峰，因此可 在此波 长下进行比色测定。反应过程如下: (d n c h z c h ,s 0 0 0 h a + h p a o h e (c n 3n c f h c 1 w h +c f 6 0 00 h 、 一 +低 / s- 5 /- noa cooh qooh ( c h , ) 3 n c h g c f m + 险 / _ fioz 以 x) h 图2 . 1乙酞胆碱酣醉活性测定原理 f i g . 2 . 1 t h e d e t e r m i n a t i o n p r i n c i p l e o f a c h e a c t i v i t y 2 . 1 . 3酶活力 单位的定义 酶的活力大小，用酶的活力单位来度量。1 9 6 1年国际生化协会酶学委员会 规定:1 个酶活力单位， 是指在特定条件下， 在1 分钟内能转化1 f4 a o l 底物的酶 量， 或是转化底物中1 w n o 1 的有关基团的酶量c= o ， 用u 来表示。 第二章 乙酞胆碱酷酶的纯化 本实验中定义为: 在3 7 1c , 0 . l m o l / l p h = 8 . 0 磷酸缓冲液条件下，每分钟分 解l p m o l 碘化硫代乙 酞胆碱 ( a nd 的酶量为一个乙酞胆碱醋酶活力单位。 第二节 乙酞胆碱醋酶活力的测定方法 酶活力测定方法多种多样， 总的要求是快速、 简单、准确。 酶活力测定一般 包括两个阶段。首先要在一定的条件下，使酶与其作用底物反应一段时间，然 后再测定反应液中底物或产物变化的量。通过底物减少的速度或产物增加的速 度大小来表征酶反应活性的大小。 测定产物增加量或底物减少量的方法很多，常用的方法有化学滴定、比色、 比旋光度、测定紫外吸收、电化学法、气体测定等。例如，用分光光度法测定 碱性磷酸酶催化硝基酚磷酸( n p p ) 水解生成的对硝基酚的量;用化学滴定法测定 糖化酶催化淀粉水解生成的葡萄糖的量等等。一种酶可能有多种测定方法，要 根据实际情况选用。本实验拟通过采用分光光度法测定水解产物硫代胆碱增加 的速度来表征乙酞胆碱酷酶的活力。 2 . 2 . 1试剂的配制 磷 酸缓 冲 液: 用0 . l m o l / l 的 磷 酸氢 二钠( n a 2h p 0 ,) 和磷酸 二 氢 钠( n a h 2 p o 4) 溶液以 适当比 例混合， 得到p h = 8 . 0 的磷酸缓冲液。 胆 碱 脂 酶 酶 液 : 根 据 酶 活 性 情 况 按 要 求 用 适 当 体 积 的 0 . l m o l / l 的 p h = 8 . 0 磷酸缓冲液溶解。 碘 化 硫 代乙 酞 胆 碱( a nd溶 液: 取1 0 m g a t c i 溶 于2 m l 上 述p h = 8 . 0 磷 酸缓冲液中，即为 碘化硫代乙 酞胆碱 ( a t c i ) 溶液。 二 硫 代 双 对 硝 基 苯甲 酸( d t n b ) 溶 液: 取1 o m g d t n b 溶 于2 m l 上 述 磷 酸 缓冲液中。 2 . 2 . 2乙酞胆碱醋酶活性的测定步骤 取a , b 两只试管， 分别加入o . l m o l / l p h = 8 . 0 的磷酸缓冲液3 m l ， 加入乙 酞胆碱酷酶5 0 a , 和二硫代二硝基苯甲酸 ( d t n b ) 溶液5 0 w . ,置于3 7 11 水浴 中保温 1 5 m i n 后，于a 试管中加入0 . l m o l / l p h = 8 . 0 的磷酸缓冲液5 0 p l ，作为 第二章 乙酞胆碱醋酶的纯化 标准液调零: b试管中加入碘化硫代乙 酞胆碱 ( a t c i ) 溶液 5 0 p l , 混匀后立即 到入玻璃比色杯中比 色，记录3 m i n 前后的a ! , : 值。每一酶液重复测定3 次，取 a a 的平均值。 酶活力单位 ( 功 的计算公式为: aaxv .- - x1 06 ( 2 . 1 ) xd xt 式中:a a: 为反应前后吸光度的差值 v 为反应体系总体积， 本体系为3 . 1 5 x 1 0 - l : 为 黄 色 产 物 的 摩 尔 吸 光 系 数， 为1 . 3 6 x 1 0 4 l ( m o l c m ) - , t 为反应时间，本法为3 m i n 1 0 为摩尔转化为微摩尔的转化系数 d 为比 色皿宽度 ( c m ) 酶活力的计算过程较复杂，有时候酶活力的大小，可简单用反应前后的吸 光度之差 ( a a )来表征酶活力的大小，a a 值越大，表示酶活力越大。 第三节 比活力测定方法 为了比 较酶制剂的纯度和活力的高低，常常采用比活力这一概念.酶的比 活力是指在特定的条件下，每 l m g酶蛋白 所具有的酶活力单位数 ( 功。即根据 酶活力单位及蛋白 含量，可计算酶的比 活力。计算公式如下: 比活力 ( u/ m g ) 二 酶活力 单位数 ( u ) 蛋白 质量数 ( 用 9 ) ( 2 . 2 ) 2 . 3 . 1蛋白含量的测定 蛋白 含量的 测定方法有多 种， 其中包括2 8 0 n m ( a . ) 光吸收法、b r a d f o r d 检 测法、 l o w r y 检测法、二哇林甲酸 ( b c a ) 检测法、斑点滤膜结合法等【4! 本实验参照b r a d f o r d 法测定蛋白 含量。这是一种迅速、可靠的通过染色法 测定溶液中蛋白质的方法。 第二章 乙酞胆碱醋酶的纯化 2 . 3 . 1 . 1染色液的制备 准确称取 3 5 0 m g 考马斯亮蓝溶于 1 0 0 m l 9 5 % 的乙醇中，然后加入2 0 0 m l 8 8 ( w 八) 的 磷酸， 得到b r a d f o r d 储存液; 取3 0 m l b r a d f o r d 储存液， 并加入3 0 m l 8 8 %的磷酸、1 5 m l 9 5 % 的乙醇、4 2 5 m l 燕馏水，得到b r a d f o r d 工作液5 0 0 m l ， 然后 用w h a t m a n 1 号滤纸过滤，室温保存于棕色瓶中 备用。 2 . 3 . 1 . 2标准曲 线的 绘制 称取1 0 m g 牛血清白 蛋白 ( b s a ) 溶于1 0 0 m l 蒸馏水中， 作为标准蛋白 溶液. 分别吸取不同体积的标准蛋白 溶液于试管中，并加入适当体积的 磷酸缓冲液使 二者的总体积为1 0 0 w . ，并与1 m l 染色液混合均匀，如表2 . 1 所示。 表2 . 1 标准曲 线试验设计表 t a b l e 2 . 1 t h e d e s i g n t a b l e o f s t a n d a r d c u r v e