（环境科学专业论文）渗透压补偿性溶质ectoine对酶稳定性影响的研究.pdf

! 一 d i s s e r t a t i o ns u b m i t t e dt o d a l i a nm a r i t i m eu n i v e r s i t y i np a r t i a lf u l f i l l m e n to ft h er e q u i r e m e n t sf o rt h ed e g r e eo f d o c t o r0 fe n g i n e e r i n g w a n g y u e ( e n v i r o n m e n t a ls c i e n c e ) d i s s e r t a t i o ns u p r o f e s s o rz h a n gl i n g h u a d i s s e r t a t i o n s u d e r v l s o r ：p r o l e s s o rz h a n 2l i n r h u a j u n e2 0 1 1 ，1 ， 追 i 疗 、 学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：本论文是在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果， 撰写成博顾士学位论文= = 洼重匡空 丝丝渣厦星堡! q ! 迦盟壁鳌枣丝毖堕的婴塞： 除论文中已经注明引用的内容外，对论文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本论文中不包含任何未加明确注明的其他个人或集体 已经公开发表或未公开发表的成果。本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名：丝 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解大连海事大学有关保留、使用研究生学 位论文的规定，即：大连海事大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论 文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连海事大学可以将本 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编学位论文。同意将本学位论文收录到中国优秀博硕士 学位论文全文数据库( 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社) 、 ：中国学位论 文全文数据库( 中国科学技术信息研究所) 。等数据库中，并以电子出版物形式 出版发行和提供信息服务。保密的论文在解密后遵守此规定。 本学位论文属于：保密口在年解密后适用本授权书。 不保密彤( 请在以上方框内打“4 ) 墓文作者签名：互魃 导师签名： 签花 日期：弘1 1 年石月2 乒日 心 。卜 1ll一， 飞 r r ，、 1 将e c t o i n e 用于植酸酶热稳定性的保护，并比较其它常用酶保护剂( 如脯氨 酸、甘露醇、甘油和海藻糖) 对酶热稳定性的保护效果，初步探讨其保护方式， 为提高植酸酶的热稳定性提供新方法。从植酸酶热失活构象变化的角度考虑，采 用失活热力学和动力学分析方法，结合紫外和荧光光谱技术考察e c t o i n e 对植酸酶 热失活构象的影响，推测e c t o i n e 对酶热稳定性保护机理。 2 将e c t o i n e 作为脂肪酶稳定剂提高生物柴油和油酸乙酯的产率。研究结果显 示添加e c t o i n e 可以增加脂肪酶在有机相一次和多次循环使用的活性，为探索提高 脂肪酶在有机相中的活性提供了新方法。利用傅里叶变换红外光谱技术研究 e c t o i n e 对脂肪酶在有机相中二级结构的影响，结合脂肪酶催化双底物合成反应的 “乒乓机制，考察e c t o i n e 对脂肪酶催化反应动力学参数的影响，提出e c t o i n e 在有机相保护酶的作用机理。 n j 、 ， ， 气 鲁 ， 勺 中文摘要 摘要 环形氨基酸e c t o i n e ( 1 , 4 ，5 ，6 四氢2 甲基- 4 嘧啶羧酸) 是由嗜盐菌在高渗透压 诱导下合成的一种具有两性离子特性的渗透压补偿性溶质，对蛋白质、核酸、细 胞等在逆环境下具有保护作用。本论文以植酸酶和脂肪酶为酶蛋白，从发酵制备、 对酶的保护应用和作用机理等方面对e c t o i n e 进行了研究。 从盐池淤泥中筛选了一株中度嗜盐菌b 2 。细胞抽提物中经1h - n m r 鉴定含有 e c t o i n e 。菌株经1 6 sr d n a 鉴定属于盐单胞菌属( h a l o m o n a ss p ) 。在含2t o o l ln a c l 的谷氨酸单钠培养基中发酵合成e c t o i n e 最大量达到3 5 l 。 通过与其他补偿性溶质比较，考察了e c t o i n e 对植酸酶( p h y a i i ) 的热稳定 性保护作用。研究了e c t o i n e 的添加量、保护方式及对p h y a i i 高温水解的影响。 实验结果表明，e c t o i n e 作为p h y a i i 的热稳定性保护剂，用量最少，保护作用好。 利用p h y a i i 失活热力学和动力学分析，结合紫外和荧光光谱技术，推测 e c t o i n e 提高了酶热稳定性的作用机理。结果表明，e c t o i n e 可以提高酶分子u 、 ah 、ag 和t l 尼，降低失活速率常数k ；荧光、紫外吸收光谱表明e c t o i n e 对酶 热处理后的肽链伸展不利。因此推测e c t o i n e 的添加主要导致酶内部或酶与外界水 介质的氢键发生变化，从而有利于酶热稳定性增加。 以转酯合成生物柴油和酯化合成油酸乙酯为反应体系，考察e c t o i n e 对 n o v o z y m 4 3 5 和a s p e r g i l l u s o r y z a e d m - 0 1 全细胞脂肪酶在有机相中酶活性的影响。结 果表明，作为底物的甲醇和乙醇在一定浓度下对脂肪酶具有抑制作用。添加适量 e c t o i n e ，在脂肪酶一次或反复使用中，均对脂肪酶有显著保护作用。和同质量的 其他补偿性溶质比较，e c t o i n e 保护效果最好。添加过量e c t o i n e 则会抑制酶活性。 利用傅立叶变换红外光谱技术( f t i r ) ，结合酶催化动力学分析，探讨e c t o i n e 提高脂肪酶在甲( 乙) 醇和油酸中活性的保护机理。对n o v o z y m 4 3 5 的红外原始 图谱和二级结构分析表明，适量e c t o i n e 会降低甲醇对酶的氢键缔合作用，通过增 加1 3 折叠结构来提高酶稳定性，酶催化动力学也表明适量e c t o i n e 会减小甲醇对酶 的亲和力。对a o r y z a ed m 0 1 脂肪酶红外光谱分析表明，油酸和无水乙醇都对酶 构象有影响，其中油酸使酶的分子内氢键明显减弱，对酶构象影响较大。添加 e c t o i n e ，使酶的二级结构含量变化趋势减小，会更接近自然状态的酶。 y ， f 噜 ： 英文摘要 a b s t r a c t t h ec y c l i ca m i n oa c i de c t o i n e ( 1 ，4 ，5 ，6 一t e t r a h y d r o 2 - m e t h y l - 4 p y r i m i d i n ec a r b o x y l i c a c i d ) ，o n eo f t h er e p r e s e n t a t i v ec o m p a t i b l es o l u t e sw i t ht h ec h a r a c t e r i s t i co fz w i t t e r i o n s ， a c c u m u l a t e si nh a l o p h i l i ca n dh a l o t o l e r a n tb a c t e r i a p r e v i o u ss t u d i e si n d i c a t e dt h a t e c t o i n ef u n c t i o n so np r o t e i n s ，n u c l e i ca c i d sa n dc e l l sa sas t a b i l i z e ra g a i n s ts o m e a d v e r s ec o n d i t i o n s t h ep r o d u c i t o no fe c t o i n ea n di t sb i o p r o t e c t i v ea p p l i c a t i o na n d m e c h a n i s mw e r es t u d i e di nt h ep a p e ru s i n gp h y t a s ea n dl i p a s ea sm o d e lp r o t e i n am o d e r a t e l yh a l o p h i l i cb a c t e r i u mb 2w a si s o l a t e df r o ms i l ti ns a l tl a k e 1 h - n m r a n a l y s i sw a su s e dt oi d e n t i f ye c t o i n ei nc e l le x t r a c t b a s e do nt h ea n a l y s i so f16 sr d n a , s t r a i nw a si d e n t i f i e d 舔h a l o m o n a s ( h a l o m o n a ss p ) w h e nb 2w a sc u l t i v a t e di nm g m e d i u m 谢t l l2m o l ln a c l ，t h em a x i m u me c t o i n ec o n c e n t r a t i o nw a s3 5g l 。 t h ep r o t e c t i v ee f f e c t so fc c t o i n eo nt h e r m a l s t a b i l i t yo fp h y t a s e ( p h y a i i ) w a s i n v e s t i g a t e db yc o m p a r i n g 谢t 1 1o t h e rc o m p a t i b l es o l u t e s t h ec o n c e n t r a t i o n ，p r o t e c t i v e m o d ea n de f f e c to np y r o h y d r o l y s i so fe c t o i n ew e r es t u d i e d t h er e s u l ts h o w e dt h a t e c t o i n eh a dah i g l l e s tt h e r m o p r o t e c t i o ne f f i c i e n c yf o rp h y ai i 鹞t h e r m a l s t a b i l i t y p r o t e c t i v ea d d i t i v e a c c o r d i n gt h ea n a l y s e so ft h e r m o d y n a m i c sa n dk i n e t i c so fh e a ti n a c t i v a t i o no fp h y ai i ， c o m b i n i n gw i mu va n df l u o r e s c e n c es p e c t r a , t h em e c h a n i s mo fi m p r o v i n ge n z y m e t h e r m a ls t a b i l i t yb ye c t o i n ew a ss p e c u l a t e d t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h ea d d i t i o no f e c t o i n ei m p r o v e da u ，a ll ，a g a n dh 2 ，a sw e l la sr e d u c e dc o n s t a n tko fi n a c t i v a t i o n r a t e t h ef l u o r e s c e n c ea n du vs p e c t r as h o w e dt h a te c t o i n ew a sd i s a d v a n t a g e df o r s t r e t c h i n go fp e p t i d ec h a i na l i c re n z y m eh e a tt r e a t m e n t t h e r e f o r e ，i tw a ss u g g e s t e dt h a t a d d i t i o no fe c t o i n em a i n l yl e dt oc h a n g eo fh y d r o g e nb o n de i t h e ri n s i d ee n z y m eo r b e t w e e ne n z y m ea n dw a t e ri nm e d i a , w h e r e a sb e n e f i tf o ri n c r e a s i n go ft h et h e r m a l s t a b i l i t yo fe n z y m e s e f f e c to fe c t o i n eo nn o v o z y m 4 3 5a n dw h o l ec e l ll i p a s ef r o ma s p e r g i l l u so r y z a e d m 01w e r ei n v e s t i g a t e du s i n gt r a n s e s t e r i f i c a t i o nf o rb i o d i e s e la n de s t e r i f i c a t i o nf o r a e t h y l i so l e a s 嬲m o d e lr e a c t i o n si no r g a n i cm e d i a t h er e s u l ti n d i c a t e dl i p a s ew o u l db e i n h i b i t e db ye x c e s sm e t h a n o l ( a l c o h 0 1 ) 嬲s u b s t r a t e s e c t o i n ee x h i b i t e ds i g n i f i c a n t p r o t e c t i o no ne n z y m a t i ca c t i v i t yi no n c eo rr e u s e c o m p a r e d 谢mo t h e rc o m p a t i b l e 纠 、， q ? 英文摘要 t e c t i o n h o w e v e r , e x c e s se c t o i n ew o u l dr e s u l ti n i n h i b i t t i n ge n z y m a t i ca c t i v i t y u s i n gf o u r i e rt r a n s f o r m i n f r a r e ds p e c t r o s c o p yf f t m ) ，c o m b i n e dw i t he n z y m a t i c k i n e t i ca n a l y s i s ，t h em e c h a n i s mo fi m p r o v i n ga c t i 讥t i 懿o fl i p a s ei nm e t h a n o l ( e t h a n 0 1 ) a n do l e i ca c i db ya d d i t i n eo fe c t o i n ew a si n v e s t g a t e d o r i g i n a li n f r a r e ds p e 矧r aa n d s e c o n d a r ys t r u c t u r ea n a l y s i so fn o v o z y m 4 3 5s h o w e dt h a to p t i m a le c t o i n ec o u l dr e d u c c t h eh y d r o g e nb o n da s s o c i a t i o no fm e t h a n o lo nc 1 1 z y m ea n di n c r e a s es t a b i l i t yo fe n z y m e b yi n c r e a s i n g8 - s h e e ts t r u c t u r e i na d d i t i o n ，e l l z y m ec a t a l y s i sk i n e t i c sa l s os h o w st h a t s u p p l e m e n t a t i o nw i t ha na p p r o p r i a t ea m o u n to f e e t o i n el e dt oad e c r e a s ei nt h ea f f i n i t y o fl i p a s ef o rm e t h a n 0 1 t h ei n f i a r e ds p e c t r u mo fa o r y z a ed m 0 1l i p a s es h o w e dt h a t o l c i ca c i da n da b s o l u t ee t h a n o lh a da ne f f e c to ne n z y m ec o n f o r m a t i o n ，i nw h i c ho l e i c a c i ds i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e di n t r a m o l e c u l a rh y d r o g e nb o n d i n gt oi m p a c to n 既i z y m e c o n f o r m a t i o no ng r e a t e rd e g r e e a d d i t i o no fc c t o i n er e d u c e dt h ec h a n g et r e n do f s e c o n d a r ys t r u c t u r e w h i c hc l o s e dt ot h en a t u r a lc o n f o n n a t i o no f t h ee n z y m e k e yw o r d s ：e c t o i n e ；e n z y m e ：t h e r m a l s t a b i l i t y ) o r g a n i cm e d i a ；m e c h a n i s m 一 、 v q ： 、 匕 目录 目录 弓i言1 第1 章文献综述。4 1 1 酶稳定性4 1 1 1 影响酶稳定性的环境因素4 1 1 2 酶稳定性研究方法“7 1 1 3 提高酶稳定性策略1 5 1 2 酶稳定剂1 7 1 2 1 酶稳定剂种类1 7 1 2 2 渗透压补偿性溶质的种类及性质1 9 1 2 3 渗透压补偿性溶质e c t o i n e 2 0 1 2 4e c t o i n e 对酶的保护作用机理：2 2 1 3 植酸酶和脂肪酶的稳定性2 7 1 4 本论文研究背景和内容2 9 第2 章中度嗜盐菌h a l o m o n a as p b 2 发酵制备e c t o i n e 3 1 2 1 主要材料3 1 2 1 1 样品来源3 1 2 1 2 培养基3 l 2 1 3 材料3 1 2 1 4 仪器设备3 1 2 2 实验方法3 2 2 2 1 菌株的分离纯化及分类鉴定3 2 2 2 2 摇瓶培养3 2 2 2 3e c t o i n e 浓度的h p l c 测定3 2 2 2 4e c t o i n e 的1 h n m r 鉴定3 2 2 2 5 发酵罐分批发酵3 3 2 2 6 细胞干重测定。3 3 2 3 结果与讨论3 3 2 3 1e c t o i n e 合成菌株的分离筛选3 3 2 3 2e c t o i n e 的1 h - n m r 鉴定3 4 2 3 3n a c l 浓度对e c t o i n e 合成的影响3 5 2 3 4e c t o i n e 分批发酵：3 6 目录 2 4 小结3 7 第3 章e c t o i n e 对植酸酶热稳定性影响的研究3 8 3 1 实验材料3 8 3 1 1 实验菌株3 8 3 1 2 材料3 8 3 1 3 试剂配制3 8 3 1 4 仪器设备4 1 3 2 实验方法4 1 3 2 1 植酸酶纯化4 1 3 2 2 植酸酶活性测定：4 1 3 2 3 残余酶活性测定4 2 3 2 4 植酸水解率测定4 2 3 3 结果与讨论4 2 3 3 1p h y ai i 热稳定性4 2 3 3 2e c t o i n e 对p h y ai i 热稳定性的影响4 3 3 3 3e c t o i n e 对p h y ai i 水解的影响4 4 3 3 4e c t o i n e 对p h y ai i 热稳定性保护作用方式4 5 3 3 5e c t o i n e 与其它补偿性溶质对p h y ai i 热稳定性影响比较4 6 3 4 小结4 7 第4 章e c t o i n e 提高植酸酶热稳定性机理的研究4 9 4 1 实验材料4 9 4 1 1 材料4 9 4 1 2 仪器设备4 9 4 2 实验方法。j 5 0 4 2 1p h y ai i 失活动力学分析5 0 4 2 2p h y ai i 失活热力学分析5 0 4 2 3 植酸酶热失活测定5l 4 2 4p h y ai i 紫外和荧光光谱扫描5 l 4 3 结果与讨论o 0 5 1 4 3 1 植酸酶热失活的动力学分析5 1 4 3 2 植酸酶热失活的热力学分析5 3 4 3 3 热处理下植酸酶构象分析5 5 4 4d 、结6 0 p 7 q t ? 匕 目录 第5 章e c t o i n e 在有机相对脂肪酶保护作用的研究6 2 5 1 实验材料6 2 5 1 1 实验菌株6 2 5 1 2 材料6 2 5 1 3 培养基6 2 5 1 4 仪器设备6 2 5 2 实验方法6 3 5 2 1n o v o z y m 4 3 5 催化转酯合成生物柴油( 脂肪酸甲酯，m e ) 6 3 5 2 2 气相色谱分析6 3 5 2 3 全细胞脂肪酶的制备6 3 5 2 4 油酸乙酯合成6 4 5 2 5 油酸乙酯酯化率的测定“ 5 3 结果与讨论。6 5 5 3 1e c t o i n e 对n o v o z y m 4 3 5 催化转酯合成生物柴油的影响6 5 5 3 2e c t o i n e 对d m 0 1 脂肪酶催化酯化合成油酸乙酯的影响7 l 5 4 小结7 6 第6 章e c t o i n e 对有机相脂肪酶保护作用机理探讨7 7 6 1 实验材料7 7 6 1 1 材料7 7 6 1 2 仪器设备。7 7 6 2 实验方法7 8 6 2 1 反应初速率动力学模型的建立7 8 6 2 2n o v o z y m 4 3 5 红外测试方法7 8 6 2 3 红外光谱数据处理7 8 6 2 4d m 0 1 脂肪酶的制备提取7 9 6 2 5e c t o i n e 对乙醇中脂肪酶紫外光谱的影响7 9 6 2 6d m 0 1 脂肪酶红外测试方法7 9 6 3 结果与讨论7 9 6 3 1 酶促棉籽油转酯反应中外扩散限制的影响7 9 6 3 2e c t o i n e 对酶促动力学影响8 l 6 3 3 e c t o i n e 对n o v o z y m 4 3 5 构象影响的研究8 3 6 3 4e c t o i n e 对n o v o z y m 4 3 5 蛋白质酰胺i 带二级结构的影响8 5 6 3 5e c t o i n e 对d m 0 1 脂肪酶在无水乙醇中构象的影响9 4 目录 6 3 6e c t o i n e 对油酸环境中d m 0 1 脂肪酶的构象的影响1 0 0 6 4d 、结1 0 3 结论1 0 5 参考文献1 0 7 附录ae c t o i n e 对n o v o z y m 4 3 5f t i r 光谱影响1 l7 附录be c t o i n e 对d m 0 1 脂肪酶f t i r 光谱的影响1 2 0 攻读学位期间公开发表论文1 2 3 致谢1 2 4 p 、， q ： j b 渗透压补偿性溶质e c t o i n e 对酶稳定性影响的研究 引言 酶作为生物催化剂，与一般的化学催化剂相比，具有催化效率高、专一性强、 反应条件温和、副产物少、不污染环境等优点。因此在医学、食品加工、轻工业、 能源开发和环境保护等领域的应用日益广泛。然而，酶在生产和应用中一个突出 问题是它的稳定性。和其它蛋白质一样，冷冻干燥、高温、高渗、p h 变化、有机 溶剂和某些表面活性剂等都可使酶变性而失活。 例如植酸酶( p h y t a s e ，e c 3 1 3 8 ) 是一类能够水解植酸及植酸盐的磷酸酶， 它能在动物体内或体外将不被单胃动物利用的植酸降解成磷酸肌醇( 或肌醇) 和 无机磷酸，作为单胃动物的饲料添加剂，可使植物性饲料中磷的利用率提高6 0 ， 解除植酸对矿物质元素和蛋白质的螯合作用，提高单胃动物对矿物质元素和蛋白 质的吸收和利用。但是饲料生产中的制粒过程一般在7 5 - 8 0 ，同时为了杀死 沙门氏菌，有时温度高达8 5 c - 一9 0 ，植酸酶在这样的温度下很容易失活。如来 源于彳n i g e r 植酸酶在6 0 9 0 处理后发生不可逆的构型变化，酶活性损失7 0 以 上，在7 5 的饲料加工温度下，酶活性恢复能力只有3 1 ，热稳定性差。 有机溶剂中进行的酶催化反应由于具有高度的立体选择性和区域选择性等特 点而受到人们重视。在有机相中获得应用的酶包括氧化还原酶类、转移酶类、水 解酶类及异构酶类，其中脂肪酶是在有机相中催化反应种类最多、应用最广泛的 酶类之一。脂肪酶( l i p a s e ，e c 3 1 1 3 ) 是专门在油水的界面上起催化作用的酶， 在有机相中可以完成酯化、交换酯化及转酯等反应。如利用脂肪酶催化油脂和甲 醇转酯合成脂肪酸甲酯，作为生物柴油主要成分，可以替代石化柴油。利用脂肪 酶催化油酸和乙醇酯化合成油酸乙酯，可以广泛应用在化工和食品等行业。然而， 在这些反应中，一些酶作用底物如短链醇，有机酸等有机溶剂对酶存在着抑制作 用，酶发生不同程度的不可逆失活，短链醇的转化率低，酯合成率低，导致酶投 量大，成本高。 目前，提高酶的稳定性通常可通过以下途径：1 、采用固定化方法，可以提高 酶稳定性，但在固定化过程中，酶活损失较大，且反应底物和产物容易堵塞载体 引言 孔径，降低酶活。2 、采用化学修饰剂修饰酶的功能基团，增强在逆环境中稳定性， 但同一种修饰剂对不同酶的修饰行为不同，不具有通用性。3 、蛋白质工程是提高 酶的稳定性最根本的方法，主要通过基因工程技术增加蛋白质的疏水性，取代易 氧化的活性基团或易脱胺的氨基酸等方法。但目前由于蛋白质的三维结构测定和 蛋白质纯化、结晶等技术尚无大的突破，仍处于开发的早期阶段。4 、采用稳定添 加剂提高酶稳定性，酶稳定添加剂主要包括多元醇、糖、多聚体、表面活性剂， 氨基酸衍生物等。例如为提高植酸酶的热稳定性，常采用筛选耐高温菌种、蛋白 质工程法、化学修饰法、添加酶稳定性剂和制备包被型颗粒酶等方法；为提高脂 肪酶在有机相中的稳定性，研究者采用构建逆胶束体系、添加介质、酶固定化和 添加酶稳定剂等方法。其中添加酶稳定剂的方法因其无毒，操作简单，不影响酶 的天然构象而受到青睐。 e c t o i n e ( 1 ，4 ，5 ，6 四氢2 甲基- 4 嘧啶羧酸) 是1 9 8 5 年g a l i n s l d 等在极端嗜盐外 硫红螺菌属( e c t o t h i o r h o d s p i r a ) 的光合紫细菌( h a l o c h l o r i s ) 中发现的一种渗透 压补偿性溶质。研究表明，e c t o i n e 能够减轻乳酸脱氢酶( l d h ) 和磷酸果糖激酶 ( p f k ) 因热、冷冻和干燥胁迫引起的伤害。研究者推测e c t o i n e 提高酶的稳定性 机理和其他的补偿性溶质( 海藻糖、甜菜碱) 一样，e c t o i n e 对酶在热胁迫下的保 护机理符合“优先排阻”假说。对酶在冷冻干燥胁迫下的保护机理符合“水替代”假 说。也有人认为e c t o i n e 在水溶液中通过降低蛋白质周围的水扩散速度来稳定蛋白 质构象。在e c t o i n e 提高酶稳定性的已有研究中，选择l d h 和p f k 作为研究对象， 原因是这两种酶比较娇嫩，在水溶液中热稳定性较差，而且酶活测定方法简便。 然而，大多数情况下研究者还是偏重于选择实用、便利和用途广泛的蛋白质体系。 并且这些保护机理的提出都是针对e c t o i n e 对酶分子水化层的自由水或结合水的影 响，对酶构象是否直接有影响，目前还没有研究报道。 本文从盐池淤泥中筛选获得合成e c t o i n e 菌株，利用发酵罐制备e c t o i n e 。研究 e c t o i n e 对植酸酶在高温条件下和脂肪酶在有机溶剂中稳定性的影响。通过考察添 加e c t o i n e 对植酸酶热失活动力学和热力学影响和光谱分析，探讨e c t o i n e 对植酸 酶热处理后酶构象的影响；分析脂肪酶在有机相中红外光谱变化，研究e c t o i n e 对 2 b _ 渗透压补偿性溶质e c t o i n e 对酶稳定性影响的研究 有机相中脂肪酶蛋白二级结构的影响，探讨其作用机理。结果表明e a o i n e 对植酸 酶和脂肪酶有显著保护作用，植酸酶9 0 c 力n 热1 5m m 后，与不加e a o i n e 相比， 添加o 5m m o l l 的e c t o i n e 使植酸酶的残余酶活性由11 3 提高到8 3 4 ，酶的热 稳定性增强。e c t o i n e 能降低植酸酶的热失活速率常数，提高热力学活化焓和活化 自由能，推测e a o i n e 的添加导致了酶内部或酶与外界水介质的氢键比对照多，维 持酶构象稳定；在n o v o z y m 4 3 5 催化棉籽油甲酯化合成生物柴油( 脂肪酸甲酯) 和d m 0 1 全细胞脂肪酶催化合成油酸乙酯两种体系中，与未添加e c t o m e 的相比， 添加0 8m m o l le c t o i n e 使脂肪酸甲酯浓度提高了2 3 9 ；添加1 5m m o l l 的 e a o i n e 使油酸乙酯酯化率提高了2 4 8 。适量e a o m e 会降低甲( 乙) 醇对脂肪酶 的氢键缔合作用，维护了酶的构象。 3 第1 章文献综述 1 1 酶稳定性 第1 章文献综述 1 1 1 影响酶稳定性的环境因素 酶是一种由生物体合成，又可脱离生物体而存在的球形蛋白质。酶的稳定性 指的是酶蛋白抵抗各种因素的影响，保持其生物活力的能力【1 1 。由于其特定催化功 能是由其特殊的空间结构决定的，因此要保持其生物活力，必须保持其空间结构。 酶的立体构象既严格又脆弱易变，一些外界条件的变化，如高温、冷冻干燥 和有机溶剂等【2 】都有可能引起立体构象的改变，进而影响酶的稳定性。 ( 1 ) 高温 每一种酶的催化反应都有适宜的温度范围和最适温度，在其他条件相同情况 下，温度每升高1 0 ，化学反应速度增加1 2 倍；当温度超过最适温度，反应速 度逐步降低3 1 。w y s s 掣4 1 利用圆二色和荧光法研究来源于a f u m i g a t u s 和a n i g e r 植酸酶的耐热性能。a f u m i g a t u s 和a n i g e r 植酸酶最适温度分别为5 0 和5 5 。 两种植酸酶在6 0 9 0 处理2 0m i n 后均发生变性。其中彳n i g e r 植酸酶发生不可逆 的构型变化，活性损失7 0 以上。在7 5 的饲料加工温度下，4 f u m i g a t u s 植酸酶 活性恢复能力较强，有5 1 ，而a n i g e r 植酸酶只有3 1 ，热稳定性差。植酸酶主 要用于饲料添加剂，饲料造粒的温度一般在7 5 - 8 0 ，有时高达8 5 - - 9 0 ， 因此提高植酸酶的热稳定性，对于植酸酶的广泛应用具有重要意义。包括植酸酶 在内的许多种酶，均面临高温变性失活的问题。提高酶的热稳定性是酶制剂工业 中重要理论和技术问题。 从热力学角度来看，酶分子的天然构象为熵值小的高度有序状态，是不稳定 的。但由于酶分子内部基团之间的氢键和疏水作用等次级键以及基团与外相水溶 液间的氢键在很大程度上能产生补偿性的熵值，从而使整个酶分子结构的熵值处 于一种相对平衡的状态，使天然酶紧密有序的构象得以维持。但是，当温度升高 后，这种平衡状态就被打破【5 】。因为高温会导致酶蛋白氢键或疏水键被破坏，酶分 子的天然构象向热力学上熵值增高的方向变化，也就是从熵值较低的紧密有序状 4 p v p ， 山 渗透压补偿l 生溶质e c t o i n e 对酶稳定性影响的研究 态向趋于随机的松散状态变化，折叠结构打开，酶的反应基团和疏水区域暴露， 随后相互作用导致酶不可逆失活。另外肽键容易在高温的条件下发生水解反应， 影响酶的热稳定性。这些反应包括a s h ( 天冬酰胺) 和g i n ( 谷氨酰胺) 的脱氨作 用，在a s p ( 天冬氨酸) 处的肽键水解，c y s ( 半胱氨酸) 的氧化，二硫交换作用 和二硫键的破坏，这些破坏性反应直接导致高温下酶失活【6 】。 ( 2 ) 冷冻干燥 关于冷冻干燥失活机理，研究者认为蛋白质的变性主要发生在冷冻过程( 即 预冻过程) 。c h i l s o n 等【7 】认为冷冻过程中结晶引起溶剂水的状态和结构的变化是 蛋白质变性的主要原因，并且蛋白质变性的程度依赖于冷冻的程度，冷冻温度越 低，蛋白质变性越剧烈。h a n a f u s a t s 】对卵清蛋白和肌球蛋白进行了冷冻干燥对比实 验，表明正是由于蛋白质表面覆盖着没有冻结的单层水分子，才使蛋白质在冷冻 过程中不发生变性作用。当蛋白质表面的单层水分子开始冻结时，蛋白质分子表 面的氢键以及极性基团就会暴露在周围环境中而变性。有的研究者认为，在低温 下有序的水的结构引起蛋白质分子中疏水键的破坏是导致蛋白质变性的主要原 因。冻结过程中水结冰时体积增大，致使活性物质活性部位中一些由弱分子力连 接的键遭到破坏，从而使活性损失【9 1 。另外，水结冰后引起溶质浓度上升以及由于 各种溶质在不同温度条件下溶解度变化不一致而引起p h 值的变化，导致活性物质 所处的环境发生变化而造成失活或变性【1 0 】。 如果忽略冷冻过程，单纯地考虑干燥脱水对蛋白质造成的影响，在脱水过程 中，由于水的去除，不可避免会引起蛋白质的变性、聚集，维持蛋白质立体结构 的作用力被破坏。所有这些都可能导致蛋白质活性损失【1 1 】。 ( 3 ) p h 值 p h 值对酶活性的影响主要是由于在不同p h 值条件下，酶和底物中基团的解 离状态发生改变，从而影响酶的构象和以及酶与底物的结合能力和催化能力。极 端p h 值条件下，酶的空间结构破坏发生改变，引起酶变性活性丧失【3 】。这种失活 分可逆和不可逆两种方式，可逆失活指在不同p h 值下保温的酶催化必需基团电 离，但对酶结构没有严重影响，重新调整p h 值，可恢复活力。极端p n 下引起蛋 、 第1 章文献综述 白质的酸碱变性的结果是，一旦远离蛋白质的等电点，蛋白质分子内部相同电荷 间的静电斥力会导致蛋白质伸展，埋藏在