（环境工程专业论文）光合细菌利用工业有机废水产生5氨基乙酰丙酸的研究.pdf

浙江大学硕士学位论文摘要 摘要 5 一氨基乙酰丙酸( a l a ) 是一种无公害绿色的除草剂、光动力学剂、 杀虫剂、抗微生物药剂、植物生长促进剂。光合细菌生物合成a l a 因工艺 简单、产率高，具有工业化生产潜力，倍受国外研究者及产业界的关注。本 论文主要研究了产a l a 光合细菌的分离和选育及其利用有机废水产生a l a 的潜力。 广 l 从不同生境分离的3 6 株光合细菌菌株中，经初筛获得7 株a l a 产量较 高的菌株。经复筛，发现9 9 - 2 8 菌株的a l a 产量较高，达3 1 4 5m g l 。对9 9 - 2 8 菌株进行形态、生理生化鉴定，确定该菌株属紫色非硫红假单胞菌属。该菌 株的最适培养条件：p h7 5 ，光照强度3 0 0 0l u x ，酵母膏浓度0 2 。 采用紫外线对出发菌株9 9 2 8 进行诱变处理，从大量诱变菌株中筛选出 高产菌株l 1 。l 1 菌株产a l a 的最适影响因子：p h7 5 ，光照强度3 0 0 0l u x ， 接种量1 0 。在此条件下，l - 1 菌株的最大地产量为7 2 6 6m g l 。 甘氨酸、琥珀酸是a l a 生物合成的前体，而乙酰丙酸( l 是a l a 脱水 酶( a l a d ) 的抑制剂。本试验结果表明：甘氨酸是a l a 生物合成必需的前体， 加入l a 抑制a l a d 活性，能显著提高a l a 产量光照培养后4 8 h ，3 次 加入基本达到效果。在g m 培养基，p h 7 5 ，3 0 0 0l u x 光照，培养4 8h 后加 入l a3 0m m o l l 、甘氨酸3 0r a m o l l 和琥珀酸3 0n u n o l l ，9 9 2 8 菌株的地 产量可达9 1 5 4m g 几，菌株l - l 的a l a 产量可达2 2 1 5m g l 。 选用味精、柠檬酸、啤酒、豆制品生产废水作为产生a l a 的底物，废 水中不加入l a 、甘氨酸和琥珀酸时，9 9 - 2 8 菌株培养1 2 0h 去除c o d c r 与产 生m a 的结果：味精废水c o d e r 去除率为9 3 5 ，a l a 产量2 5 7 8m 叽： 豆制品废水c o d e r 去除率为9 4 8 ，u a 产量为1 4 2 8m r l ：啤酒废水c o d e r 去除率为9 2 4 ，a l a 产量1 6 5 1r a g l ；柠檬酸废水c o d e r 去除率为7 3 5 ， 浙江大学硕士学位论文摘要 a l a 产量2 0 2 9m g ，l 。在加入l a 、甘氨酸和琥珀酸的条件下，9 9 - 2 8 菌株 的a l a 产量明显提高，培养9 6h 产生a l a 的结果：味精废水为3 4 8 8m g l 、 豆制品废水为2 4 5 8m g l 、啤酒废水为2 0 9 7m g l 、柠檬酸废水为2 8 0 1 r a g l ：但加入l a 、甘氨酸和琥珀酸后，c o d e r 基本上不再下降。 l 1 菌株在味精废水中产a l a 最适条件为：p h7 5 ，接种量1 0 ( v v ) ， 光照强度3 0 0 0 l u x 。 在不加入l a 、甘氨酸和琥珀酸的条件下，l 1 菌株培养1 2 0h 去除有机 废水c o d c r 与产生a l a 的结果如下：味精废水去除率为9 1 6 ，a l a 产量 2 8 1 9m g l ；豆制品废水去除率为9 1 8 a l a 产量为1 5 3 1r a g l ：啤酒废 水去除率为9 1 5 ，a l a 产量2 1 6 6m g i ：柠檬酸废水去除率为7 3 4 ，地 产量2 4 2 4m g t , 。在加入l a 、甘氨酸和琥珀酸的条件下，l 1 菌株豹a l a 产量明显提高，培养4 天产生a l a 的结果如下：味精废水为6 4 9 3m g l ， 豆制品废水为1 9 9 4m g ，l ，啤酒废水为7 2 6 6m g t , ，柠檬酸废水为5 3 9 4 r a g l ：但加入l a 、甘氨酸和琥珀酸后，c o d c r 基本上不再下降。y 本研究结果对光合细菌菌株资源的深度开发及工业有机废水的资源化 利用具有一定的实衔；意义 关健词：5 一氨基乙酰丙酸紫色非硫红假单胞菌工业有机废水 i i 浙江大学硕士学位论文摘要 a b s t r a c t 5 - a m i n o l e v u l i n i ca c i d ( a l a ) c a l lb eu s e da san o n - p o l l u t i o nh e r b i c i d e ， i n s e c t i c i d e ，p h o t o d y n a m i ca g e n t , a n t i m i c r o b i a ld r u g ，a n da c c e l e r a r t t o fp l a n t g r o w t h m i c r o b i a lp r o d u c t i o no f a l a m a y b ee x p e c t e dt ob e c o m ec o m m e r c i a l l y v i a b l eb e c a u s eo fs i m p l ep r o c e s sa n dh i g hp r o d u c t i o n , s oi ti sa t t e n d e db y r e s e a r c h e r sa n d e n t e r p r i s e s i n t h i s w o r k , a l ap r o d u c t i o n f r o m o r g a n i c w a s t e w a t e rb y p h o t o s y n t h e t i c b a c t e r i aw a ss t u d i e d s e v e nh i g ha l a p r o d u c t i o np h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a s t a i n sw e r es c r e e n e d o u tf r o m3 6p h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i as l 响i si s o l a t e df r o mv a r i o u se n v i r o n m e n t s t h ea l a p r o d u c t i o n o f s t r a i n9 9 2 9 ，w h i c h - e r a su pt o3 1 4 5 m g li ng m c u l t u r e ， w a st h eh i g h e s t b ym o r p h o l o g i c ，p h y s i o l o g i ca n db i o c h e m i s t r yt e s t , t h i ss t r a i n w a si d e n t i f i e da sp u r p l en o n s u l p h u r r h o d o p s e u d o m o n a ss p t h eo p t i m a lg r o w t h c o n d i t i o no fs w a i n9 9 - 2 8w 器p h7 5 ，3 0 0 0l u xo fi l l u m i n a t i o ni n t e n s i t ya n d 0 2 y e a s t e x t r a c t i o n r h o d o p s e u d o m o n a ss p 9 9 - 2 8s t r a i nw 鼬m u t a t e d b y u l t r a v i o l e tr a d i a t i o na n da m u t a n ts t r a i nl - 1 w h i c ha l a p r o d u c t i o nw a sh i g h e rt h a nw i l ds t r a i n9 9 - 2 8 a b o u to n et i m ew a so b t a i n e d t h eo p t i m a la l a p r o d u c t i o nc o n d i t i o no f s t r a i n l - 1w a s p h7 5 ，3 0 0 0l u x o fi l l u m i n a l i o ni n t e n s i t ya n d1 0 ( v v ) o fi n o c u l a t e q u a n t i t y a l ap r o d u c t i o n o f l 1w 私u pt o7 2 6 6m g ，li nt h i sc o n d i t i o n g l y c i n e a n ds u e e i n a t ew a sa l ap r e c u r s o ri nt e t r a p y r m l eb i o s y n t h e s i s p a t h w a y , l e v u l i n i ca c i df l a 、w a sac o m p e t i t i v ei n h i b i t o ro f 札ad e h y d m t a s e ( a l a d ) e x p e r i m e n t a l r e s u l t si n d i c a t e d ：g i y c i nw a sn e c e s s a r yp r e c u r s o ro fa l a s y n m e s i s ，w h i l es u c c i n a t ew a sn o t ；s u p p l yo fl ac o u l ds i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e a l a p r o d u c t i o n t h eo p t i m a ls u p p l yt i m ew a s 4 8ha f t e rc u l t u r e du n d e rl i g h t , s u p p l y i n g 3t i m e sc o u l da l m o s tg e tt h eb e s te f f e c t i ng mm e d i u m , p h7 5 ，3 0 0 0 i v 浙江大学硕士学位论文摘要 l u x ，o 2 y e a s te x t r a c t , s u p p l yo f 3 0m m o l ll a ，3 0m m o l lg l y c i n ea n d3 0 m m o l ls u c c i n a t ei n4 8ha f a rc u l t u r e du n d e rl i g h t a l ap r o d u c t i o no fs t r a i n 9 9 - 2 8 w a s 9 1 5 4 m g r l ，t h a to f s t r a i n l - 1w a s u p t 0 2 2 1 5 m g l ，l i n c u b a t e d1 2 0bs t r a i n9 9 - 2 8c o d e rr e m o v a le f f i c i e n c yo fm o n o s o d l u m g l u t a m a t ew a s t e w a t e rw a s9 3 5 a l ap r o d u c t i o nw a s2 5 7 8m g l ；c o d c r r e m o v a le f f i c i e yo fs u c c o t a s hw a s t e w a t e r9 “ d s9 4 8 a l ap r o d u c t i o nw a s 1 4 2 8 m g l ；c o d e rr e m o v a le f f i c i e n c yo fb r e w a g ew a s t e w a t e rw a s9 2 4 a l a p r o d u c t i o nw a s l 6 5 1m e l ；c o d e r r e m o v a le f f i c i e n c yo fc i u - i ea c i dw a s t e w a t e r 1 a e d s7 3 5 ，a l ap r o d u c t i o nw a s2 0 2 9m g ，l 口v h e nl a ，g l y c i na n ds u c c i n a t e w e f es u p p l i e d a l ap r o d u c t i o no fs t r a i n9 2 8a f t e r9 6hw e r e ：m o n o s o d i u m g l u t a m a t ew a s t e w a t e r , 3 4 8 8m g 几；s u c c o t a s hw a s t e w a t c l - , 2 4 5 8m g l ；b r e w a g e w a s t e w a t e r , 2 , 0 9 7m s l ；c i t r i c a c i dw a s t c w a t e r , 2 8 0 1 m g r l ，w h i c hw a s s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nn os u p p l yo fl a , g l y c i na n ds u c e i n a t e h o w e v e r , a f t e r l a ，g l y e i n a n ds u e e i n a t ew e r es u p p l i e d ，c o d e rc o u l dh a r d l yb er e m o v e d i nm o n o s o d l u m g l u t a m a t ew a s t e w a t e r , t h eo p t i m a l a l ap r o d u c t i o n c o n d i t i o no f s t r a i nl - 1w a s ：p h7 5 i n n e u l a t eq u a n l i t y1 0 ( v v ) ，l i g h t3 0 0 0 l u x i n c u b a t e d1 2 0ks t r a i nl - 1c o d e rr e m o v a le f f i c i e n c yo fm o n o s o d i u m g l u t a m a t ew a s t e w a m rw a s9 1 6 a l ap r o d u c t i o nw a s2 8 1 9r a g l ；c o d e r r e m o v a le f f i c i e n c yo fs u c c o t a s hw a s t e w a t e rw a s9 1 8 a l ap r o d u c t i o nw a s 1 5 31m g l ；c o d e rr e m o v a le f f i c i e yo f b r e w a g ew a s t e w a t e r w a s9 1 5 a l a p r o d u c t i o nw a s 2 1 6 6m g 他c o d e r r e m o v a le f f i c i c yo fc i t r i ca c i dw a s t e w a t e r w a s7 3 4 ，a l ap r o d u c t i o nw a s2 4 2 4m g l w h e nl a ，g l y e i na n ds u c c i n a t e w e r es u p p l i e d , a l ap r o d u c t i o no fs t r a i nl - ia f t e r9 6hw e r e ：m o n o s o d l u m g l u m m a 把w a s t c w a t e r , 6 4 9 3r a g l ；s u c c o t a s hw a s t e w a t c r , 1 9 9 4m 班；b r e w a g e w a s t e w a t e r , 7 2 6 6r a g l ；c i t r i c a c i dw a s t e w a t e r5 3 9 4 m g l w h i c h w 鹊 v 浙江大学硕士学位论文摘要 s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nn os u p p l yo fl a ，g l y c i na n ds u e e i n a t e h o w e v e r , a f t e r l a g l y e i na n d s u e c i n a t ew e r e s u p p l i e d , c o d e r c o u l d h a r d l y b er e m o v e d t h er e s u l t so ft h i s s t u d y w o u l db e s i g n i f i c a t i o n i n d e v e l o p m e n t o f p h o t o s y n t h e t i c b a c t e r i ar e s o u l 忆f a n du t i l i z a t i o no f i n d u s t r i a lo r g a n i cw a s t e w a t e r k e yw o r d ：5 一a m i n o l e v u l i n a t e a c i d p h o t o s y n t h e t i c b a c t e r i ai n d u s t r i a l o r g a n i c w a s t e w a t e r v i 浙江大学硕士学位论文致谢 致谢 本论文是在导师徐向阳副教授的悉心指导下完成的。三年来， 导师渊博的知识、敏锐的学术洞察力和孜孜不倦的教诲，令我终 身受益。在论文完成之际，对导师多年的关心与教诲表示最诚挚 的感谢。 在论文的研究过程中，俞秀娥副教授给予了无私的帮助与启 迪，在此我表示衷心的感谢。感谢郑平教授、沈东升副教授、胡 宝兰老师对我论文的大力支持；朱广伟博士、蓝雪春、叶敏、项 硕等同学都为我实验的完成提供了不少的帮助，在此我表示衷心 的感谢。 在这三年中，我的丈夫滕胜给予我大力的帮助和支持，同时， 爸爸、妈妈也始终默默关爱和支持我，在此道一声：谢谢! 最后，对参加本文评议、评阅、答辩和对本论文提出宝贵意 见的所有专家表示真诚的感谢! 刘秀艳 二oo 一年五月 浙江大学硕士学位论文第一章绪言 1 1 前言 第一章绪言 5 氨基乙酰丙酸( 5 - a m i n o l c v u l i n i ca c i d ) ，以下简称a l a ，是卟啉、( 亚 铁) 血红素和维生素b 1 2 的类似物【5 2 】。近年研究发现，5 氨基乙酰丙酸( a l a ) 可作为一种无公害绿色的除草剂和光动力学剂( p h o t o d y n a m i ca g e n t ) ，可用 作杀虫剂、抗微生物药剂、植物生长促进剂及治疗癌症与其它疾病【抑一。光 合细菌生物合成a l a 因工艺简单、产率高，具有工业化生产潜力，因而倍 受国外研究者及产业界的关注。用光合细菌生产a l a 的另一个优点是它能 以有机废水为底物，为有机废水资源化处理提供一条新途径。 自七十年代以来，研究者先后发现蓝细菌、产甲烷菌、嗜热梭菌、假单 胞菌在a l a 合成酶的催化下，可转化有机物产生低浓度的a l a ( 表1 ) 。 日本广岛大学工学部永井史郎教授领导的研究小组，根据紫色非硫光合 细菌富含b 1 2 、类胡萝h 素等生理活性物质的特点，率先开始光合细菌产a l a 的研究，在高产菌株选育、底物选择、a l a 脱水酶抑制剂及产生a l a 的优 化操作条件等方面作了详尽的研究，结果发现紫色非硫光合细菌在挥发酸培 养液中，可产生高浓度a l a 【7 2 】，为获得高产a l a 菌株，国外研究者将代谢 工程和基因工程技术应用于该领域的研究h 1 删。c h e n 等通过a i a 合成酶基 因h e m a 在ec o l i 上表达，获得高浓度a i a 【4 9 7 9 】：m a r i e t 和z e i k u s 将编 码a i a 合成酶h e m a 基因通过p u c l 8 1 9 载体转化ec o l i 获得重组菌株，试 验发现其胞外a l a 浓度高达3 7 9g l t 弱】。应用基因工程方法获得高产率菌株 将是今后的研究方向1 3 8 , 5 0 5 3 6 1 , 叫。 下面以球形红假单胞菌( r h o d o b a s c t e rs p h a e r o i d e s ) 为例，对a l a 生 化合成及调节途径以及光合细菌处理废水的研究作一简要介绍。 浙江大学硕士学位论文第一章绪言 1 2a l a 合成生化途径及调节 a l a 生物合成有两条途径畔，捌( 如图1 ) ：即四碳途径和五碳途径。其 中四碳途径是由琥珀酰c o a 和甘氨酸缩合生成a l a ( 酶：a l a 合成酶) ， 这条途径在非硫光合细菌中广泛存在；而五碳途径是由谷氨酸合成a l a ，有 t r n a 参与，主要存在于高等植物，藻类和少数细菌中碡s - 5 6 , 6 5 1 。少数微生物 浙江大学硕士学位论文第一章绪言 两条途径均有。 g 勖卜叶 a 吡咯环胆色素 谷氨酸洲入羟基氨基龇喃 白 图1 微生物生物合成5 氮基乙酰丙酸的c 4 和岛途径 l 2 1 四碳途径( c p a t h w a y ) a i a 合成生化反应及调节途径 c 4 途径底物谷氨酸在转氨酶作用下形成a 酮戊二酸，经m a 合成酶作 用形成a i a ，a l a 合成酶是限制性酶削，催化琥珀酰c o a 和甘氨酸缩合反应。 m a r r i o l r 和他的同事首次报导了两种球形红假单胞菌( r h o d o b a s c t e r s p h a e r o i d e s ) a i a 合成酶分子量分别为1 0 0 0 0 0d a ( f r o m i ) 和6 4 0 0 0d a ( f o n n l ) ，并在其它光合细菌中也分析发现【5 9 邸, 7 2 7 3 】。在球形红假单胞菌 ( r s p h a e r o i d e s ) 中的最适p h 值分别为7 4 和7 8 。 两种形式的酶很大程度上依赖于菌龄和光，当f r o m i 形成时，f o r m l i 由 光诱导产生，并负责合成细菌叶绿素，组成酶参与维生素b 1 2 等细胞色素的 合成。在黑暗条件下和兼氧条件培养下m a 的合成活性增加，其原因主要 是由于f r o m i 的增加而不是f r o m i i 的增加；而在光照兼性厌氧条件下，f r o m i 和f r o m l i 均有显著增加，这说明f r o m i 和f r o m l i 是由不同基因控制。 环境的改变极大地影响a i a 的合成c 7 5 1 。微生物在光照厌氧条件下可增 加a l a 合成酶活性2 4 倍；酶在有光条件下合成受0 2 的抑制【7 蚋。而波长为 浙江大学硕士学位论文第一章绪言 4 8 4 - 6 5 4 n m 的光对球形红假单胞菌衄s p h a e r o i d e s ) 的完整细胞细胞水平a l a 合成无显著影响；而在细胞提取物中a l a 的合成受波长为4 2 2m n ，5 2 2n n l 和5 2 2 5 5 6 眦的光的照射的抑制【7 0 1 。 a l a - 合成酶在细胞对数生长期活性最高，而磷酸吡哆醛是必需辅因子。 球形红假单胞菌( 足s p h a e r o i d e s ) a l a 合成酶活性是由体内低分子量的三硫 化胱氨酸的硫化物或谷胱苷肽调节【6 3 1 ，这些调节物称为三硫胱氨酸 ( c ，s s s q ) ，三硫谷胱苷肽( g s s s g ) 。谷胱苷肽三硫胱氨酸( g s s s c v ) 和 $ 5 0 6 2 - ( s a n d y e t a l1 9 7 5 ) 。在硫化多聚物中( - 0 3 s s n - s0 3 n 1 ) 只 有当n 3 时，活化物的激活特性才能表现出来。m a 合成酶活性为氨基丙 二酸、原卟啉、铁卟啉、氦、腺苷三磷酸( a r p ) 、鸟苷三磷酸( g t p ) 、焦 磷酸和金属离子，特别是f e 2 + 、c u 2 + 、c a 2 + 和硝酸抑制。氨对红色鱼精蛋白 杆菌( p r o t a m i n o b a c t e rr u b e r ) a l a 合成酶无调节作用，并且此a l a 合成酶 不受最终产物维生素b 1 2 抑制【蝈。 1 2 2 五碳途径( c 5p a t h w a y ) a l a 合成生化反应及调节途径 在三羧酸循环系统缺少仪酮戊二酸氧化酶的原核生物中的越a 是由谷 氨酸或仪酮戊二酸合成。已有实验证明a l a 合成的c 5 途径主要存在于植物， 藻类，厌氧古细菌，包括绿硫细菌和好氧细菌如核黄索假单胞菌 ( p s e u d o m o n a s r i b o f l a v i n a ) 、大肠杆菌( e c o l i ) 、鼠伤寒沙门氏菌( s a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m ) 、，枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 、弗罗伊登氏丙酸杆菌 ( p r o p i o m b a c t e r i u mf r e u d e n r e i c h i i ) 等属。 细菌根据c 5 途径可分两类：谷氨酸合成途径经柠檬酸合成途径，主要 出现在克鲁佛氏梭状芽孢杆菌( c l o s t r i d i u ml d u y v e r i ) 、酒色着色菌 ( c h r o m a a u mv i n o s u m ) 等菌中。第二条途径是酮戊二酸一苹果酸一延 胡索酸一琥珀酸+ c 0 厂酮戊二酸一戊二酸，主要存在于绿硫细菌中。 实验证明由谷氨酸到a l a 经三步：1 、经谷氨酰t r n a 合成酶催化使谷 浙江大学硕士学位论文第一章绪言 氨酸连到t r n a 上；2 、经谷氨酰t r n a 转移酶使谷氨酰t r n a 转到g s a ；3 、 g s a 氨基转移酶( g s a a t ) 作用下使g s a 产生a l a 。有人提出了g s a a t 酶反应动力学( e c5 4 3 8g l u t a m a t e1 - s e m i a l d e h y d e2 ，1 - a m i n o m u m s e ) 式。 g s a - a t 原酶分子量为4 6 k d a 单体组成的二聚物，但其对c 5p a t h w a y 的调节 作用还不清楚【帅】。 1 3 球形红假单胞菌噼s p h a e r o i a e s ) 的a l a 合成酶的活化机制 球形红假单胞菌但s p h a e r o i d e s ) 地合成酶的活化机制见图2 。非活性 型的m a 合成酶向活性型转化时，除了要求有胱氨酸和胱硫醚参与外，还 要求有调节蛋白【螂1 。活性化反应的机制首先是胱硫醚酶把胱氨酸的s 原子转 移到调节蛋白分子中，并在调节蛋白分子中形成三硫结构。具有这种三硫结 构的调节蛋白使a l a 合成酶非活性化型转变成活性型。这种转变即使在有 胱硫醚存在时也能发生。分子内s h 与s s 的转换导致非活性型和活性型的 a i a 合成酶分子结构上的变化。但是关于m a 合成酶分子的构造上变化的 细节还有待于进一步研究【帅，耵】。参与活性化的胱氨硫醚酶，不仅存在于球形 红假单胞菌但s p h a e r o i d e s ) 中，而且从鼠肝中提取的y 胱氨硫醚酶的结晶也 具有同样的作用。对y 胱氨硫醚酶复杂反应机理还需要作进一步研究【川。 c y s 3 5 s 3 5 s s - c y s 胱硫醚酶 n 丽 l t 一 b 5 s _ 毒 图2 非活性型a l a 合成酶的活化机制 浙江大学硕士学位论文第一章绪言 1 4 利用球形红假单胞菌( 见s p h a e r o i d e s ) 生物合成a i a 的影响因素 球形红假单胞菌( 五s p h a e r o i d e s ) 适于在g m 培养基及v f a ( 挥发性脂 肪酸培养基) 厌氧光照的培养条件下生长【删。乙酰丙酸( l a ) 、甘氨酸、琥 珀酸、乙酸、丙酸、丁酸及p h 、光照强度等均对a l a 的合成产生影响。 1 4 1 乙酰丙酸( l a ) 、甘氨酸、琥珀酸对a l a 合成的影响 l a 可抑制a i a 脱水酶( a l a d ) 活性1 4 7 , 6 6 。s a s a k i 报道了在加入 1 5 m m o i ll a ，不加琥珀酸及甘氨酸情况下，a l a 产量很少；当乙酰丙酸 ( l a ) 、甘氨酸、琥珀酸同时加入时，虽然l a 加入会抑制细胞生长，但当 l a 、甘氨酸、琥珀酸浓度在2 0 6 0m m o l l 范围内，a 王a 产量明显增加， 并且增加幅度随l a 、甘氨酸、琥珀酸浓度的增加而加大；当l a 、甘氨酸、 琥珀酸浓度达8 0m m o f l 时，反而会抑制a l a 的合成，；当只加l a 与甘氨 酸时，( 浓度在2 0 6 0m m o f l 范围内) ，a l a 产量随l a 、甘氨酸浓度的增 加而加大。当只加入l a 与琥珀酸时，a l a 合成没有被强化。这就说明虽然 琥珀酸是a l a 合成所必需的物质但甘氮酸是心合成的限制性底物。a i a 产量在加入l a 、甘氨酸、琥珀酸情况下，光照培养两天达最大，以后慢慢 降低阳。 此外，a 工a 合成中存在连续加入l a 的问题，这是由于随l a 消耗，a l a d 活性得以恢复。在l a 加入3h 内，a l a d 活性迅速减少3 0 4 0 ，但当培 养到6 0 9 0 h ，随着l a 消耗，a l a d 活性逐渐恢复到原有水平( s a s a k i e ta 1 1 9 8 8 ) ，因此隔2 4 h 就要在培养液中加入一次l a 。如果只加一次l a 与甘 氨酸，经过2 天培养，a l a 产量增加到2 2m m o l l ，2 天后，l a 消耗殆尽， 地产量开始减少。当只加一次6 0m m o l l 甘氨酸，而3 0m m o l ll a 加三 次，a i a 产量明显增加。a i a 合成的减少与l a 消耗有相关性。当l a 加入 七次，d a 产量没有进一步增加。s a s a k i 等 6 7 1 报道虽然l a 的不断加入， 并没有完全抑制a l a d 活性，在废水处理中，如果不断加入l a ，使之大量 浙江大学硕士学位论文第一章绪言 残留在废水中，也会引起环境污染问题。因此，应避免l a 的过量加入，一 次性加入3 0 m m o l l l a 和6 0 m m o l l 甘氨酸，对a l a 合成已经足够了 7 0 1 。 1 4 2 有机酸、p h 等对a 1 a 合成的影响 挥发性脂肪酸培养基( v f a ) 中常常含有大量的氨基酸，因此，在不外 加氮源的条件下。足s p h a e r o i d e s 也能很好生长呻1 。t a n a k a 等( 6 9 , 7 1 1 在v f a 培 养基中加入三次l a 和一次6 0m m o l l 甘氨酸的情况下，地产量为2 - 2 m m o l l ，当加入乙酸、丙酸和正丁酸时，a l a 产量高达9 3 m m o l l 。 r s p h a e r o i d e s 产生a l a 过程受p h 的调控跚。在加入l a 的条件下， 中性p h 时，a i a 合成酶( a l a s ) 活性明显增加而a l a d 很快受到抑制， a l a 合成量较高：低p h 时，虽然a l a d 活性受l a 抑制，但a l a s 活性也 相对较低，导致a l a 产量低；在高p r i 时，a l a s 活性低，a l a d 活性相对 高，在细胞内合成的越a 进一步合成原卟啉，因此，胞外a l a 产量降低。 s a s a k i 等 6 6 1 报道了在加入l a ，甘氨酸的条件下，足ls p h a e r o i d e s 的a l a 产量随光强增加而增加，但当光强超过5 k l x 时，地产量不再进一步增加。 在暗条件下，则无越a 产生。另外他们还发现a l a 产量随足s p h a e r o i d e s 初始细胞浓度增加而增加【1 。 1 5 光合细菌在有机废水处理中的应用 利用光合细菌净化高浓度有机废水。是废水生物处理法中的一个新发展。 它具有有机负荷高、占地面积小、投资费用少、动力消耗低、除氮效果好和 耐盐能力强等优点，而产生的菌体又有可能作为重要的原料进行综合利用网。 因此近年来用光舍细菌处理废水( 简称p s b 处理法) 正受到人们的重视。 目前用于有机废水净化的光合细菌主要是红螺菌科( r h o d o s p i r i l l a c e a e ) 中的红假单胞菌属( r h o d o p e s u d o m o n a s ) 。因为这类光合细菌在厌氧光照、 好氧光照或好氧黑暗条件下都能利用低分子有机物迅速增殖。近年来已在人 粪尿、家畜粪尿、食品、纤维、皮革、有机化学工业等废水的高负荷处理中 浙江大学硕士学位论文 第一章绪言 获得较高的评价5 4 t 6 ，5 1 3 1 5 1 利用光台细菌净化废水的作用原理 六十年代，日本科学家观测了高浓度的粪便污水在自然放置时的菌数变 化”。他们发现在b o d 值高达1 0 0 0 0 毫克升以上的污水中，异养细菌首先 大量繁殖，把高分子的碳水化合物、脂肪、蛋白质分解，产生低级脂肪酸等 分子物质。接着异养细菌渐渐减少，光合细菌则利用低级脂肪酸等小分子有 机物而迅速增殖，使污水的b o d 值逐渐降到1 0 0 0 毫克升以下。约二星期后， 光台细菌渐渐减少。由活性污泥微生物和绿藻所代替。并进一步把污水净化 到b o i ) 值3 0 毫克升以下。这一发现，提示了自然界的高浓度有机污水是通 过微生物的生态学演替而被净化的。 光合细菌中红螺菌科( 通称非硫紫细菌) 的一些种，多见于有机物污染 的水中，直径约6 0 0 一1 0 0 0 埃的球体或杆体。载色体颗粒中密集地包含着细 菌叶绿素和类胡萝h 素，进行着光合磷酸化反应和光氧化还原反应。在好氧 条件下，非硫紫细菌缺少这种载色体，但只要把它们置于厌氧光照条件下就 能很快地形成。这就从细胞结构上为非硫紫细菌灵活地迸行物质、能量代谢 提供了可能。研究表明当非硫紫细菌处于好氧黑暗条件下时，它们能与好氧 微生物一样地通过三羧酸循环来进行有机酸的代谢。但在厌氧光照条件下， 这一循环被抑制时，它们便迅速转换代谢通路，并能把有机酸异化与同化的 氧化还原反应跟光氧化还原反应紧密地联结起来。这种随生长条件的变化而 灵活地改变代谢类型的特性，乃是这类生物能够在自然环境净化过程中担当 重任的主要原因。 非硫紫细菌所喜欢的营养物质，主要是低分子的有机酸、氨基酸和糖类。 除了油脂可直接被利用外，其他营养物质必须是低分子有机物才能被利用。 用光台细菌成功处理有机污水的关键在于基质的可溶性和保持处理系统中 光合细菌的优势。 浙江大学硕士学位论文第一章绪言 1 5 2 国内外应用光合细菌处理有机废水的研究概况 目前，高浓度有机废水已成为主要的水污染源，是环境保护领域中亟待 解决的重点。而通常所用的活性污泥法又普遍存在占地面积大、维修管理复 杂、基建及运转费用高等到缺点，寻求先进实用的处理新技术是国内外研究 者研究的目标。光合细菌用于高浓度有机废水的处理早已引起人们的高度重 视。由于此工艺设备简单、耗能少、菌体能综合利用、不造成二次污染，在 国外己得到初步应用。日本自六十年代起，小林正泰等首先开展了用p s b 法 处理有机废水的试验研究，先后成功地用光合细菌对粪尿、食品、淀粉、皮 革、豆制品等废水进行处理，建立了一批日处理几十、几百乃至几千吨高浓 度有机废水的大中型处理系统，有的已运转十多年，效果良好，充分显示了 p s b 法优于一般活性污泥法、具有重要开发利用价值等特点。据报道“，韩 国在日本微生物资源研究所的协助下，在大邱市酒精厂建成日处理6 0 0 吨、 b o d 高达2 3 万m g l 的大型处理场，1 9 8 1 年投入运转。近年来，澳大利 亚、美国等也相继进行了这方面的研究工作嘲。 我国从5 0 年代就对p s b 进行了基础理论研究，但应用研究起步较晚。 8 0 年代，中国科学院有关单位及华东师范大学、上海交通大学、山西大学和 太原工业大学等部分高校先后开展p s b 处理高浓度有机废水的试验研究。浙 江省轻工研究所应用p s b 处理高浓度合成脂肪酸废水；辽宁环保研究所应用 p s b 处理肉类废水；上海交通大学生物技术研究所利用光合细菌对豆制品、 洗毛、牛粪屎等废水进行处理，通过了小试技术鉴定，并在小林正泰帮助下 与南通发酵厂合作，用p s b 法成功地进行日处理1 5 0 吨柠檬酸废水的研究， 取得了中试成果。机电部北方设计研究院环保所饶汉东等利用p s b 处理柠檬 酸有机废水的研究实验表明，原废水中c o d 。和b o d 。的总去除率达9 8 以上。 太原工业大学刘建荣等哪! 利用p s b 活性污泥法处理含酚废水的研究表明将光 合细菌固定于污泥上经驯化培养后，在好氧条件下处理含酚废水，可明显地 浙江大学硕士学位论文第一章绪言 提高去酚能力，并可减少菌体流失，耐冲击力强，对温度、p h 值适应范围广， 是一种有效的处理含酚废水的新途径。以往p s b 处理工艺大多采用悬浮生长 型的活性污泥法，虽然能有效地处理有机废水，但还没有充分发挥p s b 降解 有机物的最大潜力。现有报道应用固定化细胞技术和固定生物膜( p s b ) 法 处理某些有机废水。吴国庆等研究利用海藻酸钠包埋固定的p s b 细胞来处 理印染废水，史家梁等“”应用两级p s b 生物接触氧化工艺处理豆制品废水发 现具有优越性。p s b 工艺除能降解、去除有机物外，还能参加脱氮脱硫过程。 有文献报道，用p s b 活性污泥处理豆制品废水时，当进水总氮为5 2 2 6m g l 时，经三级p s b 处理，出水总氮降为1 7 4 1m g l ，去除率为6 6 7 。 徐向阳等”总结了光合细菌处理工艺的不足之处：( 1 ) 保持p s b 反应槽内 光合细菌的优势问题仍未得到解决。现有处理场均采用p s b 返送回流进行厌 氧光照培养技术，快速富集光台细菌，抑制其它异养细菌的生长。但对光合 细菌反应槽的光合细菌计数表明，p s b 数目比异养细菌数目少一个数量级。 因此目前采用的技术有待进一步研究与改进。( 2 ) 光合细菌处理工艺能有效 地处理高浓度废水，但出水的浓度仍然很高，需进一步处理才能达标。这种 后处理措施的研究，目前还不深入。同时，设置后处理增加了整个处理系统 的复杂性与费用。( 3 ) 缺乏与光合细菌处理工艺有关的工艺设计参数，也没 有做过系统研究，给处理工艺的高效运行管理增加了难度。尽管如此，p s b 处理工艺仍然是一种经济、可行、有效的高浓度有机废水处理技术。 i 6 本论文研究内容 本研究利用实验室采集、保存的光合细菌菌株资源，筛选、选育高产a l a 菌株，探明影响a l a 形成的影响因子及培养方法，探索光合细菌利用有机 废水产生越a 的技术可行性。具体内容为： 1 产a 工a 的光合细菌菌株筛选、高产菌株的选育 塑垩盔堂堡主兰箜垒塞 蔓二童堕童 2 基质( c 源、n 源) 类型与操作方式、光照强度、p h 、培养时间对 a l a 形成的影响 3 乙酰丙酸、琥珀酸、甘氨酸对a l a 产量的影响 4 光合细菌利用味精废水产生虬a 的操作条件探索 5 光合细菌利用多种工业有机废水产生越a 研究 拟采用的技术路线： 有机废水 新旺大学硕士学位论文 第二章产a l a 菌株的选育及其特性 第二章产a l a 菌株的选育及其特性 2 1 材料与方法 2 1 1 菌种 本实验室保藏的3 6 株光