（环境工程专业论文）利用pcrdgge研究膜生物反应器中微生物的群落结构.pdf

中文摘要 微生物对膜生物反应器等污水处理工艺系统中的主体污染物的降解起着决 定性的作用，只有充分认识系统内的微牛物群落结构及其功能，才能为改进或优 化处理工艺、运行参数和提高污水处理效率提供依据。但是目前污水系统中微生 物群落的研究仍以培养分离等传统技术为主，而它们已经无法满足对微生物进行 快速、全面、准确的分析和鉴定的要求。本课题利用p c r - d g g e 分子生物学技术 和系统发育分析等方法，对膜生物反应器中的微生物的群落结构和功能进行研 究，并对反应器内的微生物进行分析鉴定。 利用p c r - d g g e 分子生物学技术研究m b r 反应器培养驯化整个过程中微生 物的群落结构及演替规律。在新的m b r 环境中，接种的传统活性污泥中的微生 物群落在几天内发生了较大的变化，在进污水驯化时，微生物群落遭受了冲击， 最后经过培养驯化逐渐趋于稳定，一些菌种逐渐成长为顶级优势微生物，在反应 器内占据主导地位。最终该反应器形成了自己独有的微生物群落生态系统。另外， 对该反应器的部分优势菌种进行了克隆测序和系统发育分析，通过鉴定获得1 0 条总细菌的1 6 sr d n a 序列，它们分别与气单胞菌属似e r o m o n a s ) 、假单胞菌 ( p s e u d o m o n a s ) 、亚硝酸菌属( n i t r o s o m a s ) 、丛毛单胞菌属( c o m a m o n a s ) 和杆菌 ( b a c i l l u s ) 的同源性在9 7 以上。这些优势微生物在m b r 反应器去除有机物的过程 中起到了关键的作用。 另外研究了不同的膜生物反应器的微生物群落结构的异同。不同的环境条 件、进水水质及运行参数导致了不同膜生物反应器微生物群落的差异。通过巢式 p c r d g g e 技术并利用特殊的引物，研究发现m b r 反应器中存在比较丰富的硝 酸菌和反硝化菌，对这些微生物的群落结构情况进行了分析。通过克隆测序鉴定 了部分硝化菌，鉴定出m b r 反应器内的5 种硝酸菌和3 种反硝化菌，并发现反 应器内存在好氧反硝化菌，说明m b r 反应器内存在好氧反硝化现象。这些硝化 菌在m b r 反应器的脱氮过程中起着关键的作用。 关键词：膜生物反应器 16 sr d n a 聚合酶链式反应一变性梯度凝胶电泳微 生物群落结构微生物多样性克隆测序硝化细菌 a b s t r a c t m i c r o o r g a n i s mp l a y sad e c i s i v er o l ei nt h ep r o c e s so fd e g r a d a t i o no f t h em a m p o l l u t a n t si nt h em e m b r a n eb i o r e a c t o ra n do t h e rb i o l o g i c a l w a s t e w a t e rt r c a t l l l e n t s y s t e m s i no r d e rt oi m p r o v eo ro p t i m i z et h et r e a t m e n ts y s t e m , o p e r a t i n gp a r a m 盱， a n di m p r o v et h ee f f e c to fw a s t e w a t e rt r e a t m e n t u n d e r s t a n d i n g t h e 如d c r o b l a l c o m m u n i t ys t r u c t u r ea n df u n c t i o na r ev e r yi m p o r t a n t h o w e v e r - t e c h n o l o g i e s f o rt n e r e s e a r c ho fw a s t e w a t e rt r e a t m e n t sm i c r o b i a lc o m m u n i t ym a i n l y a r et r a d i t i o n a l t e c h i l i q u e sb a s e do nc u l t u r ea n ds e p a r a t i o n , a n d i tc o u l dn o ts a t i s f yn o w a d a y st h e r e s e a f c ho f1 1 1 i c r o b i a lc o m m u n i t yw h i c hr e q u i r e sa n a l y s i s a n di d e n t i f i c a t i o nm o r e r a p i d ，c o m p r e h e n s i v ea n de x a c t l y t h i si s s u eu s i n gp c r - d g g em o l e c u l a rb i o l o g y t e c l l i l i q u ea n dt h em e t h o do fp h y l o g e n e t i c a n a l y s i st o r e s e a r c ht h e 删c r o b l a l c o i n i i l u n i t vs t n l c t l h e a n df u n c t i o no fm e m b r a n eb i o r e a c t o r ， a n di d e n t i f yt h e m i c r o o r g a n i s mo f t h er e a c t o r u s i i l g m o l e c u l a rb i o l o g yt e c h n i q u eo fp c r d g g et o r e s e a r c hm i c r o b i a l c o n l m u n i t ys t r u c t u r ea n ds u c c e s s i o ni nt h ec u l t i v a t i o na n dd o m e s t i c a t i o n p r o c e s so i m b r t h em i c r o b i a lc o m m u n i t yo ft r a d i t i o n a la c t i v a t e ds l u d g ew h i c hi si n o c u l a t e d h a dal a r g ec h a n g ei naf e wd a y si nt h en e wm b r se n v i r o n m e n t ，a n di t a l s oc a u s c ( ia i m p a c tt om i c r o b i a lc o m m u n i t yw h e nu s i n g w a s t e w a t e rt od o m e s t i c a t e f i n a l l yi tt e n d t 0s t a b l ea f t e rd o m e s t i c a t i o n , s o m eb a c t e r i a sg r a d u a l l yg r o w e d t ob ed o m i n a n ts p e c m s ， a n da r ed o m j n a t e di nt h er e a c t o r u l t i m a t e l yt h er e a c t o rf o r m e d i t so w nu m q u e m i c r o b i a lc o m m u n i t ye c o s y s t e m m o r e o v e r ，p a r to fr e a c t o r sd o m i n a n tb a c t e r i a sa r e c l o 血g ，s e q u e n c i n ga n dp h y l o g e n e t i ca n a l y s i s i n g ，f i n a l l y o b t a i nt e nb a c t e r i a l16 s r d n as e q u e n c e st h r o u g hi d e n t i f i c a t i n g ，t h eh o m o l o g yo ft h e s eb a c t e r i a sc a m p a r e d w i t h4 e r o ，n d n ( 狐，p s e u d o m o n a s ，n i t r o s o m a s ，c o m a m o n a s a n db a c i l l u sa r eg r e a t e r t h a n9 7 t h e s ed o m i n a n tm i c r o o r g a n i s m sp l a y e dk e yr o l e s mt h ep r o c e s so f r e m o v a l i n go r g a n i cp o l l u t a n t si nm b r i na d d “i o n t 1 1 es i m i l a r i t ya n dd i f f e r e n c e o fm i c r o b i a lc o m m u m t ys t r u c t u r e b e t w e e nd i f f e r e n tm b r sa r es t u d i e d d i f f e r e n te n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n , w a t e r q u a h t y 锄do p e r a t i n gp a r a m e t e rr e s u l t e d i nd i f f e r e n c eo fm i c r o b i a lc o m m u n i t yb e t w e e n d i 脓e n tm b r s t h r o u g hn e s t e dp c r d g g ea n du s i n gs p e c i a lp r i m e r s i ti st o u n d t h a tm e r ea r e 而c hn i t r o b a c t e r i a sa n dd e n i t r i f m a t i o nb a c t e r i a si nm b r s ，t h em i c r o b i a l c o n 皿u n i t vs t r u c t u r eo ft h e s eb a c t e r i a s w e r ea n a 岍e d t h r o u g hc l o n i n ga n d s e q u e n c i n 岛f i v ek i n d so fn i t r o b a c t e r i a sa n dt h r e ek i n d s o fd e n i t r i f i c a t i o nb a c t e r i a sa r e i d e n t i f i e d , a n di ti sf o u n dt h a tt h ee x i s t e n c eo fa e r o b i cd e n i t r i f i c a t i o nb a c t e r i ai n m b r s ，i ti si n d i c a t e dt h ee x i s t e n c eo ft h ep h e n o m e n o no fa e r o b i cd e n i t r i f i c a t i o ni n m b r s t h e s en i t r i f y i n gb a c t e r i a sp l a yk e yr o l e si nd e n i t r i f y i n gp r o c e s si nm b r s k e yw o r d s ：m e m b r a n eb i o r e a c t o r , 16 sr d n a , p c r d g g e ，m i c r o b i a l c o m m u n i t ys t r u c t u r e ，m i c r o b i a ld i v e r s i t y , c l o n ea n ds e q u e n c e ，n i t r i f y i n gb a c t e r i a 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得丞洼太堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 签字日期：汐。甲年占月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解云洼太堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权云洼太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 导师签名 签字日期：乙斫年月力日 签字日 年彦月2 日 第一章绪论 1 1 课题研究的背景及意义 第一章绪论帚一早三；百t 匕 膜生物反应器( m e m b r a n eb i o r e a c t o r ，简称m b r ) 是近年来发展起来的一种高 效污水处理技术，它是膜技术与传统活性污泥处理技术相结合的污水处理工艺， 它能将绝大部分微生物截留在反应器中，使反应器中的污泥浓度很高，微生物种 类比较丰富，不但能有效去除有机物，还能较好地去除氨氮和其它较难降解的物 厨。同常规好氧生物处理法相比具有污泥浓度高、泥龄长、容积负荷高、出水 水质好及占地面积小等优点【2 3 】。目前，膜生物反应器已被成功地应用在生活污 水、工业废水及饮用水的处理中【4 j 。 m b r 在国内的研究仅十余年，首先从分离式m b r 开始，9 0 年代初，岑运华 介绍了m b r 在日本的研究状况，随后天津大学、清华大学、中科院等院校和研 究院相继对m b r 污水处理工艺进行了较多的研究，并取得丰富的成果。特别是 近年来，国内外越来越多的单位致力于膜生物反应器的研究，研究内容包括膜污 染形成机理与控制、膜材质和膜组件、活性污泥混合液特性、运行参数摸索、数 学模型描述及不同生物处理单元的组合等多个方面。 m b r 的处理对象从生活污水到高浓度有机废水( 食品废水、啤酒废水、畜禽 场废水、粪污废水) 以及难降解工业废水( 石化废水、印染废水) ，目前己有一定 规模的工程应用实例。总体来看，m b r 在我国南方地区以处理高浓度有机污染 物、难降解工业废水为主，北方缺水地区以污水同用为主。但是，膜污染依然是 影响膜生物反应器运行稳定性和经济性的一个关键因素【5 j 。 国内外对膜生物反应器中活性污泥混合液性质方面的研究大多还只是集中 在对污泥的各种理化性质，如污泥沉降性、污泥可滤性、e p s 、s m p 、蛋白质、 多糖、腐殖质、污泥颗粒粒径分布等方- 卣【缸8 1 。但对反应器中微生物的群落结构、 生理状态及其功能等方面的研究甚少，而微生物对大多数污水处理工艺中污染物 的降解起着决定性的作用。特别是对于膜生物反应器这样一个封闭式的环境，微 生物基本全部被截留在反应器内，生长环境与传统活性污泥工艺有着较大的区 别，微生物的群落结构及演替，微生物活性情况，反应器中优势微生物的利，类， 这些问题都是未知的，而又鉴于微生物在膜生物反应器中的重要作用，因此膜生 物反应器中微生物的群落结构、数量以及多样性的分析对于研究m b r 的反应机 第一章绪论 理、污染物降解和转化途径具有非常重要的学术价值，同时可为优化工艺运行条 件，提高污染物处理效率和减缓膜污染提供理论依据。 传统上的微生物的分类和鉴定主要是根据微生物的个体形态、培养特征和生 理生化等特征，运用平板计数法、镜检法等进行环境生物学的研究，但是存在着 很多不足 9 , 1 0 1 ：环境中只有极少部分的微生物可用于培养( 只占环境微生物总数 的0 1 1 0 ) ，而污水、污泥中的特殊微生物群落不一定能用培养的方法进行分 析；传统方法所获取的样品很难具有时间和空间上的代表性，因而不能实时、 有效的揭示环境中微生物的总体信息；当特定的微生物种群不具有竞争性且相 关的结构基因未被诱导出来时，传统方法就不能检测微生物群体的降解能力； 传统方法难于获得微生物群落结构和空间分布的有关信息。而且培养分离周期一 般较长、工作量大l 。因此，传统的培养技术不适用于m b r 中微生物群落组成 和结构的分析。 而应用p c r d g g e 方法对环境微生物进行研究，可以不经过培养，直接从环 境样品中提取细菌的d n a 或r n a ，进行p c r d g g e 。这一技术所分析出的微生 物群落结构及多样性使我们能够快速、准确地鉴定各种环境中的微生物个体，并 进行复杂微生物群落结构演替规律、微生物种群动态性、重要基因定位、表达的 评价及鉴定分析。在实际工程中，可根据由此技术所测得的不同环境中的微生物 群落结构和优势菌群的特性来调节工艺参数，可提高污水处理效率。目前，将分 子生物学技术应用于环境领域的研究已成为国内外研究的热点。 1 2 国内外研究现状与发展动态 1 2 1 用于环境微生物的分子生物学技术 污水处理厂中的活性污泥是由数量庞大，种类丰富的微生物构成的絮凝结 构，是污水处理过程的主要载体，微生物对污水工艺中有机物的降解起着决定性 的作用，研究活性污泥微生物群落，了解其微生物种类和数量，认识微生物群落 的稳定性和研究一些特定的功能菌在降解有机物过程中的作用，对提高活性污泥 处理污水的效果具有重要意义。 由于传统的培养技术在研究环境工程微生物的多样性和动力学等方面存在 着严重的局限性。使得现在对于污水处理工艺中微生物与处理效果关系性的研究 仍处于“黑盒子”阶段。而近年发展起来的分子生物学技术很好地解决了这一问 题，包括聚合酶链式反应( p c r ) 、温度梯度凝胶电泳分析( d g g e ) 、1 6 sr r n a 序 列分析技术分析技术、呼吸链分析技术和核酸杂交分析技术等在内的微生物分子 2 第一章绪论 生物学方法。该技术可以通过直接从环境样品中提取微生物d n a 或直接在原位 对微生物进行研究，而不需要对微生物进行分离培养，因而能够动态研究微生物 群落的多样性，能够真实地反应微生物的存在状态，因此，近年来越来越多的研 究者开始应用分子生物学技术对环境微生物进行研究，尤其是对污水处理系统中 的微生物多样性和功能微生物群落进行研究，并且取得了一些成果，为相关领域 的环境微生物研究打下了一定的基础，并使污水生物处理系统的微生物群落研究 及其在工程上的应用拥有了先进的科学手段 1 2 , 1 3 。 迄今，在国内外，基于1 6 sr d n a r n a 的分子生物学技术在污水处理、生物 修复等环境污染治理领域已有广泛的应用研究 1 4 - 1 6 】。就目前所进行的研究来看， 用于微生物群落结构的分子生物学分析技术主要有： ( 1 ) 基于p c r 扩增的遗传指纹技术( g e n e t i cf i n g e rp r i n t i n g ) ，用于群落结构分 析的指纹图谱技术中，最常用有变性温度梯度凝胶电泳( d g g e 厂r g g e ) 1 7 - 1 9 ，单 链构象多态性( s s c p ) 1 2 0 ，末端限制性片段长度多态性分析( t r f l p ) 2 1 - 2 3 等d n a 指纹图谱，它们可以把环境样品进行p c r 扩增得到的微生物群落中所有种群的 1 6 sr d n a 片段以指纹图谱的形式展现出来，理论上指纹图谱中每二条带都代表 了群落中的一种微生物，而条带的亮度可以与群落中该微生物的多度( a b u n d a n c e ) 相对应。 d g g e f f g g e 是目前微生物分子生态学中应用最为广泛的技术之一，它的基 本原理是长度相同但是序列不同的1 6 sr d n a 片段( 代表着不同的微生物种类) 解 链时需要不同的变性剂浓度或者温度，所以在变性温度梯度凝胶上有着不同的 迁移位置，这样d g g e t g g e 就能够把p c r 产物中不同的1 6 sr d n a 片段沿着变性 剂或者温度梯度分离，形成能够代表微生物群落组成的指纹图谱。以 d g g e t g g e 为代表的指纹图谱可以同时快速地对多个环境样品的微生物群落 结构进行比较分析，因此可对环境中微生物群落的变化进行长期监控。同时，通 过对环境中微生物群落的监控，可以找到与系统功能密切相关的d g g e 或者 t g g e 条带，再通过条带测序就可以知道该条带所代表的微生物种群。 另外随机扩增多态性d n a ( r a p d ) 也是一种基于p c r 扩增的微生物群落分 析方法，它是用基因组扩增出来的片段作为群落中不同微生物种群的特征序列。 这些不同基因组上扩增得到的片段长度不同，通过聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖电泳 分离，所得到的指纹图谱可以分析微生物群落的结构状况。w i k s t r o m 等【2 4 】将 r a p d 技术与主成分分析( p c a ) 结合起来研究相同接种但是不同培养基的摇瓶培 养下，微生物群落结构的差异并探讨了在一个生物反应器中微生物群落随着时间 的动态变化情况。 ( 2 ) 分子杂交技术( m o l e c u l a rh y b r i d i z a t i o n ) ，用己知的标记序列作为探针， 第一章绪论 可以检测微生物群落样品中特定的微生物种类存在状况及其种群水平的高低。根 据被测定的对象，分子杂交基本可分为以下两类：( 至) s o u t h e r n 杂交：d n a 片段 经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。 n o r t h e r n 杂交：r n a 片段经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然 后用探针杂交。另外根据杂交所用方法的不同，还有斑点( d o t ) 杂交、狭槽( s l o t ) 杂交和菌落原位杂交等。 ( 3 ) 克隆文库分析法( c l o n el i b r a r yp r o f i l i n g ) ，通过1 6 sr d n a 克隆建库的方 法可以对环境样品的微生物群落结构进行更为详尽的分析。1 6 sr d n a 克隆文库 中的每一个克隆都代表了环境中的某一类微生物种群，克隆经过测序和比对，就 可以知道该克隆所代表微生物的系统发育地位。文库经过测序以后，相同或相近 的克隆可以划分为一个操作分类单元( o t u ) ，这样理论上不同o t u 代表了环境中 微生物群落中不同的种群并且o t u 的克隆比例代表了种群在群落中的多度，所以 整个文库的测序分析结果反映了群落中微生物的组成。1 9 9 0 年，g i o v a n n o n i 掣2 5 】 首先用这一方法分析马尾藻海面浮游微生物的多样性，目前这一方法己经广泛运 用于包括土壤、海洋、湖泊、肠道等在内的多种微生物系统的多样性调查，并且 揭示了环境中前所未知的微生物多样性f 2 睨引。与d g g e t g g e 为代表的指纹图谱 技术相比，1 6 sr d n a 克隆建库技术比较耗时、耗力且成本高，但是能够提供环 境中微生物群落构成的确切信息。 1 2 2 微生物学研究进展 生物进化和生命系统发育学一直是人们所关注的热点，也是生命科学的中 心。w o e s e 在1 9 8 7 年将细菌域中可培养的细菌分为1 1 个类群【2 9 】，包括：栖热袍菌 目( t h e r m o t o g a ) ；绿色非硫细菌( g r e e nn o n - s u r f u lb a c t e r i a ) ；奇异球菌 ( d e i n o c o c c i ) ；螺旋体群( s p i r o c h e t e s ) ；绿色硫细菌( g r e e ns u l f u 厂b a c t e r i a ) ；拟杆 细菌黄质菌属( b a c t e r o i d e s f l a v o b a c t e r i a ) ：浮霉状菌( p l a n c t o m y c e s ) ；衣原体菌 ( c h l a m y d i a e ) ；革兰氏阳性细菌群( g r a mp o s i t i v eb a c t e r i a ) ；蓝细菌( c y a n o b a c t e r i a ) ；紫细菌( p u r p l eb a c t e r i a ) 。19 9 8 年n r p a c e 等根据环境中的16 sr r n a 序列的多样性，认为细菌域可能由3 6 或4 0 多个大纲组成【3 0 】，其中可培养的细菌群 又增加了热脱硫杆菌属( t h e r m o d e s u l f o b a c t e r i u m ) 、粪热杆菌属( c o p r o t h e r m o b a c t e r ) 、网团菌属( d i c t y o g l o m u s ) 、疣微菌属( v e r r u c o m i c r o b i a ) 、硝化螺菌属 ( n i t r o s p i r a ) 、酸杆菌属( a c i d o b a c t e r i u m ) 及互养菌属( s y n e r g i s t e s ) 。 本课题所研究的微生物种群涉及到总细菌( b a c t e r i a ) ( 包括真细菌和古细 菌) 、亚硝酸菌( n i t r o s o b a c t e r i a ) 、硝酸菌( n i t r o b a c t e r i a ) 、反硝化细菌 ( d e n i t r i f i c a t i o nb a c t e r i a ) 。 4 第一章绪论 广义的细菌指一大类细胞核无核膜包裹，只存在称作拟核区的裸露d n a 的 原始单细胞生物，包括真细菌( e u b a c t e r i a ) 和古细菌( a r c h a e o b a c t e r i a ) 两大类群。 其中除少数属古细菌外，多数的原核生物都是真细菌。可粗分为6 种类型，即细 菌( 狭义) 、放线菌、螺旋体、支原体、立克次氏体和衣原体。人们通常所说的即 为狭义的细菌，狭义的细菌为原核微生物的一类，是一类形状细短，结构简单， 多以二分裂方式进行繁殖的原核生物，是在自然界分布最广、个体数量最多的有 机体，是大自然物质循环的主要参与者，也是污水处理工艺中有机物降解的主体。 古细菌是一类很特殊的细菌，多生活在极端的生态环境中。具有原核生物的 某些特征，如无核膜及内膜系统，也有真核生物的特征，此外还具有既不同于原 核细胞也不同于真核细胞的特征，如：细胞膜中的脂类足不可皂化的；细胞壁不 含肽聚糖。从r r n a 进化树上，古细菌分为两类，泉古菌( c r e n a r c h a e o t a ) 和广古 菌( e u r y a r c h a e o t a ) 。另外未确定的两类分别由某些环境样品和2 0 0 2 年由k a r l s t e t t e r 发现的奇特的物种纳古菌( n a n o a r c h a e u me q u i t a n s ) 构成。 硝化作用( n i t r i f i c a t i o n ) 是将氮氧化成亚硝酸盐，再氧化成硝酸盐的过程。前 者主要是由自养性的亚硝酸菌( 氨氧化菌) 完成，后者是由硝酸菌( 亚硝酸盐氧化 菌) 完成。由于基质上的联系，人们把亚硝酸菌和硝酸菌把它们归入同一个科一 硝化杆菌科。但从进化谱系上看，它们之间的亲缘关系并不密切。 亚硝酸菌和硝酸菌的特性大致相似，大都为好氧白养菌，只有在溶解氧充足 的条件下才能生长。当硝酸菌受到抑制的时候，有可能出现n 0 2 - 积累的情况。亚 硝酸菌和硝酸菌在有氧的条件下能合成细胞。由于硝化细菌是自养细菌，世代周 期长，冈此增殖速度非常缓慢。和异养型细菌的m 。和越相比，硝化细菌增殖的 动力学参数眦。和局一般小一个数量级以上。有研究表明在稳定状态下，比起n h 4 + 氧化为n 0 2 - 来说，n 0 2 转化为n 0 3 一的速度很快，因此硝化反应过程中一般n 0 2 一 很少积累，而亚硝酸细菌转化n h 4 + 为n 0 2 步骤是限速步骤。 亚硝酸菌( 氨氧化菌) 是革兰氏阴性细菌，早期的有关研究主要是借助分离培 养，并根据细胞形态以及细胞膜的排列方式对亚硝酸菌进行菌种分类。共有1 6 株亚硝酸菌分布在5 个属中：亚硝化单胞菌属( n i t r o s o m o n a s ) 、亚硝化球菌属 ( n i t r o s o c o c c u s ) 、亚硝化螺菌属( n i t r o s o s p i r a ) 、亚硝化弧菌属( n i t r o s o v i b r i o ) 、 以及亚硝化叶菌属( n i t r o s o l o b u s ) p 1 | 。近年来通过对1 6 sr d n a 基因序列的比较， 将自养性亚硝酸菌分为两大类：一类是自养性亚硝酸菌主要成员，属于伊变形菌 亚纲( f l - p r o t e o b a c t e r i a ) ，主要由亚硝化单胞菌群( n i t r o s o m o n a s ) 和亚硝化螺荫群 ( n i t r o s o s p i r a ) 2 个分枝组成【3 2 】。在伯杰氏系统细菌学手册【3 3 】，将这些亚硝酸 细菌合并归入亚硝化单胞菌目( n i t r o s o m o n a d a l e s ) ，亚硝化单胞菌科 ( n i t r o s o m o n a d a c e a e ) ，亚硝化单胞菌属( n i t r o s o m o n a s ) 和亚硝化螺菌属 第一章绪论 ( n i t r o s o s p i r a ) 。另有少数亚硝酸菌在) ，变形菌亚纲( y - p r o t e o b a c t e r i a ) 中单独形成 一个谱系分枝一亚硝化球菌属( n i t r o s o c o c c u s ) 【3 4 1 ，它们广泛存在于海洋或半咸水 环境 3 5 , 3 6 。除了自养性亚硝酸菌外，有些异养性细菌，如产碱菌属( a l c a l i g e n e s ) 和节杆菌属( a r t h r o b a c t e r ) ，以及真菌如曲霉菌属( a s p e r g i l l u s ) ，也具有一定的硝化 作用1 3 7 】。相对于自养性的硝化菌而言，异养性菌种虽有较低的分解速率，但由于 它在环境中的数量往往大于自养性细菌，而且有些异养性菌种可同时进行硝化和 反硝化作用，因此也是硝化作用中不可或缺的一个群体 3 8 1 。 硝酸菌( 亚硝酸盐氧化菌) 完成硝化作用的第二步，它是由进化上截然不同的 4 类菌构成：a 变形菌亚纲( a - p r o t e o b a c t e r i a ) 的根瘤菌目( r h i z o b i a l e s ) 、慢生根 瘤菌科( b r a d y r h i z o b i a c e a e ) 、硝酸菌属( n i t r o b a c t e r ) ；】，变形菌亚纲( 7 - p r o t e o b a c t e r i a ) 的着色菌目( c h r o m a t i a l e s ) 、外硫红螺旋菌科( e c t o t h i o r h o d o s p i r a c e a e ) 、 硝化球菌属( n i t r o c o c c u s ) ；函变形菌亚纲( 占- p r o t e o b a c t e r i a ) 的脱硫杆菌目 ( d e s u l f o b a c t e r a l e s ) 、脱硫盒菌科( d e s u l f o a r c u l a c e a e ) 、硝化刺菌属 ( n i t r o s p i n a ) 【3 川；另外一个独立的门一硝化螺旋菌门( n i t r o s p i r a ) 、硝化螺旋菌纲 ( n i t r o s p i r a ) 、硝化螺旋菌科( n i t r o s p i r a c e a e ) 、硝化螺旋菌属( n i t r o s p i r a ) 1 4 们。 生物反硝化过程是指将硝酸盐( n 0 3 - ) 和亚硝酸盐科0 2 ) 还原成氮气的生物反 应过程，能够进行反硝化作用的细菌称为反硝化细菌。从微生物学的角度看，反 硝化反应是反硝化细菌的厌氧代谢过程，n 0 3 - 是电子受体，n 2 是代谢产物，同时 还需要有机物作为电子供体。反硝化反应实质上是一个n 0 3 或n 0 2 - 的生物还原过 程，即是通常所说的生物脱氮。反硝化菌是异养细菌，因此其比增长速率比硝化 茵大得多，一般与好氧异养菌的比增长速率相近。反硝化反应的饱和常数鼠很小， 约为0 1 m g i 加2 m g l ，因l l a n 0 3 浓度对反硝化速率几乎没有影响，当反硝化过 程有机碳源充足时，反硝化速率与n 0 3 - 的浓度早零级反应。生物反硝化过程的主 要影响因素包括碳源、温度、p h 值和溶解氧等。 关于反硝化途径的研究目前已成热点，包括传统的硝化一反硝化、好氧反硝 化、短程反硝化、厌氧氨氧化一反硝化。与硝化细菌不同，反硝化细菌在分类学 上没有专门的类群，它们分散于原核生物的众多属中。这些包含反硝化细菌的属 绝大多数分布于细菌界，少数分布于古细菌界。其中主要由两个类群的微生物： 一群是好氧反硝化菌，如铜绿假单胞菌( p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ) 、反硝化小球 菌( m i c r o c o c c u sd e m t r i f i c a n s ) 等；第二群为前行厌氧反硝化菌，如地衣芽胞杆菌 ( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ) 和蜡状芽孢杆菌( b a c i l l u sc e r e u s ) 、脱氮假单胞菌 ( p s e u d o m o n a sd e n i t r i f i c a n s ) 和施式假单胞菌( p s e u d o m o n a ss t u t z e r i ) 等。个别自养 菌也能将n 0 3 - 还原为分子氮，如脱氮硫杆菌( t h i o b a c i l l u sd e n i t r i f i c a n s ) ，此菌可 以用硫作为能源物质。 6 第一章绪论 1 2 3 国内外p c r d g g e 技术在环境微生物领域的应用 自从1 9 9 3 年m u y z e r 首次将p c r d g g e 技术用于微生物生态学的研究以来，这 项技术已经广泛的应用于环境微生物领域的各个方面，在活性污泥、生物膜、土 壤、底泥等环境样品中的微生物多样性检测、微生物鉴定、微生物变异以及群落 演替等方面的研究发挥了重要作用。 ( 1 ) 国外方面应用进展 m u y z e r ”】首次应用d g g e 研究了菌藻席和细菌生物膜中微生物的遗传多样 性。在得至t j d g g e 条带后，将其印迹转移到尼龙膜上与硫还原细菌特异性探针进 行杂交，其中一样品的带谱出现了强烈的杂交信号，表明该环境中存在硫还原细 菌。 1 9 9 8 年，s t e p h e n 等【4 1 】用变性梯度凝胶电泳结合s o u t h e r n 杂交的方法研究了土 壤p h 值对a o b 种群结构的影响，使d g g e 在快速分析环境样品a o b 种群结构动 态变化得到了充分的应用。 p r i n c i c 等【4 2 】研究了污水处理厂硝化系统反应器中n h 3 浓度、p h 值和0 2 浓度对 硝化细菌活性的影响。结果表明，高浓度n h 3 刺激了一类亚硝化单胞菌属细菌的 生长，而极端p h 值( p h6 0 和p h8 2 ) ，从某种程度上筛选了另一类种群，但其它 条件未见种群结构发生明显变化。无论是高n i - h + 浓度还是极端p h 值，导致硝化 细菌种群结构发生变化的时间都比较长( 7 4 d 以上) 。 m c c a i g 等f 4 3 】研究了海水养鱼池底质中卢亚群氨氧化菌群与污染之间的关系， 表明富氮的有机污染养鱼环境抑止了硝化和反硝化作用，使氮循环明显受阻； a o b 和n o b 的数量随污染程度的不同发生显著变化；污染环境对氨氧化菌的种 群起到了选择性，一些氨氧化菌和亚硝化单胞菌，仅在污染严重沉积物中检测到， 且其相对丰度受污染程度的影响，而在非污染区没有检测到。 d o n n e r 等】对动态变化的浮游变层中的群落结构的演替过程进行了追踪调 查。试验表明纤维素酶和脂酶的活性变化与不同取样点水样中细菌的1 6 sr d n a 片段p c r 扩增产物的d g g e 图谱具有高度的一致性。 s a n t e g o e d s 等【4 5 1 利用微生物传感器和p c r d g g e 技术相结合，对生物膜形成 过程中微生物种群的变化情况进行了分析。d g g e 图谱中逐渐增加的条带表明， 经过定向的生物演变交替作用，微生物的种类在生物膜中逐渐趋于丰富。 t e s k e 等【4 6 1 采用d g g e 法分析了硫酸盐还原菌在时空分布的变化。利用寡核 苷酸探针与d g g e 产物的杂交，表明硫酸盐还原菌可在缺氧和微好氧条件下存 活。 r o w a n 4 7 】采用生物滴滤反应器和生物滤池处理同样的废水，运用d g g e 研究 不同反应器中的氨氧化菌群落的组成。研究发现不同形式反应器或是同一反应器 7 第一章绪论 内的不同位置的氨氧化菌群落组成不同，但是主要种群是不依赖反应器的形式或 是在反应器中所处的位置不同而不同，这些主要种群在整个处理过程中起着关键 的作用。 ( 2 ) 国内方面应用进展 王峰等【4 8 1 采用p c r - d g g e 技术分析了化学生物絮凝处理工艺中总细菌群落 随时间或工艺运行条件变化的情况，通过测序鉴定了该工艺中的主要细菌种类。 研究表明，工艺条件在不同变化范围内呈现出不同的细菌群落结构变化情况，而 工艺运行在一定范围内有可能保持相对稳定。同时，不同类别菌群的结构随运行 条件变化而改变的情况也不相同，说明不同种类的细菌对于环境变化具有不同的 适应性。 史妍掣4 9 】研究了不同条件下氨氧化细菌的种群结构变化规律，分析比较了化 学生物絮凝和化学混凝过程中氨氧化细菌种群多样性的差异，并通过测序鉴定了 反应器内的主要菌种。 苏俊峰等【5 0 】利用p c r d g g e 技术分析了不同时期生物陶粒反应器细菌的群 落的演替情况。结果表明，随着进水值的逐阶降低，氨氮去除率逐步提高到 6 4 3 8 。群落结构和优势种群的数量具有时序动态性，微生物多样性与废水的处 理效果出现协同变化的规律。通过测序表明生物陶粒反应器中运行到2 l 天时优势 种群除了自养细菌，还有异养细菌。其中自养细菌为n i t r o s o s p i r a 和n i t r o b a c t e r ， 异养细菌为b a c i l l u s 、p s e u d o m o n a s 和p s e u d o c h r o b a c t r u m 。 张斌等1 5 h 研究了膜生物反应器中活性污泥的微生物多样性，研究表明不同的 膜生物反应器中既存在着共同的微生物利一属也有各自特异的种属。相同的微生物 种群在不同的反应器中的优势地位不同，各自特有的微生物群落则是由于水质的 不同经过长期演替而来。 陈岭等【5 2 】采用p c r 技术研究了硝化池中氨氧化菌的a m o a 基因的多样性，研 究表明在该污水工艺系统中，欧洲亚硝化单胞菌( n i t r o s o m o n a se u r o p a e a ) 是氨氧 化过程中起主导作用的细菌。 孙寓姣等【5 3 l 利用f i s h 等技术原位追踪了污水生物脱氮反应器颗粒污泥中硝 化细菌的空间分布情况，并用荧光实时定量p c r 对a o b 进行了定量化研究。 罗鹏等【5 4 】用p c r d g g e 技术对凡纳滨对虾咸淡水养殖系统内的细菌群落组 成进行了对比研究，发现从海湾沿海、养殖池、对虾粪便到对虾肠壁，细菌群落 的多样性由高到低，不同的环境群落的优势种都十分明显，同一环境下各样品间 的细菌群落非常相似，而不同环境样品中细菌群落组成有较大的差异。 在硝化细菌动态变化方面，张丹等【5 5 】利用d g g e 并结合f i s h 对o l a n d 生物 脱氮系统中的硝化菌群进行了1 6 sr d n a 分析，结果表明，o i 。a n d 系统中氨氧化 第一章绪论 菌和亚硝酸氧化菌随溶解氧的降低表现出了不同的种群变化规律，氨氧化菌种群 多样性受溶解氧的影响非常大，而亚硝酸氧化菌的种群多样性比较单一，且不受 溶解氧的影响，在o l a n d 限氧稳定运行后期，