（环境工程专业论文）六价铬污染场地微生物解毒研究.pdf

东北大学硕士学位论文 摘要 六价铬污染场地微生物解毒研究 摘要 在全国范围内，2 0 以上的地下水污染是由六价铬造成的，而且几乎都是由 废渣、电镀污泥长年堆放，形成土壤污染而进一步向下迁移造成的。特别是对于 土壤渗透性好、有机质含量低的地区，地下水污染更加严重与持久。因此及时对 铬污染土壤进行解毒，将六价铬转化为三价铬，使其稳定化与固定化，阻断污染 土壤中六价铬的向下移动，解除对地下水环境安全造成的严重威胁，具有十分重 要的实际意义。利用微生物对铬污染场地解毒，与物理、化学方法相比，更适于 污染范围大、污染物浓度低的土壤，而且能够大大降低修复成本，避免产生二次 污染。 本研究采用富集培养法和稀释平板分离法，从c r ( ) 污染土壤中筛选出一 株土著还原菌，根据真菌鉴定手册，初步鉴定为镰刀菌属。通过土壤原位微 生物修复法对土壤中c r ( y i ) 的还原工艺条件进行了研究，表明在2 5 、土壤p h 值为5 2 的条件下，投加2 的还原菌和3 的有机质，还原效率最佳；而且一个 月后土壤c r ( v i ) 浸出浓度低于国标( g b 5 0 8 5 3 - 1 9 9 6 ) 中环境最低允许值。对还原 后铬的形态分析表明，在上述条件下还原菌可使有效态铬显著下降，大大减缓铬 对周围环境的危害。考虑还原菌用量、p h 值、温度及有机质含量四个因素间的 交互作用，采用u 6 + ( 6 4 ) 均匀设计表安排实验，结果表明还原因素中温度和有机 质含量交互作用显著。 通过c r ( v i ) 解毒后土壤的稳定性研究得出，酸或碱对土壤的稳定性没有太大 影响，而且随着时间的延长，c r ( v i ) 浓度有继续降低的趋势，p h 值越低，c r ( v i ) 浸出浓度越低。通过超声波将还原c r ( v i ) 后的菌体细胞破壁，然后利用扫描电子 显微镜与能量扩散x 射线光谱分析法联用，观察菌体表面还原c r ( ) 前后的变 化并鉴定吸附的金属元素，结果表明环境中有一定浓度的铬被吸附在菌体细胞壁 上，证明了菌体首先在胞外吸附c r ( ) ，再通过胞外酶还原c r ( ) 。 关键字：六价铬土壤污染修复生物解毒镰刀菌稳定性还原机理 i i 查! ! 垄芏堑主堂堡堡查 ! ! ! ! ! ! ! 三 s t u d yo nd e o x i d i z a t i o no ff i e l dc o n t a m i n a t e d h e x a v a l e n tc h r o m i u mb ym i c r o b i o l o g y a b s t r a c t i n 1 en a t i o n a ls c o p e a b o v e2 0 u n d e r g r o u n dw a t e ri sp o l l u t e db yh e x a v a l e n t c h r o m i u m ，m o r e o v e rn e a r l ya l li sp o l l u t e db yt h ew a s t er e s i d u e ，g a l v a n i z a t i o ns l u d g e ， w h i c hf o r i l l st h es o i lp o l l u t i o nb u tf u r t h e rm o v e st ou n d e r g r o u n dw a t e r s p e c i a l l y r e g a r d i n g t ot h ea r e ao fg o o ds o i l p e r m e a b i l i t ya n dl o wo r g a n i cc o n t e n t ，t h e u n d e r g r o u n dw a t e rp o l l u t i o ni s m o r es e r i o u sa n dl a s t i n g ，t h e r e f o r ep r o m p t l y c a r r y i n g o nt h ed e o x i d i z a t i o nt ot h ec h r o m i u m p o l l u t i o ns o i l ，t r a n s f o r m i n g h e x a v a l e n tc h r o m i u mt ot e r v a l e n tc h r o m i u m ，m a yb l o c kh e x a v a l e n tc h r o m i u mi n t h e p o l l u t i o ns o l lm o v e st ou n d e rg r o u n d a n dr e l i e v e s 血e s e r i o u st h r e a tt ot h e u n d e r g r o u n dw a t e re n v i r o n m e n t t h e s o l l p o l l u t i o nm i c r o o r g a n i s m r e c l a m a t i o n m e t h o d ，c o m p a r e dw i t hp h y s i c a l ，c h e m i s t r yr e c l a m a t i o n ，i ss u i t a b l e f o r t h eb i g p o l l u t e ds c o p e ，a n dt h el o wp o l l u t a n td e n s i t ys o i l ，m o r e o v e rc a l lg r e a t l yr e d u c et h e r e c l a m a t i o nc o s t ，a v o i d sh a v i n gt w ot i m e so f p o l l u t i o n t h i st o p i cc a r r i e so nt h er e s e a r c ho fm i c r o o r g a n i s md e o x i d i z i n gh e x a v a t e n t c h r o m i u mi ni t sp o l l u t i n g1 0 c a t i o n t 1 1 em a i nr e s e a r c hc o n t e n ta r ea sf o l l o w s ： t h er e s e a r c ha d o p t se n r i c h m e n tc u l t i v a t et e c h n i q u ea n dd i l u t es e p e r a t et e c h n i q u e ， a n do n ei n d i g e n ed e o x i d i z a t i o ne p i p h y t ei ss c r e e n e df r o mc h r o m i u mp o l l u t i o ns o i l ， a c c o r d i n gt o ”f u n g u sa p p r a i s a lh a n d b o o k ”，t h ep r e l i m i n a r ya p p r a i s a li st h es i c k l e e d i p h y t e r e s e a r c he r a f tc o n d i t i o no fd e o x i d i z i n gh e x a v a l e n tc h r o m i u mt h r o u g h m i c r o o r g a n i s mr e c l a m a t i o nm e 也o di no r i g i n a ls o l lp l a c e i ti n d i c a t e st h a ti n2 5 c o n d i t i o n ，t h es o f tp hv a l u ei s5 2 ，a d d s2 r e t u r ne p i p h y t ea n d3 o r g a n i cm a t t e r ， c a r r i e so nt h eb i o l o g yd i s i n t o x i c a t i o nt ot h ec h r o m i u mp o l l u t i o ns o i l ，t h ee f f i c i e n c yi s h i g h e s t ；a f t e ro n em o n t hs u r p l u sh e x a v a l e n tc h r o m i u mc o n c e n t r a t i o ni sl o w e rt h a n e n v i r o n m e n tl o w e s ta l l o w e dv a l u e c h r o m i u ms h a p ea n a l y s e st h a tt h ee f f e c t i v e c h r o m i u m r e m a r k a b l yd r o p ，m a yg r e a t l ys l o wd o w nt h ec h r o m i u mh a r mt ot h e e n v i r o n m e n t c o n s i d e r a t i n gf o u rf a c t o r sc o r r e l a t i o no fd e o x i d i z i n ge p i p h y t ea m o u n t u s e d ，t h ep hv a l u e ，t h et e m p e r a t u r ea n dt h eo r g a n i cc o n t e n t ，u s e su 6 1 ( 6 4 ) t 1 ee v e n d e s i g nt a b l ea r r a n g i n ge x p e r i m e n t ，i nt h es h o w i n gt h et e m p e r a t u r ea n dt h eo r g a n i c c o n t e n tc o r r e l a t i o ni sr e m a r k a b l e s t a b i l i t yi n v e s t i g a t i o no ft h ea f t e rd e o x i d i z i n gs o i l ，a n di t sr e s u l ti n d i c a t e s ，t h e a c i do rt h ea l k a l id o e sn o th a v em u c hi n f l u e n c et ot h es o i ls t a b i l i t y t h r o u g hu l t r a s o n i c w a v eb r o k e n - d o w ne e l lw a l l ， a n d ( s e m ) o b s e r v e st h em y c e l i u ms a t f a c ec h a n g e u s i n gt h es c a n n i n ge l e c t r o n m i c r o s c o p e ，p r o v e st h em y c e l i u ma d s o r b e dt h ec r ( v i ) o u t s i d ef i r s t l y , a g a i ni t s e n z y m et r a n s f o r m sh e x a v a l e n tc h r o m i u mt ot e r v a l e n t c h r o m i u m k e y w o r d s ：h e x a v a l e n tc h r o m i u m s o i i p o l l u t i o n r e n o v a t e b i o l o g yd i s i n t o x i c a t t i o n s i c k l ee p i p h y t e s t a b i l i t yd e o x i d i z i n gm e c h a n i s m 1 1 1 独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是在导师的指导下完成的。论文中 取得的研究成果除加以标注和致谢的地方外，不包含其他人己经发表 或撰写过的研究成果，也不包括本人为获得其他学位而使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了 明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 练f 毫公 日 期：加o s ，j0 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者和指导教师完全了解东北大学有关保留、使用学 位论文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的 复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人同意东北大学可以将学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索、交流。 ( 如作者和导师不同意网上交流，请在下方签名；否则视为同意。) 学位论文作者签名：徐， 霉铃 导师签名： 签字日期： 驷。箩、倍、 签字日期： 东北大学硕士学位论文 第一章绪论 第一章绪论 1 1 铬及其对土壤的危害 1 1 1 铬的性质 铬是银白色带有光泽的金属，含有杂质的铬硬而且脆，高纯铬软而有延展性，抗腐 蚀。铬的原子量为5 2 0 1 ，比重7 2 ，熔点1 5 5 0 ，沸点2 4 6 9 。c 。铬在潮湿的空气中是 稳定的，加热时与氧化合而形成c r 。0 。铬不溶于水和硝酸，但溶于稀盐酸和硫酸，生成 相应的盐。金属铬无毒性，三价铬有毒，六价铬毒性大，还有腐蚀性。 在自然环境中，铬以多种价态形式存在，通常以二价、三价和六价形式。二价铬离 子能被空气迅速氧化成三价离子。铬的化合物最多的是三价与六价，其氧化物为c r 。0 、 c r o “三价铬与六价铬在一定条件下又可以互相转化，在有机质和还原剂的作用下，六 价铬还可以还原成三价铬。 矿物微粒对铬的化合物有很强的吸附能力。天然水体中常有大量矿物微粒，它们大 多数是岩石风化产物，随着地表径流进入水体，最常见的是石英和粘土矿物，它是二氧 化硅及各种层状结构的铝硅酸盐的细微颗粒，在水中形成胶体和悬浮液体系，能较长期 地分散在水体中而不沉降，由于有广阔界面和双电层结构，能吸附c r 3 + 和c r 0 4 2 - 等离子化 合物，因而对铬在环境中的迁移转化起重要作用“1 。 1 1 2 铬对土壤的危害 在自然状态下，土壤中的重金属污染是不能被降解和消除的，而只能经植物与作物 吸收后进入食物链，进而危害牲畜与人体健康，或经长期渗滤污染地下水而同样造成永 久性污染，这也正是重金属成为土壤地下水最危险污染物的根本原因。在土壤地下水 的重金属污染中，六价铬占重金属污染的比例与范围都较大。有文献报道w ：在全国范 围内，2 0 以上的地下水污染是受到六价铬污染，而且几乎都是由废渣、电镀污泥长年 堆放，形成土壤污染而进一步向下移动造成的，特别是对于土壤渗透性好、有机质含量 低的地区，地下水污染更加严重与持久，因此及时将污染土壤中六价铬转化为三价铬， 东北太学硕士学位论文 第一章绪论 使其稳定化与固定化，可以阻断污染土壤中六价铬的向下移动，缓解对地下水环境安全 造成的严重威胁。 1 1 3 我国铬污染现状 目前，以我省的某铁合金厂与某化工厂对周围土壤地下水的六价铬污染为例，即可 了解土壤地下水六价铬污染及其修复的迫切性： 某厂从二十世纪六十年代初开始生产金属铬，至今堆放的铬渣已达4 0 万吨，而且 每年仍有2 万吨的铬渣排放到堆放场中，由于该厂所在地区的天然土层为2 5 1 5 米的 砂质土和粘土、3 o 4 0 米的砾石层，土壤渗透性较好，地下渗滤较快，七十年代就已 发现该厂周围几十平方公里内的地下水均受到六价铬污染，厂区下游1 8 0 0 多眼民用水 井不能饮用，工厂为此花费了大量资金解决铬渣堆放场的防渗问题、周围农民的水源问 题”1 ，使六价铬污染的危害得以缓解，据2 0 0 0 年的监测数据表明：该厂下游的金丁堡、 女儿河等自然屯的地下水中六价铬浓度仍然超标3 - - 1 0 倍，现在该厂每年用于污染区供 水的费用约5 6 万元。 某化工厂自一九五六年开始生产铬盐系列产品，到一九九六年停产，已积存铬渣 1 5 2 0 万吨，该铬渣露天堆放达二十余年，直到一九九八年才为这个庞大的铬渣做了凌 镁板和沥青玻璃布防水材料封闭处理及水泥地面防渗设施。因此该厂1 0 万平方米厂区 成为铬盐生产污染区域，其中3 万平方米为重污染区域。由于铬渣露天堆放，经长年的 风蚀、淋溶、渗透与地表径流，厂区外堆放场以北约5 0 万平方米洼地、农田呈一扇形 污染区域，翻耕过的农田土壤中可见铬渣颗粒。该厂所在地区地貌为黄土型沉积，质地 为轻黏土至重黏土，土壤渗透系数较小，八十年代，该厂区内重污染区域的六价铬土壤 穿透层达到1 0 米，由于该厂所在地区地下水位较高，厂内地下水井一直弃用，厂外地 下水未见六价铬超标，但目前的厂内外地下水，厂区内及堆放场周围洼地、农田土壤的 监测分析数据表明：厂内4 0 米井水中六价铬已超标，达到o 0 8 毫克升，厂外地下水六 价铬仍不超标；厂内与洼地、农田土壤中总铬含量均超标严重，值得注意的是深层土中 的总铬含量虽不及表层土，但其中的六价铬含量前者超过后者，可见六价铬在土壤中有 明显的a t 移动的趋势，存在着污染周围地下水的潜在威胁。 从以上两家金属铬与铬盐生产企业的铬渣污染情况就可以推断其他众多同行业企 业对周围环境的污染与潜在威胁，而分布在全国各地不计其数的电镀与制革企业，其排 2 东北大学硕士学4 - 2 碰e 文 第一章绪论 使其稳定化与固定化，可以阻断污染土壤中六价铬的向下移动，缓解对地下水环境安全 造成的严重威胁。 1 1 3 我国铬污染现状 日时，以我省的某铁合金厂与某化工厂对周围土壤地下水的六价铬污染为例，即可 了解壤，地下水六价铬污染及其修复的迫切性 某j 一从二十世纪六十年代初开始生产金属铬，至今堆放的铬渣己达4 0 万吨，而且 每年仍有2 万吨的铬渣排放到堆放场中，由于该厂所在地区的天然土层为2 5 1 5 米的 砂质土和粘土、3 0 4 0 米的砾石层，土壤渗透性较好，地f 渗滤较快，七十年代就已 发现该厂周围几十平方公里内的地下水均受到六价铬污染，厂区下游1 8 0 0 多眼民用水 井不能饮用，工厂为此花费了大量资金解决铬渣堆放场的防渗问题、周围农民的水源问 题。”，使六价铬污染的危害得以缓解，据2 0 0 0 年的监测数据表明：该j 。下游的金丁堡、 女儿河等自然屯的地下水中六价铬浓度仍然超标3 1 0 倍，现在该厂每年用于污染区供 水的费用约5 6 万元。 某化工厂自一九血六年开始生产铬盐系列产品，到一九九六年停产，已积存铬渣 1 5 2 0 万吨，该铬渣露天堆放达二十余年，直到一九九八年才为这个庞大的铬渣做了凌 镁板和沥青玻璃布防水材料封闭处理及水泥地面防渗设施。因此该，、1 0 万平方米厂区 成为铬盐生产污染区域，其中3 万平方米为重污染区域。由于铬渣露天堆放，经长年的 风蚀、淋溶、渗透与地表径流，厂区外堆放场以北约5 0 万平方米洼地、农田呈一扇形 污染区域，翻耕过的农田土壤中可见铬渣颗粒。该厂所在地区地貌为黄土型沉积，质地 为轻黏土至重黏土，土壤渗透系数较小，八十年代，该厂区内重污染区域的六价铬土壤 穿透层达到1 0 米，由于该厂所在地区地下水位较高，厂内地下水井一直弃用，厂外地 f 亦朱见六价铬超标，但目前的厂内外地下水厂区内及堆放场周围沣地、农 ；f 土壤的 监测分析数据表明：厂内4 0 米井水中六价铬已超标，达到0 0 8 毫克升，厂外地下水六 价铬仍不超标；厂内与洼地、农田土壤中总铬含量均超标严重，值得注意的是深层土中 的总铬含量虽不及表层土，但其中的六价铬含量前者超过后者，可见六价铬在土壤中有 明显的向下移动的趋势，存在着污染周围地下水的潜在威胁。 从以上两家金属铬与铬豁生产企业的铬渣污染情况就可以推断其他众多同行业企 业对周围环境的污染与潜在威肋，而分布在全国各地不计其数的电镀与制革企业。其排 业对周围环境的污染与潜在威胁，而分布在全国各地不计其数的电镀与制革企业，其排 东北大学硕士学位论文 第一章绪论 放的电镀含铬( v i ) 污泥与含铬( v i ) 废革渣对土壤地下水的污染与危害则更加另人 担忧，这种状况与目前的洁净水资源严重短缺，以及随着社会与科学的发展，人们对土 壤环境与地下水使用安全提出更高要求之间的矛盾日益突出。根据我国国情，开展含铬 废渣( 污泥) 堆放场所的土壤六价铬污染生物修复方法研究，具有相当的科学意义与实 用价值。 1 2 铬污染土壤修复技术研究 和其他重金属污染一样，铬污染的治理途径主要有两种“1 ：一是改变铬在土壤中的 存在形态，将六价铬还原为三价铬，降低其在环境中的迁移能力和生物可利用性：二是 将铬从被污染土壤中清除。根据这两种思路主要有如下治理方法： 1 2 1 物理方法 铬污染土壤修复的物理方法主要是换土法。换土法是一种有效的污染土壤物理处理 方法，它是将污染土壤通过深翻到土壤底层、或在污染土壤上覆盖清洁土壤、或将污染 土壤挖走换上清洁土壤等方法。换土法能够有效地将污染土壤与生态系统隔离，从而减 少它对环境的影响。但是该方法因为工程量大，费用高，只适宜用于小面积的、土壤污 染严重的状况。同时，不能将污染物质取出也会对环境产生一定风险 5 10 1 2 2 化学方法 化学方法是利用改良剂与铬之间的化学反应从而对污染土壤中的铬进行固定、分离 提取等。它既是一种传统的修复方法，同时由于新材料、新试剂的发展，它也是一种仍 在不断得以发展的修复技术。目前，包括新的固定化材料、生物淋洗试剂和电动修复方 法等在重金属污染土壤修复方面的应用日趋广泛和深入。 一、化学固定化稳定化方法 固定化和稳定化( s o l i d i f i e a t i o n s t a b i l i z a t i o n ，s s ) 是将被铬污染的土壤与某种 粘合剂混合( 也可以辅以一定的还原剂，用于还原六价铬) ，通过粘合剂固定其中的铬， 使铬不再向周围环境迁移。到目前为止，已有大量的改良材料，包括有多种金属氧化物、 黏土矿物、有机质、高分子聚合材料、生物材料等被应用。利用它们能够吸附或络合、 1 东北犬学硕士学位论文 第一章绪论 还原铬、改变土壤介质的酸度等性质，并根据土壤理化性质、气候条件、耕作制度的不 同而被分别用于重金属在土壤中的固定“1 。固定化稳定化方法主要用于处理铬矿冶炼后 留下的铬渣，处理后的铬渣可作为建筑材料使用。采用该方法修复铬污染土壤，需将土 壤挖掘出来，成本较高，处理效果也有待进一步提高。 二、化学还原法 化学还原法( r e d u c t i o n ) 是一种原位修复方法( i n s i t u r e m e d i a t i o n ) 。其原理是利用铁屑、 硫酸亚铁或其他一些容易得到的化学还原剂( 也可以辅以一定的粘合弃) 将六价铬还原为 三价铬，形成难溶的化合物，从而降低铬在环境中的迁移性和生物可利用性，从而减轻 污染的危害。还原剂可以直接加入到土壤中，或者采用“可渗透氧化还原反应墙 ( p e r m e a b l e r e a c t i v e r e d o x w a l l ) ”的形式”1 。目前开展的研究中一般使用填充还原剂的小柱 来模拟可渗透氧化还原反应墙，然后将含有六价铬的溶液流经此柱，考察六价铬的还原 情况及产物的形式。当六价铬主要集中在土壤颗粒表面时，直接向土壤中加入还原剂能 迅速有效地起作用。但当六价铬存在于土壤颗粒内部时，贝i j 难以与还原剂接触并发生还 原反应。因此，当这部分六价铬从土壤中浸出时，就需要额外的超量还原剂来还原它。 在这个过程中，还原剂有可能被冲走，也可能被其他物质氧化。另外，向土壤中投加的 还原剂有可能造成二次污染。因此，土壤颗粒内部的六价铬的去除是化学还原法的难点。 总体而言，化学还原法属于原位修复方法，成本较低，有大规模应用的可能。 三、化学清洗法 化学清洗法( s o i l w a s h i n g ) 是利用水力医头推动清洗液通过污染土壤而将铬从壤中 清洗出去，然后再对含有铬的清洗液进行处理。清洗液可能含有某种络合剂，或者就是 清水。 p i c h t e l “1 等比较了e d t a 、n t a 、s d s 和h c l 四种清洗剂从被污染碱性土壤中去 除铬和铅的能力。结果表明：e d t a 、n t a 和s d s 在较宽的p h 范围内都有清洗能力， 清洗效果取决于p h 和络合平衡。e d t a 清洗效果最好，用0 1 m 的e d t a 在p h 黄棕壤 黑土 黄壤；高岭土 伊利 石 蒙脱石”。造成对六价铬吸附不同的原因，主要是与土壤中无机胶体的组成有关， 以高岭土、氧化铁和氧化铝为主的土壤，对阴离子表现出高度的亲和力。红壤的黏土矿 物组成以高岭土为主，并含有大量带正电荷铁和铝的氧化物凝胶，所以吸附六价铬的能 力很强，而黑土以蒙脱石、伊利石为主，黄壤以伊利石为主，这些土壤对对六价铬的吸 附能力相对较弱。 1 4 课题的目的与意义 1 4 1 课题目的 目前研究铬污染土壤治理已引起各国学术界的关注。本项目通过筛选土著菌及功能 菌，辅以适宜营养代谢条件，将污染土壤中六价铬还原为毒性较低的三价铬，并形成氢 氧化物沉淀减少溶出，同时研究处理后三价铬的稳定性，以及初步探索该菌还原六价铬 的作用机理。 1 4 2 课题研究意义 本课题研究成果可用于含铬废物生物解毒处理，还可与植物修复联合使用广泛应用 于含铬废物堆放场所引起的六价铬污染土壤的修复与治理。应用成本低廉、流程与操作 简单的生物修复方法为逐步解决我国众多企业排放的含铬废渣( 污泥) 引起的土壤地下 水的铬污染问题提供技术支持，进而减缓污染地区已经日益严重的水资源短缺状况，逐 一1 2 东北大学硕士学位论文第一章绪论 步减轻污染企业的多年来巨大的赔偿负担与压力，因而本课题将在土壤六价铬污染修复 与治理，和众多排污行业治理污染方面都将具有广泛的应用前景与广阔的市场需求。 1 5 主要研究内容 本项目主要研究内容如下： 1 、六价铬土著还原菌的筛选与还原性能研究： 通过六价铬土著还原菌的筛选、培育、代谢过程及其还原条件等一系列实验，评估 还原菌对六价铬的还原工艺条件与还原效率。 ( 1 ) 从土壤筛选c r ( v i ) 还原菌 ( 2 ) 影响生物有效性的因素研究 ( 3 ) 还原菌的驯化及不同初始浓度下还原效果验证 ( 4 ) c r ( v i ) 还原的单因素实验研究 ( 5 ) 土壤最佳还原条件及还原后铬的形态分析 ( 6 ) 均匀实验设计 2 、还原动力学研究 3 、c r ( v i ) 解毒后土壤的稳定性研究 4 、菌种还原机理探索 1 3 东北大学硕士学位论文第二章买验材料、设备与方法 第二章实验材料、设备与方法 2 1 实验材料与设备 2 1 1 六价铬污染土样 沈阳市新城子化工厂铬渣堆旁土壤，用五点法采样铬渣堆旁黄泥土堆铬渣堆 墙根干草处水边土坝野草处，铲去表土层2 - 3 c m ，取3 - - l o o m 深层土壤，装入已灭 过菌的密封袋内。 其中菌种的筛选采用土堆土样；土壤六价铬单因素还原条件研究中，将上述土样 风干后，等量混合，反复按四分法弃取。再将剩余的土样磨碎后，过4 0 目筛，装瓶备 用。 土壤原始成分分析表如下： 表2 1 土壤原始成分分析 t a b l e 2 1a n a l y s i so f t h eo r i g i n a le d a p h i cc o m p o s i t i o n 总铬m g k g六价铬m g l含水率 p h 值有机质含量m g k g 土样1 1 4 2 5 35 5 7 3 7 4 87 9 01 i 0 2 1 2 分离筛选用培养基及其组成 ( 1 ) 午肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏0 5 9 、蛋白胨1 0 9 、氯化钠0 5 9 、琼脂2 0 9 、蒸馏水1 0 0 m l ，p h 7 2 7 4 。 ( 2 ) 高氏一号培养基 可溶性淀粉2 0 9 、k n 0 3 0 1 9 、n a c l 0 ，0 5 9 、k 2 h p 0 4 0 0 5 9 、m g s 0 4 7 h 2 0 0 ，0 5 9 、 f e s 0 4 7 h 2 0o 0 0 1 9 、琼脂2 0 9 、蒸馏水1 0 0 m l ，p h 7 6 7 8 。 ( 3 ) 马铃薯培养基( p d a 培养基) 1 马铃薯2 0 9 、葡萄糖2 0 9 、琼脂2 , 0 9 、蒸馏水1 0 0 m l ，p h 自然。 2 1 3 实验药品 实验常用药品见表2 2 i 1 4 东北大学硕士学位论文 第二章实验材料、设备与方法 表2 , 2 实验药品 t a b l e 2 2l i s t o f t h e e x p e r i r r t n t c h e m i c a l m e d i c i n e s 1 5 东北大学硕士学位论文第二章实验材料、设备与方法 2 1 4 主要实验仪器 表2 3 实验仪器及设备 t a b b 2 3 l i s t o f c q u i p m e n s a n d a p p a i 锄s u s e d r a t h e e x p e r i m e n t 2 2 实验方法 2 2 1c r ( ) 浓度的分析方法 ( i ) 六价铬的测定采用g b t1 5 5 5 5 一1 9 9 5二苯碳酰二肼分光光度法 标准曲线如下： 1 6 东北大学硕士学位论文第二章实验材料、设备与方法 六价格的量u g 图2 1 吸光度随六价铬浓度的变化 f i g 2 lv a r i a t i o no fa b s o r b e n c yw i t hh e x a v a l e n tc h r o m i u mc o n c e n t r a t i o n 计算方法如下： 浸出液中穴价铬的浓度r ( m g 儿) 按下斌计算： m 2 铲 式中：晰驮校准曲戏上盎碍试辫中六徐铬的疑，p g ； v 试耕酗体积m l ( 2 ) 有效六价铬( 包括水溶态铬和交换态铬) 含量分析采用夏增禄法。”1 。用l m o l l 中性n h a a c 浸提有效态铬，土液比2 9 ：1 0 m l ，振荡1 小时后，离心过滤，测量方法同 上。在土壤六价铬还原的单因素条件研究中，均采用有效六价铬浓度。 2 2 2 还原菌的分离、提纯及鉴定 筛选土著还原六价铬菌株的技术路线如下： 含菌土壤一富集培养一曩雾卜募誓掣氮一蓄喜一套篆誓 图2 , 2 菌种分离筛选流程图 f i g 2 , 2f l o wc h a r to f m i c r o o r g a n i s mi s o l a t i n ga n ds c r e e n i n g 1 7 6 2 5 5 2 0 川 呲 帅 啪 呲 呲 吸光度a 东北大学硕士学位论文 第二章实验材料、设备与方法 2 2 2 1 从土壤中分离还原菌种 ( i ) 筛选真菌： 首先采用富集培养法，从自然界混合菌群中欲分离出特定的微生物时，通过供给适 合的培养基及环境条件，使具有特定生理功能的微生物生长繁殖，称为富集培养。 将土样放在平皿中粉碎，混合均匀，过6 毫米筛除去石砾和植物碎片。在超净工作 台中取3 0g 土样放入5 0 0 m l 灭菌的锥形瓶中，加入2 7 0 m l 经灭菌的p d a 液体培养基， 塞上灭菌的棉塞，向其中加入一定浓度c r ( ) 后，放在摇床上2 5 。c 恒温培养。3 天后用 倾注平板法拍钉进行分离，用灭菌吸管吸取1 0 m l 放到9 0 m l 的无菌水中，塞上灭菌的 橡皮塞，用手振荡4 0 次，再从中取1 0 m l 放到9 0 m l 的无菌水中，直稀释6 次，制 成浓度为1 0 “到1 0 1 的土壤稀释液。取3 0 个灭菌的培养皿和6 支灭菌的吸管，每个稀释 液取lm l 分别加入5 副培养皿中，每个稀释液的吸取用一支灭菌吸管。再将保温在 4 5 5 0 。c 的灭菌p d a 培养基倒入并迅速混均，静置冷凝后倒扣过来放在2 5 。c 的培养箱中 培养四天。 ( 2 ) 筛选细菌及放线菌：分离方法同2 2 1 1 ( 1 ) ，将培养基分别换成牛肉膏蛋白胨培养 基( 于3 7 。c 培养2 4 小时) 和高氏一号培养基( 于2 8 培养一周) 。 2 2 2 ，2 还原菌的提纯 平板中长出菌落后，用划线法纯化菌种，镜检后为单一菌种为止，转入试管中保存。 平板划线分离法： 用接种环挑取土壤悬液( 或欲分离提纯的菌种) 在平板上轻轻划平行线3 5 条为 a 区，取出接种环将环上残留菌体烧死，冷却后转动培养皿约6 0 7 0 。c ，再通过a 区 划线部位做第二次平行划线为b 区，再次灼烧接种环后，继续通过b 区作第三次划线 为c 区，第四次划线与a 区划线相平行为d 区，注意d 区划线勿与a ，b 区相接，否 则达不到分离菌的目的。直至划线后接连几次在平板上长出的菌落特征相似，不存在异 类菌落，方可认为菌株纯化较完全，对之编号。 2 2 2 3 还原菌的鉴定 实验方法：小室培养法“” 1 8 东北大学硕士学位论文 第二章实验材料、设备与方法 准备好清洁无菌的器皿，包括培养皿、“u ”形玻璃棒、载玻片、盖玻片、滤纸c 皿底铺圆形滤纸，上架“u ”形玻璃棒，其上放一张载玻片，载玻片上置两张盖玻片， 灭菌备用。 预先在无菌培养皿内倒入已灭菌的固体培养基，制成一厚度约为3 4 毫米的薄 层，待冷凝后，用无菌小刀切成1 0 毫米1 0 毫米的小块。 用无菌镊子取一小块固体培养基，用无菌操作置于已灭菌培养基皿内的载玻片， 用接种环在培养基四周接上还原菌孢予，盖上盖玻片。形成一个小室，孢子萌发，菌丝 沿培养基小块四周生长。 在培养皿内的圆形滤纸上，滴加无菌2 0 甘油3 4 m l 。 2 8 。c 温箱中培养，菌体生长后，取出玻片( 连同盖玻片) 置于显微镜下观察。 2 2 3 影响还原菌生物有效性的因素 影响菌种生物有效性的因素主要有温度、培养时间、培养基p h 值、碳源、氮源和 厌氧、好氧条件等，此真菌在2 5 下培养三天即可生长良好，故将培养温度定为2 5 ， 培养时间为三天，然后考虑以下几个因素对生物有效性的影响。 o ) p h 值对菌种生长的影响 将等量菌种分别接种到p h 值为2 7 ，4 0 ，5 2 ，6 3 ，7 2 ，8 6 ，9 0 的液体培养 基中，培养3 天后，倒入离心管中，在离心机上转2 m i n ( 转速n = 4 0 0 0 r p m ) ，倒去上清 液，称量菌体的湿重，比较不同p h 值对菌种生长的影响。 ( 2 ) 不同碳源、氮源对菌种生长的影响 向由不同碳源、氮源配制而成的培养液中，分别接种等量的菌种，在2 5 。c 下培养。 3 天后，倒入离心管中，在离心机上转2 m i n ( 转速n = 4 0 0 0 r p m ) ，倒去上清液，称量菌体 的湿重，确定营养供应条件。 ( 3 ) 厌氧、好氧的影响 将溶解氧瓶中倒满培养液，接入菌种，盖上瓶塞，制成厌氧环境；与接入等量菌种 和培养液的三角瓶好氧条件相比较，观察厌氧、好氧对菌种生长的影响。 2 2 。4 菌种还原能力测试 将菌种接种到p d a 培养液中培养3 天，然后将一定量此菌种接种到c r ( ) 浓度为 1 9 东北大学硕士学位论文 第二章实验材料、设备与方法 2 5 m g l 的培养液中培养3 天后，测试溶液中c r ( ) 浓度，检验还原效果，并依此方法 再将菌种依次接种到c r ( ) 浓度为5 0 、1 0 0 、1 5 0 、2 0 0 m g l 的培养液中。每个浓度均 培养3 天后测一次c r ( ) 浓度，以验证驯化后的还原效果，检测出菌种的c r ( ) 最大 耐受量。 2 2 5 土壤中影晌c r ( ) 还原的单因素条件 ( 1 ) 温度和时间的影响 分别称取四份土样各l o o g 于表面皿中，每份均加入i 2 9 还原菌液，混合均匀，分 别放置于1 0 、2 0 、2 5 、3 0 。c 的恒温培养箱中，每隔十天测一次c r ( ) 浓度，然后向其 中加入l o m l 无菌水。放置一个月后测量土壤中剩余c r ( ) 的浓度，分析温度和时间对 还原效果的影响。 ( 2 ) 还原菌用量的影响 保持土样原有p h 值和有机质含量不变，称取上述土样8 份各l o o g ，分别加入1 0 、 2 0 、3 o 、5 0 、7 o 、9 o 、1 2 5 和2 0 o 的还原菌液( 质量百分含量) ，均放置于 2 5 。c 下。其余方法同，一个月后测量剩余c r ( ) 浓度。 ( 3 ) p h 值的影响 取上述土样5 份，分别用盐酸和氧化钙调p h 值为5 2 、6 0 、7 0 、7 9 和8 5 ，均 加入3 的还原菌液，放置于2 5 下。其余测量方法同上。 ( 4 ) 有机质含量的影响 取9 份上述土样，保持土样p h 值不变，均加入3 的还原菌液，分别向土壤中添加 1 、2 、4 、5 、8 、1 0 、1 3 、1 5 、2 0 的草炭( 质量百分含量) ，接入还原菌进行培 养，放置于2 5 。c 下。其余测量方法同上。 2 2 6 铬的形态分析 还原后土壤中铬的形态分析采用j hg r o v e 和b ge l l i s 法“”，分别用蒸馏水、氯化 铵、草酸铵、钠盐溶液( o 1 m o l l 柠檬酸钠- 0 2 m o l l 硫代硫酸钠一0 3 m o l 碳酸氢钠 混合液) 浸提水溶态铬、可交换态铬、无定形沉淀态铬、结晶沉淀态铬。用原子吸收分 光光度法测定。 2 0 东北大学硕士学位论文 第二章实验材料，设备与方法 2 2 7 还原动力学模型 根据幂指数定律一d s d t = k s “，且当n ：l 为一级反应时，方程为l n ( s t s 。) = 一k t 当n ：2 为二级反应时，1 s 。- 1 s o = k t 。根据特定的一组浓度c 和时间t 的实验数据 通过m a t l a b 仿真实现，判断其反应级数和k ，推出总反应时间。 2 2 8c r ( ) 解毒后土壤的稳定性研究 分别称取4 组土壤，每组分别称取1 0 0 9 已经解毒后的土壤三份，置于2 l 具塞广口 聚乙烯瓶中，分别加入p h 值为4 的盐酸溶液、无菌水和p h 值为9 的氢氧化钠溶液各l l ， 浸泡摇匀。按照g b t1 5 5 5 5 u 一1 9 9 5 二苯碳酰二肼分光光度法，振荡8 小时后，分别放 置于5 、1 5 。c 、2 5 。c 和2 0 光照通风条件下，观察环境的温度、光照通风、浸泡液酸 碱度对六价铬c r ( ) 浸出毒性的影响。 2 2 9 菌种还原机理研究 ( 1 ) 将还原六价铬后的菌体进行细胞破壁，分析菌种通过胞外酶或胞内酶还原c r ( ) 。 配置含有一定浓度c r ( ) 的p d a 培养基，接入菌种培养。6 天后倒入离心管中，在 离心机上转2 m i n ( 转速n = 5 0 0 r p m ) ，然后倒去上清液，用无菌水将剩余菌体冲洗数次。 用超声波破碎极将细胞壁破碎，然后将其离心取上清液( 胞内液体) ，用原子吸收法检 测上清液中是否含有c r ( ) 。 ( 2 ) 将扫描电子显微镜( s e m ) 与能量扩散x 射线光谱分析法( e d s ) 联用”，首先在扫描电 镜下观察菌体表面还原c r ( ) 前后的变化，然后用x 射线对菌体表面吸附的物质进行轰 击。 扫描电镜样品制备方法如下| s 4 1 将清洗干净的样品用戊二醛和磷酸缓冲液固定后，依次经4 0 、5 0 、5 0 、7 0 、8 0 、 9 0 、9 5 、1 0 0 的乙醇脱水。 2 1 东北大学硕士学位论文 第三章结果与分析 第三章结果与分析 3 1 从土壤筛选六价铬c r ( ) 还原菌 按2 2 1 1 方法从土壤中分离出三种不同菌落形态的菌种，其中只有p d a 培养基上 一菌落生长良好，将其作为六价铬还原菌，如图3 1 所示，用方法2 2 1 2 纯化。 2 2 查兰垄茎堕主兰竺丝查 苎三兰竺墨燮 图3 i 从土壤中筛选出的真菌 f i g ，3 1t h ee p i p h y t ef i l t r a t e df r o mt h es o i l 将小室培养后的菌种，在低倍显微镜下观察，根据真菌鉴定手册i4 1 1 初步鉴定 为镰刀菌属，属于半知菌类、丝孢纲、瘤座孢目、瘤座孢科，其生理生化特性如下： 在温度为2 5 3 7 。c 时，镰刀菌的菌落发育迅速，根据菌种不同而显示各种色彩。菌 丝分枝伸长，从分隔处长出小分生子以及大分生饱子。大分生饱子呈现新月形或镰刀形。 形成2 至多个房隔，每隔内含个细胞。小分生饱子不形成房隔，呈卵形或长椭圆形。 小分生饱子对环境的变化具有很强的适