（应用化学专业论文）内吗啡肽2的合成.pdf

南京理工夫学磺士论文 内吗辞刖 2 的奋成 摘要 采蜡龙合成嚣个二默片段，再合成蹬驮的合成策略，以馥缀酸( l 母r ) 、脯氨酸 ( l p ) 、苯丙氮酸l - p h c ) 为起始琢料，滚相条件下台成出内噶啡驮- 2 ( c n d o m o r p h i n 2 ，h t y r - p r o - p h c - p h e - n h 2 ) 三氟己酸盐。以叔丁氧羰酰基( b o c ) 作 为苯丙氨酸的氨基保护基，先制备苯丽氮酸酰胺三氟乙酸盐，再用叔t 氧羰酰纂( b o c ) 僳护雏苯嚣氨酸写其缭念褥二获冀歉b o c - p h c - p h c - n h 2 ，产率8 6 。选舞教了羲臻酰 基( b o c ) 和苄基( b z l ) 作为酪氨酸的氨基和侧链僳护基，与脯氮酸甲酯盐酸盐缩合 得二肽片段b o c - t y r ( b z l ) - p r o - o m e 。产率4 2 。两个= 肽片段分别脱去叔丁氧羰酰基 保护基和翠酯援护基屠在l - 乙基3 - ( 3 一二甲胺基蜀罄) 碳纯= 亚黢盐酸盐( e d c i ) 和 l 一羟基苯并三氦睦( h o m ) 存在下缩台褥四孜b o c - t y r ( b z l ) 一p r o p h e - p h e - n h 2 ，产率 7 7 0 在硫代苯甲醚的三氟乙酸溶漩中同时脱去氮端酪氮酸残基上的叔丁氧羰酰基和 苄基保护蒸得内吗啡肽_ 2 的三氟乙酸盐，产率8 1 。应用核磁基握、红外、履谱对 目标产貔耧串翔俸的续搀进行表征。 关键词：肉吗唾肤- 2 ，h 阿片受体，渡裙合成 南京理工大学硕士论文内吗啡肽2 的合成 a b s t r a c t t h et e t r a p e p t i d eo fe n d o m o r p h i n - 2 ，as t r o n ga g o n i s to ft h eu - a c c e p t o r 谢也h i 曲 a f f i n i t ya n ds e l e c t i v i t y , w a ss y n t h e s i z e df r o ml - t y r o s i n e 、l p r o l i n ea n dl - p h e n y l a l a n i n eb y l i q u i dp h a s ec o n d e n s a t i o n t h es y n t h e t i cp r o c e d u r e i n c l u d e st h es y n t h e s i so ft w o d i p c p t i d e sf i r s ta n dc o u p l i n go ft h et w od i p e p t i d e st ot h et i d e dt e t r a p e p t i d e t h eb o c p r o t e c t e dp h e n y l a l a n i n ef b o c - - p h e - o i or e a c t e dw i t hp h e n y l a l a n i n ea m i d et og i v et h ef i r s t d i p e p t i d eb o c - p h e - p h e n h 2 i n8 6 y i e l d t h eb o ca n db z l p r o t e c t e dt y r o s i n e ( b o c t y r ( b z l ) - o h ) w a sa l l o w e dt or e a c tw i t hp r o l i n em e t h y le s t e rh y d r o c h l o r i d et of o r m t h es e c o n dd i p e p t i d eb o c - t y r ( b z l ) - p r o o m ei n4 2 y i e l d t h eb o cg r o u po nt h ef i r s t d i p e p t i d ea n dt h ep r o t e c t i n gg r o u po fm e t h y le s t e ro nt h eo t h e rw e r et h e nd e p r o t e c t e d r e s p e c t i v e l y t h et e t r a p e p t i d eb o c - t y r ( b z l ) - p r o - p i l e - p h e 小i h 2w a so b t a i n e di n7 7 y i e l d b yc o u p l i n go ft h et w od e p r o t e c t e dd i p e p t i d e si nd m f c h 2 c 1 2i nt h ep r e s e n c eo f 1 - 3 - ( d i m e t h y l a m i n o ) p r o p y l 3 - e t h y l c a r b o d i i m i d eh y d r o c h l o r i d e ( e d c i ) a n d1 - h y d r o x y b e - n z t r i a z o l e ( h o b t ) f i n a ld e p r o t e c t i o no ft h eb o ca n db z lg r o u po nt y r o s i n ei nt h e t e t r a p e p t i d ei nt h i o a n i s o l e - t r i f l u o r o a c e t i ca c i dg a v ee n d o m o r p h i n - 2t f a s a l ti n8 1 y i e l d s t r u c t u r e so ft h et i t l e dp r o d u c ta n dt h ei n t e r m e d i a t e sw f r cc h a r a c t e r i z e db yi hn m p , i r a n d m s k e yw o r d s ：e n d o m o r p h i n - 2 ，u - o p i o i dr e c e p t o r , l i q u i dp h a s es y n t h e s i s i l 南京理工大学硕士论文 内吗啡肽2 的合成 文中所用缩写符号意义如下： b z l 一苄基： b o c 一叔丁氧羰基； ( b o c ) 2 0 一二碳酸二叔丁酯； p h e 一苯丙氨酸； p r o 一脯氨酸； t y r 一酪氨酸； e d c i l 一乙基一3 ( 3 二甲氨基丙基) 碳化二亚胺盐酸盐； h o b t 一1 羟基苯骈三氮唑； t a 一硫代苯甲醚； n n i n 甲基吗啡啉； h o s u n 羟基琥珀酰亚胺： d c c 一碳二亚胺： e t 3 n 一三乙胺； t f a 一三氟乙酸； b p o c 一联苯异丙氧羰基； a d o c 一金刚烷氧羰基； z 一苄氧羰基； f m o c 一芴甲氧羰基。 v 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在本 学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发表或 公布过的研究成果，也_ i 包含我为获得任何教育机构的学位或学历而使 用过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均已在论文 中作了明确的说明。 研究生签名：匦麴函山r 绰b 月场日 学位论文使用授权声明 南京理上大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅或 上网公布本学位论文的部分或全部内容，可以向有关部门或机构送交并 授权其保存、借阅或上删公布本学位论文的部分或全部内容。对 ：保密 论文，按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名：( 虱勃亟娜年月场口 南京理工大学硕十论文内吗啡肚- 2 的合成 1 绪论 1 1 研究内吗啡肽的意义和国内外的研究进展 阿片肽是大家最为熟悉的一种神经肽，在痛觉信息的传递和调制过程中起重 要作用，阿片肽的研究是随着1 9 7 3 年阿片受体的发现而开始的，主要分为肛、 6 和k 受体。阿片受体可被两类分子所激动：一是外源性阿片类物质吗啡和 人工合成的吗啡样物质；二是内源性阿片类物质阿片肽，如脑啡肽、b 内 啡肽和强啡肽【1 1 。在自然界存在的化合物中，吗啡是i i 受体的选择性配体，但这 种生物碱在体内含量极微，不可能起重要作用，为此许多科学家苦心搜寻真正的 “内源性吗啡”。 1 9 9 7 年，z a d i n a 及其同事首次从牛脑中分离出两种对l l 受体具有高选择性 的、强效的内源性配体内吗啡肽( e n d o m o r p h i n ，e m ) ，通过反相色谱法纯 化、e d m a n 降解法测序，结果表明e m 属于四肤，分别为内吗啡肽1 ( e n d o m o r p h i n - l 。h 瓜巾p r o - t r p p h e - n h 2 ) 和内吗啡肽- 2 ( e n d o m o r p h i n - 2 ，h - t y r - p r o p h e - - - p h e - n h 2 ) 2 1 。这种氨基酸序列，与其他内源性阿片配体( 共同结构特征h t y r - g l y g l y - p h e - o h ) 在n 末端、四肽长度及c 末端酰胺化方面存在不同，具体表现为除第 l 位和第4 位t y r 、p h e 不变外，改变的是：第2 位f l j g l y 改为p r o ；第3 位的g l y 改为1 印或p h c ；第4 位的p h e 成为酰胺( p h e - n h 2 ) 3 1 ，见表1 1 ： 表1 1内吗啡肽及其相关肽序与作用 注：m i f - i 为黑色素细胞刺激素释放抑制因子 免疫细胞化学方法证明该肽存在于脑内，与当前公认的、选择性较强的人工 合成的l i 受体选择性激动剂d a m g o ( h t y r d a l w g l y n - m e p h e g l y - 0 1 ) 相比， 两者对i i 受体亲和力相似，而e m 的i i 6 比值显著高于d a m g o 。因此是当今所 知对i i 受体亲和力和选择性最高的生物活性肽，它们被认为是i i 型阿片受体 南京理工夫学硕士论文内吗啡肤2 的合成 ( m o r ) 的高亲和性、高选择性的内源性配基。e n d o m o r p h i n - 1 与阿片受体相结 合的作用、镇痛效应和降血压活性引起了广泛关注，而e n d o m o r p h i n - 2 是一种具 有镇痛作用的四肽，它存在于动物和人的中枢神经系统内，具有高亲合性和选择 性，与l i 阿片受体结合后能够激活g 蛋白、抑制腺苷酸环化酶( a c ) 的活性，使 细胞内环腺苷酸( c a m p ) 含量降低，激活钾离子通道，从而参与对心血管、镇 痛、呼吸等生理活动的调节。 i i i 内吗啡肽的分布 m a r t i n - s c h i l d 等嗍用免疫细胞化学方法发现在啮齿动物体内e m 1 多集中于 下丘脑和孤束核，而e m - 2 则集中在下丘脑下部。e m 1 在脑中分布较广泛且浓度 更高，e m 2 则比e m 1 更多地分布于脊髓。e m - i 在臂旁核和孤束核浓度最高，多 集中在中隔、斜角带、终纹的核床、血管器、m e y n e r t 核、下丘脑室旁核、下丘 脑核、导水管周围灰质、蓝班和杏仁核中e m - 2 多分布在脊髓背角的表面层以 及三叉神经脊束核中。他们还指出，e m 1 和e m 2 在小鼠、大鼠和豚鼠中的分布 总体上是相似的，但某些地方又不尽相同，在所检测到内吗啡肽的所有脑区域中， l i 阿片受体并不一定都存在。神经解剖学研究结果显示，内吗啡肽参与了痛觉调 制、自律神经系统传导及对压力作出反应等过程。 s c h r e 嘴【5 j 采用针对e m - 2 的多克隆抗体法，发现e m - 2 多分布在鼠大脑的中 隔、丘脑中线核、下丘脑、杏仁核、蓝班、导水管周围灰质和脊髓背角中，而 不分布在皮质、纹状体、海马、孤束核和背根神经节中。他们的实验证明，e m - 2 分布的这些区域中均含有l i 阿片受体，他们还发现双标记的e m 2 免疫反应神经 纤维中不含别的阿片肽，这就从另一个侧面证实e m 2 是i i 阿片受体的内源性配 体，它可能参与了痛觉传导和阿片成瘾的调制过程。m a r t i n - s c h i d 6 1 则报道e m - 2 开始是在神经节中的原始感觉神经元中被合成，然后被转运到脊髓背角的表层， 由背角神经元释放出来并同l i 阿片受体结合。e m 1 和e m 2 在豚鼠的肠肌层神经 元中也有分布j 。 1 1 2内吗啡肽的生理活性 内吗啡肽能调节多种生理功能，最显著的作用是对于痛觉调控，此外还能调 节胃肠运动、神经内分泌激素的产生和释放，内源性阿片肽可能有还参与吃喝等 行为的调节峄j 。 痛觉调制吗啡最显著的生物活性就是同l i 阿片受体结合后有很强的镇痛 作用，内吗啡肽也同样具有很强的镇痛作用。y a m a g u c h i 等 9 1 报道将e m 1 和e m 2 注射到小鼠脑池内可以产生同吗啡样面部的搔痒反应，其剂量反应曲线均为钟 2 南京理工大学硕士论文 内吗啡肚2 的台成 形，这种反应可以被预先皮下注射纳洛酮所抑制。通过尾压测试e m 1 和e m 2 还可以产生剂量依赖性的镇痛作用，其效力和作用时间可以和吗啡类药物相同， 这提示内吗啡肽参与了大脑中的疼痛调制以及致痒信号的形成。p r z e w l o e k a 等【l o l 研究髓鞘内注射e m 1 、e m 2 、d a m g o 及吗啡对小鼠产生的急性、致炎性和神 经性疼痛的影响，发现e m 1 和e m 2 ( 髓鞘内注射2 5 、5 、1 0 m g ) 延长了小鼠 尾巴拍动潜伏期，神经肽对这种急性疼痛模型产生效力的大小顺序为：d a m g o 吗畸 = e m i e m 2 。 对于因炎症引起的疼痛，波兰学者p r 跫w l & z 等【l l i 报道e m 1 和e m - 2 具有显著 的镇痛作用，其作用效力均强于强啡肽和脑啡肽，作用机制有可能是在致炎过程 中i i 阿片受体的数目明显增多和亲和力明显提高。此外，c s u l l o g - 等 1 2 l 还报道持 续给予大鼠e m 1 对因热引起的痛觉过敏有极好的止痛疗效。 心血管系统c h a m p i o n 和c z a p l a 等【1 3 _ 1 6 i 都发现大鼠注射e m - i 和e m 2 能 诱导产生剂量依赖性全身动脉血压下降，同时伴随着明显的心率减慢、心输出量 减少和总的外周阻力下降，孤啡肽1 1 7 , 1 8 1 和甲硫脑啡肽均能产生同样的现象，而异 丙肾上腺素则在降低动脉血压和总的外周阻力的同时使心率和心输出量增加，其 作用强度为异丙肾上腺素 e m - i = e m - 2 甲硫脑啡肽。e m 1 、e m - 2 和甲硫脑啡 肽的作用能够被阿片受体拮抗剂纳洛酮所抑制，而孤啡肽则不能，由此可以推测 孤啡肽这种作用是由对纳洛酮不敏感的受体介导的。很可能为孤儿阿片受体 ( o r l l ) t ”】。他们还把小鼠和大鼠的实验结果作了比较，发现所产生的作用并没 有明显不同，只是作用时间小鼠明显长于大鼠。 消化系统t o n i n i 等1 2 0 l 的研究表明，e m - i 和e m 2 均能剂量依赖性地抑制 豚鼠肠肌层神经元放电诱发的纵行肌蠕动收缩，直至此收缩消失，而对乙酰胆碱 所造成的收缩无影响，这种抑制作用不能被6 受体及k 受体拮抗剂所拮抗，从而 更证明内吗啡肽选择性地激活位于兴奋的肠肌层神经元上的l i 阿片受体，这也可 能是受i t 阿片受体介导的阿片肽( 无论是吗啡生物碱或内吗啡肽) 能引起严重的 胃肠输送系统损伤副作用的主要原因【2 1 1 e m 参与调节胃肠道活动，也参与调节胃肠神经功能改变。e m 剂量依赖性地 抑制大鼠胃胆碱能收缩反应。大鼠胃非肾上腺素能非胆碱能舒张反应山抑制性递 质n o 和血管活性肠肽参与调节。最近研究表明：e m 可影响非肾上腺素能非胆碱 能舒张反应，o 5 1 6 h z 频率电刺激可使预先收缩的离体大鼠胃底平滑肌条舒张。 e m 1 和e m 2 则浓度依赖性地抑制此舒张反应。l l 受体拮抗剂c t a p ( d p h e c y s t y r - d t r p - a r g - t h r - p e n t h r - n h 2 ) 可翻转其抑制效应。e m 通过作 用于胃底的u 阿片受体从而减弱非肾上腺素能非胆碱能的神经传递。 食欲，情绪和行为a s a k a w a 等1 2 2 1 报道，小鼠脑室内注射e m 1 和e m - 2 后 3 南京理工大学硕士论文 内吗啡肤- 2 的合成 能剂量依赖性地增加食物的摄取，降低正常合拢双臂的次数，实验结果显示内吗 啡肽能产生食欲增强和抗焦虑的效果，同时也提示我们l i 阿片受体参与小鼠寻找 食物和情绪的调节 2 3 1 。 1 1 1 内吗啡肽的研究进展 国内外对于内吗啡肽的研究主要是在药理作用与机制方面，关于内吗啡肽的 人工合成报道则较少 2 4 1 。由于从动物的组织中分离提取内吗啡肽，获得的量有限 而且步骤繁琐，因此对内吗啡肽的合成研究具有很强的现实意义和应用价值。 f i o r i 等指出了e n d o m o r p h i n - 1 的生物活性构象，当其处于膜模拟环境中时， 认为主链采取伸展构象，2 - p r o 采取顺式构型，1 - t y r 的侧链与3 - t r p 的侧链距离 较近，而与4 - p h e 的侧链反向排列 2 - 1 对阿片肽而言，其n 端1 - t y r 信使域起基 本药效基团的作用。1 - t y r 后第二个芳环药效基团相对于1 - t y r 的空间位置决定 了l i 6 受体选择性；e n d o m o r p h i n - 1 的2 - p r o 与3 - t r p 和4 - p h e 取向适合与m o r 相互作用方面起一立体化学间隔子的作用。z a d i n a l 2 1 等发现，4 - p h e - n h 2 极大地 提高了e n d o m o r p h i n - i 和e n d o m o r p h i n - 2 对m o r 的亲和性和选择性，对亲和性的 提高更显著。任维华等通过分别改变e n d o m o r p h i n - 1 和e n d o m o r p h i n - 2 的2 位和3 位氨基酸研究其构效关系时发现，结构上细微的改变都会引起其受体结合特性和 生物学效应的显著变化，相对而言，2 位氨基酸与其选择性更相关，而3 位氨基 酸与其亲和性更相关 2 6 1 。 南京大学李俊和陈钧辉等人【2 7 i 研究了内吗啡肽的液相合成。在合成过程中， 用b o e 作氨基酸n 端的保护基，c 端用h o s u 活化，在碱性条件下接肽，对于n 端为亚氨基的脯氨酸( l - p r o ) 得到较好的产率。最后采用h c l 乙酸乙酯脱去b o c 基，得到四肽的盐酸盐，其粗品用重蒸水溶解后在c i s 反相高效液相色谱柱上分 离纯化，收集四肽峰，冷冻干燥得到内吗啡肽- 2 。 k a z u y a s us a k a g i l c l l i 【2 研等人在d c c h o b t 复合缩合剂的存在下将b o c t y r o h 和h p r o o m e h c ! 缩合制备二肽b o c t y r - p r o o m e ，用n a o h 脱去甲酯。用 b o e 氨基酸与其酰胺用同样的方法合成出另外一个二肽片段，采用h c i - - 氧六 环脱去b o c 基，得到二肽的盐酸盐。用e d c h o b t 作为缩合剂将两个二肽片段 合成出四肽，粗品溶于3 0 的乙酸水溶液中用s e p h a d e xg 1 5 进行柱层析洗脱， 得到内吗啡肽- 2 的醋酸盐。 o i d i a n ac a r d i l l 0 1 2 9 1 等对一系列的氨基酸与b o c 保护氨基酸采用e d c i h o b t 进行液相肽合成，所得b o e 四肽经柱层析提纯产率为6 0 9 0 ，也是采用h c i 二氧六环脱去b o c 基，得到四肽的盐酸盐，通过反相高效液相色谱柱制备出四肽 三氟乙酸盐。 4 南京理工大学硕士论文内吗啡肚2 的合成 1 2 多肤合成概述 多肽合成的主要目的是为了制各从自然界难以获得的活性多肽或者是为了 改造结构并研究结构与功能之间的关系，特别是在世界人口日益增长而食物短缺 的情况下，合成蛋白质的生产可以从本质上解决这个问题，而多肽的合成是走向 蛋白质合成的一个重要步骤0 0 ! 多肽合成是蛋白质和多肽化学中的一个活跃的领域，在我国，自从胰岛素的 合成取得成功以后，多肽合成作为一个传统的研究又有了很大的发展。虽然现在 许多蛋白质和多肽已经可以通过基因合成和基因工程的手段用细菌来生产，但这 也并不能完全代替原有的多肽合成技术。第一，基因工程所依赖的是生物体内蛋 白质合成体系，因此它只能合成出由2 0 种【广氨基酸组成的蛋白质和多肽，但利 用原有的合成技术则不仅能制造出由2 0 种l 氨基酸组成的肽，还能制造出由 d 氨基酸或其他的结构改变了的氨基酸组成的肽，而且已经知道这种结构上的改 造，不仅对研究结构功能的关系很有意义，还可能获得一些比原有天然物活性更 高，作用更有效的多肽衍生物。第二，如果所要合成的肽是一个小肽，或者肽合 成的目的并不是大量生产而是要得到少量的产物以研究其生物功能，在这种情况 下。采用直接以氨基酸为原料的化学合成比用基因工程的办法要方便的多。 多肽合成可分为液相合成和固相合成。固相合成法的基本过程是：通过固相 载体( s o l i ds u p p o r t s ) 结构中的一些具有反应活性的基团和反应物结合，形成带 有反应物结构的固相载体，然后在固相载体、溶剂、其它反应物等多相反应条件 下，将其他反应物逐一装配到固相载体上，最后再用一定的方法将目标化合物从 固相载体上解离下来，得到最终产物。 固相肽合成的基础是液相合成，主要设计思想是：先将所要合成肽链的羧末 端氨基酸的羧基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合 在固相载体上的氨基酸作为氨基组分经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基 组分反应接长肽链。这样的步骤可以重复地多次进行下去，即缩合一洗涤一去保 护一中和和洗涤一下一轮缩合，最后达到所需要合成的肽链长度。 在固相肽合成中，只有存在于溶液中的反应物和副产物可以过滤除去，而固 定在固相载体上的原料和产物则不能分离纯化，因此，从一个方面来讲，它简化 了肽合成过程中的分离步骤，但另一方面，它对合成反应的要求也就比在液相中 反应时更高。它不仅要求反应快，而且更重要的是要求能得到定量的连接产率并 且不对固定在载体上的肽链发生副反应。另外，为了便于固相反应时进行搅拌或 振荡，一般是用l o 毫升溶剂对1 克树脂的比例，这就限制了反应物的浓度，而 不能像液相合成那样选用很高的反应物浓度，因而反应速度也会受到影响。固相 5 南京理工大学硕士论文内吗啡肽2 的合成 合成方法适用于工艺成熟，需要规模化生产的多肽的合成对于实验室合成少量 的多肽样品，液相合成方法往往更为简便和灵活。 1 3 课题的主要研究内容及技术途径 采用先合成两个二肽片段，再合成四肽的合成策略，以酪氨酸( l 1 扣) 、脯 氨酸( l p r o ) 、苯丙氨酸( l o p h e ) 为起始原料，液相条件下合成内吗啡肽2 ( e n d o m o r p h i n - 2 ，h - t y r - p r o - p h e - p h e - n h 2 ) 三氟乙酸盐。合成路线如图i h p h o 叭d iih e b o o - 一 o m o h c ib o o o ht f a 0 m eb o o o ht f a 图1 1 内吗啡肽2 三氟乙酸盐的合成路线 以二碳酸二叔丁酯( b o c ) 2 0 作为导入剂，用叔丁氧羰酰基( b o c ) 作为苯丙 氨酸的氨基保护基，先制备苯丙氨酸酰胺，脱去b o c 后得到苯丙氨酸酰胺三氟乙 酸盐，与叔丁氧羰酰基( b o c ) 保护的苯丙氨酸在1 乙基3 ( 3 。二甲胺基丙基) 碳化二亚胺盐酸盐( e d c i ) 和1 羟基苯并三氮唑( h o b t ) 存在下缩合成二肽片 段b o c p h e p h e n h 2 ，用同样的方法脱去b o c 制备t f a h - p h e p h e n h 2 。 选择叔丁氧羰酰基( b o c ) 和苄基( b z l ) 作为酪氨酸的氨基和侧链保护基， 与羧基保护后的脯氨酸甲酯盐酸盐缩合成二肽片段b o c t y r ( b z l ) p r o - o m e ，肽片 段脱去甲酯保护基后与t f a h p h e p h e n h 2 在e d c i - h o b t 存在下缩合得四肽 b o c t y r ( b z l ) p r o - p h e p h e - n h 2 ，在硫代苯甲醚的三氟乙酸溶液中同时脱去氮端酪 氨酸残基上的叔丁氧羰酰基和苄基保护基得内吗啡肽2 的三氟乙酸盐。 通过用茚三酮来测定游离氨基，用t l c 检测( 必要时用碘熏) 对反应进行 追踪，使用柱层析进行产物提纯。应用核磁共振、质谱、红外对目标产物和中间 体的结构进行表征。 6 南京理工大学硕士论文内吗啡肚2 的合成 2 实验部分 实验仪器如下： 旋转蒸发仪 r x - 3 0 0 m h z 型核磁共振仪 x - 6 型显微熔点测定仪 j b 5 0 - d 型增力电动搅拌器 8 5 - l 型磁力搅拌器 t s q 高分辨质谱仪 c t o r - 2 2 型红外光谱仪 实验主要试剂如下： l 苯丙氨酸市售 二碳酸二叔丁酯( b o c ) 2 0市售 三乙胺a r 氯甲酸乙酯市售 三氟乙酸 c r n j 二甲基甲酰胺 a r n 甲基吗啉a r h o b t 市售 e d c i 市售 1 , 4 二氧六环 a r l 脯氨酸市售 硫代苯甲醚市售 亚硫酰氯市售 r e 一5 2 c 型 德国b r u k e r 公司 北京泰克仪器有限公司 上海标本模型厂 上海忠威电器有限公司 美国f i n n i g a n 公司 德国b r u k e r 公司 扬州宝盛生物化工有限公司 扬州宝盛生物化工有限公司 上海亭新化工试剂厂 上海金锦乐实业有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 中国医药集团上海化学试剂公司 苏州天马医药集团有限公司 苏州天马医药集团有限公司 上海凌峰化学试剂有限公司 扬州宝盛生物化工有限公司 a c r o s 上海凌峰化学试剂有限公司 试剂：其他所有试剂均为市售分析纯，二氯甲烷经过无水氯化钙干燥处理， n ，n 二甲基甲酰胺用4 a 型分子筛干燥。薄层板用青岛海洋化工厂生产的硅胶 g f 2 s 4 制备，粘结剂为羧甲基纤维素钠( c m c ，化学纯) ，于热水中配成浓度为5 的溶液，硅胶与粘结剂溶液的比例为3 0 9 1 0 0 m l ，1 1 0 ( 2 活化4 5 r a i n 。柱层析 用硅胶为青岛海洋化i 厂生产的1 0 0 2 0 0 目产品。 7 南京理工大学硕士论文内吗啡肚2 的合成 2 1 t f a h - p h e - p h e - n h 2 的合成 2 1 1b o c p h e - o h 的合成 h ； c h 2 一c c o o h + ( b o c ) 2 0 i n h 2 h i c h 尸c c o o h n h b o c 1 7 9 ( 1 0 m m 0 1 ) l - p h e 加到1 5 m l1 0 的三乙胺的甲醇溶液中，剧烈搅拌下 加4 4 9 ( 2 0 r e t 0 0 1 ) ( b 0 0 2 0 ，升温至4 0 5 0 搅拌5 m i n ，氨基酸溶解，再搅拌 3 0 m i n ，1 1 c 检测( 展开剂为氯仿：甲醇；乙酸- - 7 ：1 ：0 5 ) ，无原料点，结束反应。 减压蒸出溶剂，残液在冰浴下用i nh c i 调p h 约为2 ，溶液成乳白色，且粘 稠，继续搅拌1 0 m i n 后，立即用乙酸乙酯萃取( 1 5 m l x 5 ) ，合并有机相用无水 硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏，得透明( 有时略带黄色) 油状物，真空干燥，加1 0 m l 正己烷放置过夜，有部分结晶析出，室温搅拌一天( 可适当补加正己烷) ，沉淀 增加，放冰箱中冷冻，第二天过滤，用冷正己烷洗涤，室温下真空干燥，得白色 粉状固体2 2 1 9 ，产率为8 4 ，m p ：8 4 8 7 ( 文献【3 2 l ：8 4 8 6 ) 。 2 1 2 b o c - p h e - n h 2 的合成 9 一宝：c l c o o c 2 h 5 旦 9 一 n ：c 2 h 5 嘞 1 0 0 m l 三口烧瓶中加b o c - p h e o h 2 6 4 9 ( 1 0 m m 0 1 ) ，于o c 下依次加入干燥 的二氯甲烷5 0 m l ，三乙胺1 4 m l ( 1 0 m m 0 1 ) ，1 0 下加氯甲酸乙酯1 o r a l ( 1 0 m m 0 1 ) ，搅拌反应3 0 m i n 。通过油封使反应瓶密封，o 下通氨气【由1 3 4 9 ( 2 5 0 m m 0 1 ) 氯化铵和2 9 6 9 ( 4 0 0 m m 0 1 ) 氢氧化钙在加热的条件下发生】，待生 成大量白色固体后，撤去油封和氨气继续反应3 0 m i n 到1 h 。 加3 0 r a l 水停止反应，白色固体溶解，澄清分层，用乙酸乙酯萃取( 1 5 m l 8 南京理工大学硕士论文内吗啡肽2 的合成 3 ) ，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏，真空干燥得白色固体 2 4 1 9 ，产率为9 1 ，未重结晶时m p ：1 4 1 c 1 4 8 c ，用乙酸乙酯和石油醚重 结晶m p ：1 4 6 1 4 8 ( 文献【3 1 j ：m p 1 4 8 2 1 5 1 5 ) 2 1 3 t f a h - p h e - n h 2 的合成 9 伽r p 2 h ； c h r c c o n h 2 a n h 2 5 0 m l 单口烧瓶中加1 5 9 9 ( 6 m m 0 1 ) b o c p h e - n h 2 ，冰浴下加9 m l 干燥二氯 甲烷，滴加9 m l 三氟乙酸冰浴反应l h ，水浴反应l h 。t l c 显示( 用氯仿：乙酸 乙酯：乙酸= 1 0 ：1 0 ：1 作展开剂，茚三酮显色，带有反应液的点显色，由黄色逐渐 变为桃红色) 原料点消失 反应液在4 0 下减压蒸馏得透明油状物，加l o m l 无水乙醚，摇晃析出白 色固体，静置一段时间后过滤，用大量的无水乙醚多次洗涤，真空干燥得白色粉 末1 6 5 9 ，产率9 8 。m p ：1 7 2 1 7 6 直接用于后续反应 2 1 4b o e - p h e - p h e - n h 2 的合成 h c - 一擘0 - c h 2 c h 2 c 1 2 ，d m f - - - - - - - - - - - - - - + n m m 。h o b t ，e d c i 仃删尸 h i e c 叫h 2 t f a n h 2 o 5 6 9 ( 2 r e t 0 0 1 ) t f a h p h e n h 2 和0 5 4 9 ( 2 m m 0 1 ) b o c p h e - o h 溶于5 m l 二氯甲烷和5 m l n , n 二甲基甲酰胺混合溶剂中，冰浴下依次加入0 2 4 m l ( 2 1 7 r e t 0 0 1 ) n 甲基吗啉，0 3 2 9 ( 2 4 r e t 0 0 1 ) h o b t 和0 4 2 9 ( 2 2 r e t 0 0 1 ) e d c i ， 冰浴反应l h ，室温反应2 4 h ，得黄色澄清液。 加入1 0 m l 二氯甲烷稀释，依次用2 0 m l5 硫酸氢钾，2 0 m l5 碳酸氢钠 9 南京理工大学硕士论文内吗啡肤2 的合成 和2 0 m l 饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠于燥，蒸干溶剂得淡黄色固体0 7 0 9 ，产 率8 6 。1 1 1 p ：2 1 0 1 2 1 3 3 c ( 文献 2 7 1 ：2 0 8 2 0 9 c ) 2 1 5t f a h p h e - p h e - n h 2 的合成 仃一 一霉 旦9 伽七l 岂能 i o 南京理工大学硕士论文 内吗啡肚2 的合成 2 2 b m e - t y r ( b z l ) - p r o - o h 的合成 2 2 1 b o c - t y r ( b z l ) - o h 的合成 仃吼一飞1 c h ； 。c c 。h + ( b o c ) 2 。 n t - 1 2 9 啦一n 啦一葶一c 删 h - t y r ( b z l ) - o h0 2 7 9 ( 1 m m o l ) 溶于1 6 m li nn a o h 中，搅拌溶解，加入 5 m l l ，4 二氧六环稀释( p h 约1 0 ) ，再加入0 2 6 9 ( 1 2 m m o l ) ( b o c ) 2 0 ，室温反 应2 4 h ，有白色固体生成，结束反应。 旋转蒸发蒸干溶剂，得白色固体，1 0 m l 乙醚洗涤，3 0 m l 饱和碳酸氢钠溶 液溶解，乙醚萃取1 0 m l x 2 ，除去有机相，水相中加入3 0 m l 乙醚，冰浴下用 1 1 n 硫酸氢钾调p h 约为2 ，溶液中有白色絮状沉淀，过滤，滤液用乙醚萃取3 0 m l x 4 ，合并乙醚层，水洗3 0 m l x 2 ，无水硫酸钠干燥后蒸干溶剂得淡黄色油状物， 真空干燥过夜，得白色泡沫状固体。加适量正己烷放置过夜，室温搅拌一天，沉 淀增加，冰冻过夜，过滤，真空干燥得白色粉末状固体m p ：1 0 0 1 0 4 ( 文 献i 帅j ：1 0 0 1 0 1 ) ，产率6 0 ，液谱检测纯度9 8 8 0 。 2 2 2 h - p r o - o m e h c i 的合成 3 4 5 9 ( 3 0 m m 0 1 ) h - p r o o h 中加入1 5 0 m l 无水甲醇，冰水浴下缓慢滴加 6 6 6 m l ( 9 0 m m 0 1 ) 亚硫酰氯，加完撤去冰水浴，回流反应1 0 h ，t l c 检测( 二 咖6一南 南京理工大学硕士论文 内吗啡肽2 的合成 氯甲烷：甲醇：乙酸= 1 ：1 ：0 1 作展开剂) 原料点消失，结束反应 冷却后蒸干溶剂，用5 0 m l x 3v ( 二氯甲烷) ：v ( 甲醇) = l ：l 的溶剂反复浓缩， 真空干燥得4 9 4 9 淡黄色油状物，产率9 9 。加入1 0 m l 乙醚后冰冻，有白色针 状晶体析出，减压蒸除乙醚，得膏状固体，直接用于下步反应。 2 2 3 b o o - t ) r r 0 3 2 1 ) - p r o - o m e 的合成 0 - c h 2 一飞1 啦 c h 2 c 1 2 ，孙n l h o b t e d c i 仃一n 一手上5 n h b o c 冰浴下依次加b o c - t y r ( b z l ) - o h0 7 2 9 ( 2 o o m m 0 1 ) ，h - p r o - o m e h c lo 3 2 9 ( 2 0 2 r e t 0 0 1 ) ，二氯甲烷3 0 m l ，n 一甲基吗啡啉0 7 2 m l ( 6 0 6 m m 0 1 ) ，h o b t0 3 2 9 ( 2 4 2 m m 0 1 ) ，e d c l0 4 0 9 ( 2 2 2 r e t 0 0 1 ) ，冰浴搅拌1 h ，室温搅拌2 4 h 。用e t o a c ： 正己烷= l ：1 做展开荆，t l c 检测反应液，与原料对比有新点产生，结束反应。 加入3 0 t a l c h 2 c 1 2 稀释，依次用5 硫酸氢钾6 0 m l ，5 碳酸氢钠6 0 r a l 和 饱和食盐水4 0 m l x 2 洗涤。无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，得淡黄色固体，柱层 析提纯( 乙酸乙酯：石油醚= l ：2 ) 得白色油状物，真空干燥得白色块状固体0 4 1 9 ， 产率4 2 ，液谱检测纯度9 9 7 3 。 1 2 魄 一6 鲫 一 一 南京理工大学硕士论文内吗啡肽2 的合成 2 2 4 b o e - t y r ( b z l ) - p r 0 4 ) h 的合成 仃一。n 卓hle 仃c n 啦丰i - i f c - - 室温下，单口烧瓶中将b o c t y r ( b z l ) - p r o - o m e1 0 0 9 ( 2 0 7 r e t 0 0 1 ) 溶于4 0 m l 甲醇中，搅拌下加入1 0 m li n n a o h ，t l c 跟踪至完成。 加入3 0 m l 水稀释，用2 0 m l 乙醚萃取，水相冰浴下1 0 0 5 柠檬酸调p h 约2 ， 乙酸乙酯萃取4 0 m l x 2 ，有机相用5 0 m l 水洗，无水硫酸钠干燥除溶剂得油状物， 真空干燥得淡黄色泡沫状固体o 7 5 9 ，产率7 7 加正己烷浸泡过夜，室温搅拌 一天，析出沉淀，静置过滤，真空干燥得纯白色粉末 南京理工大学硕士论文内吗啡肽2 的合成 2 3 t f a h - t y r - p r o - p h e - p h e - n h 2 的合成 2 3 1 b o c - t y r ( b z j ) - p r o - p h e - p h e - n h 2 的合成 9 掣一c 譬- - c o n h 2 + 矿吼一飞正c c h 2 c 1 2 ，d m f n m m ，h o b t ，e d c i u 一；上5 r r e i - - c o 删c c o n h - - c l 一 c o n h 2 i； h a 冰浴下依次往三颈瓶中加b o e - t y r ( b z l ) p r o - o h1 3 l g ( 2 8 0 m m 0 1 ) ， t f a h - p h e p h e n h 21 2 8 9 ( 3 o o m m 0 1 ) ，二氯甲烷3 0 m l ，n n - 二甲基甲酰胺3 0 m l ，n 甲基吗啡啉o 9 9 m l ( 9 m m 0 1 ) ，h o b to 4 9 9 ( 3 6 r e t 0 0 1 ) ，e d c io 6 3 9 ( 3 3 m m 0 1 ) ，冰浴搅拌l h ，室温下搅拌2 4 h 。 加入4 0 m l c h 2 c h 稀释，依次用5 硫酸氢钾4 0 m l ，5 碳酸氢钠4 0 m l 和 饱和食盐水4 0 m l 洗涤。无水硫酸钠干燥，除溶剂后用柱层析提纯( 依次用二氯 甲烷，二氯甲烷：甲醇= 1 9 ：1 进行梯度沈脱) ，得黄色油状物，真空干燥得黄色块 状固体1 6 4 9 ，产率7 7 ，液谱检测纯度9 4 3 7 。 1 4 5 o一 一 南京理工大学硕士论文 内吗啡肚2 的合成 2 3 2 t f a h - t y r - p r o - p h e - p h e - n h 2 的合成 c 印n 啦一葶一l5 一f 一一f c 严i h 2 p h 鲁m n 吼一；h c f - - n 片, j 单口烧瓶中加入b o c - t y r ( b z l ) - p r o - p h e - p h c - n h 2o 0 7 6 9 ( o i m r a 0 1 ) ，冰浴下依 次加入三氟乙酸3 m l ( 4 0 m m 0 1 ) ( 溶液呈黄色) ，硫代苯甲醚0 6 2 m l ( 5 m m 0 1 ) ( 溶液逐渐偏紫色) 冰浴下反应l h 后室温反应，t l c 跟踪检测( 用二氯甲烷： 甲醇：乙酸= 1 9 ：1 ：0 2 ) ，原料点消失后结束反应。 减压蒸馏蒸去溶剂，加入3 0 m l 无水乙醚室温下搅拌，直至析出大量粉末状 沉淀，过滤，干燥得灰白色固体粉末o 0 5 7 9 ，产率8 1 。 南京理工大学硕士论文