（纺织工程专业论文）固定化过氧化氢酶对h2o2的催化分解.pdf

摘要 摘要 过氧化氢酶( c a t a l a s e ) 是一种广泛存在于生物组织中的氧化还原酶，它能迅速催化分 解过氧化氢为水和氧气。在纺织上主要应用于纺织品的生物除氧和氧漂废水处理方面。 对于过氧化氢酶的固定化国内外学者作了大量的研究，所用的载体也是各式各样，用途 也各不相同。而关于应用高碘酸钠氧化棉织物作为载体固定过氧化氢酶，并用于处理氧 漂废水的还尚不多见。 本文首先研究了棉织物固定过氧化氢酶的固定工艺，得出了一个最佳的固定条件。 在此基础上，对最佳条件下的固定化过氧化氢酶的性质进行了研究。主要内容包括酶的 最适温度、最适p h 值、热稳定性、操作稳定性、贮存稳定性以及一些添加助剂对酶活 力的影响，还进一步测定了固定化酶和游离酶的动力学参数。最后，对固定化过氧化氢 酶用于处理氧漂废水进行了初探。 试验结果表明：过氧化氢酶固定在氧化棉织物上，棉织物氧化的主要工艺条件为： n a l 0 4 浓度0 2 0 m o v l ，氧化时间8 h ，氧化体系p h 值6 0 ，氧化温度4 0 ；过氧化氢酶 固定化的工艺条件为：过氧化氢酶用量0 2 0 m l g 棉织物，固定化时间2 4 h ；过氧化氢酶 经固定化以后，固定化酶的最适温度比游离酶提高了约1 0 ：最适p h 与游离酶相同都 是7 0 ；固定化过氧化氢酶在一定的条件下，可以被重复使用；固定化酶的热稳定性优 于游离酶的热稳定性；固定化酶的贮存稳定性好：抑制剂对于固定化酶活力的影响比游 离酶要小；金属离子对于固定化酶的抑制作用要小于游离酶；与游离酶相比，固定化酶 的k ，卅值变大了，使酶和底物间结合的亲和力降低，而v 脚值降低了：用固定化过氧化 氢酶处理的氧漂废水染色的织物的k s 值与用新鲜水染色的非常接近，并且两者的色差 很小，摩擦牢度也相当。 关键词：过氧化氢酶：固定化；氧化棉织物；高碘酸钠；性质：氧漂废水 a b s t r a c t a b s t r a c t c a t a l a s ei sa l lo x i d o r e d u c t a s ew i d e l ye x i s t i n gi nt h eb i o l o g i c a lt i s s u e sa n dd e c o m p o s e s h y d r o g e np e r o x i d et ow a t e ra n dm o l e c u l a ro x y g e n i nt h et e x t i l ei n d u s t r y t h i se n z y m ew a s m o s t l ya p p l i e dt od e g r a d eh y d r o g e np e r o x i d ea f t e rt e x t i l eb l e a c h i n ga n dd e c o m p o s eh y d r o g e n p e r o x i d ei no x y g e nb l e a c h i n ge f f l u e n t s m a n ys c h o l a r sb o t ha th o m ea n db r o a dd i dl a r g e n u m b e r so fs t u d i e so ni m m o b i l i z a t i o no fc a t a l a s e t h e yi m m o b i l i z e dc a t a l a s eo nd i f f e r e n t t y p e so fs u p p o r t sa n dh a dd i f f e r e n tp u r p o s e s b u tt h e r ew a sa l i t t e rr e p o r t so ni m m o b i l i z a t i o n o fc a t a l a s eo nc o t t o nf a b r i co x i d i z e db ys o d i u mp e r i o d a t ea n da p p l i c a t i o no ft r e a tw i t ho x y g e n b l e a c h i n ge f f l u e n t s t h ep r o c e s s e so fc a t a l a s ei m m o b i l i z e do nc o t t o nf a b r i cw e r es t u d i e di nt h ep a p e ra n dt h e o p t i m a lc o n d i t i o no fi m m o b i l i z a t i o nw a so b t a i n e d 。o nt h i sb a s i st h ec h a r a c t e r i z a t i o n so f i m m o b i l i z e dc a t a l a s et h a tw a si m m o b i l i z e du n d e ro p t i m a lc o n d i t i o nw e r er e s e a r c h e d t h e m a i nc o n t e n t si n c l u d e dt h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ea n dp h ，t h e r m a ls t a b i l i t y ，o p t i o n a ls t a b i l i t y ， s t o r a g es t a b i l i t ya n dt h ee f f e c t so fs o m ea d d i t i v e so na c t i v i t i e so fi m m o b i l i z e da n df r e e c a t a l a s e s t h ek i n e t i cp a r a m e t e r so fi m m o b i l i z e da n df r e ec a t a l a s e sw e r ea l s od e t e r m i n e d f u r t h e ri n t h i st e x t f i n a l l y ，t h ea r t i c l eg a v ear e s e a r c ho nt r e a t m e n to fo x y g e nb l e a c h i n g e f f l u e n t sb yi m m o b i l i z e dc a t a l a s e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o ro x i d a t i o no fc o t t o nf a b r i cw e r ea s f o l l o w s ：c o n c e n t r a t i o no fs o d i u mp e r i o d a t e0 2 0 m o l l ，o x i d a t i o nt i m e8 h ，o x i d a t i o np h6 。0 a n do x i d a t i o nt e m p e r a t u r e4 0 t h eo p t i m u mi m m o b i l i z a t i o np r o c e s sw a sa sf o l l o w s ： c a t a l a s ed o s a g eo 2 0 m l gc o t t o nf a b r i c 。i m m o b i l i z a t i o nt i m e2 4 h t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r e o fi m m o b i l i z e dc a t a l a s ew a s10 h i g h e rt h a nt h a to ft h ef r e ee n z y m e b o t ht h ei m m o b i l i z e d a n df r e ee n z y m e sp r e s e n t e dt h e i ro p t i m u mp ha t7 0 u n d e rac e r t a i nc o n d i t i o n ，t h e i m m o b i l i z e dc a t a l a s ew a sr e u s a b l e t h et h e r m a la n ds t o r a g es t a b i l i t i e sa n dt h ee f f e c to fm e t a l i o n so na c t i v i t yo fi m m o b i l i z e dc a t a l a s ew e r eb e t t e rt h a nt h o s eo ff r e ec a t a l a s e c o m p a r e dt o f r e ec a t a l a s e t h ek mv a l u eo fi m m o b i l i z e dc a t a l a s ei n c r e a s e da n dt h ei m m o b i l i z e dc a t a l a s e h a dl e s sa m n i t yt o w a r ds u b s t r a t e 。a n dt h a tt h ev mv a l u eo fi m m o b i l i z e dc a t a l a s ed e c r e a s e d t h ek sv a l u eo ff a b r i cd y e db yo x y g e nb l e a c h i n ge f f l u e n t st r e a t e db yi m m o b i l i z e dc a t a l a s e w a sv e r yc l o s et ot h a to ff a b r i c d y e db y f l e s hw a t e r 刃) ed y e i n gi ni m m o b i l i z e d c a t a l a s e t r e a t e do x y g e nb l e a c h i n ge f j f l u e n t sr e s u l t e di ns m a l l e rc o l o rd i f f e r e n c ea n de q u a l r u b b i n gf a s t n e s sc o m p a r e dt ot h ed y e i n gi nf l e s hw a t e r k e y w o r d s ：c a t a l a s e ；i m m o b i l i z a t i o n ；o x i d i z e dc o t t o nf a b r i c ；s o d i u mp e r i o d a t e ； c h a r a c t e r i z a t i o n s ；o x y g e nb l e a c h i n ge f f l u e n t i l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 砸 日 期： 2 塑星：主：兰2 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 导师签名： 丘盟红 籀-p 日 翌缨爿 及气歹_ 扩 朋7 i 7 7 髀蕃t 多? 绪论 第一章绪论 1 1 过氧化氢酶 1 1 1 过氧化氢酶简介 过氧化氢酶( c a t a l a s e ) 是一种广泛存在于生物组织中的氧化还原酶，能保护细胞免受 体内代谢物的破坏。它能催化分解过氧化氢为水和氧气，是催化转化能力最高的酶之一， 一分子过氧化氢酶每分钟能催化5 0 0 万分子过氧化氢l ij 。 1 8 1 1 年t h e n a r d 首先发现过氧化氢可被动植物组织分解，产生氧气。1 8 6 3 年s c h o n b e f i n 也观察到这种现象，他认为在反应中是某种酶起到作用。1 8 9 2 年j a c o b s o n 证实在 动植物组织内有着专一分解过氧化氢的酶存在，1 9 0 1 年l o e w 将此酶命名为过氧化氢酶 ( h y d r o g e np e r o x i d a s e ) ，又称触酶( c a t a l a s e ，简称c a t ) b j 。1 9 3 6 年s t e m 证明卟啉环是过 氧化氢酶的活性中心，其后1 9 3 7 年s u u m e r 与d o u n c e 获得了牛肝过氧化氢酶的结晶【3 1 。 1 9 4 8 年发现了微生物来源的过氧化氢酶，其研究对象是藤黄微球菌( m i c r o c o c c u sl u t e u s ) 【4 】，以后相继发现了其它细菌、真菌、放线菌产生的过氧化氢酶【2 1 。过氧化氢酶还广泛 的分布于动植物组织中，哺乳动物的肝脏、红细胞、植物的叶绿体等也大量的含有此酶 【2 】 o 早期按来源不同可把过氧化氢酶划分为真核过氧化氢酶和原核过氧化氢酶【5 】。真核 过氧化氢酶主要来源于动植物组织中，其中哺乳动物组织中过氧化氢酶含量差异很大， 肝脏中含量最高，结缔组织中含量最低，在上述组织细胞内，过氧化氢酶主要存在于细 胞器1 5 j 。原核过氧化氢酶主要来源于微生物，研究发现，几乎所有需氧微生物中都存在 过氧化氢酶，但也有少数好氧茵，如过氧化醋杆菌( a p e r o x y d a s ) 不存在过氧化氢酶【5 1 。 按照不同理化特性，将过氧化氢酶划分为典型性、非典型性和过氧化氢酶过氧化物酶 ( c a t a la s e p e r o x i d a s e s ) ，通常认为这也是一种符合进化关系的划分【6 】。按催化中心结构差 异可分为两类：( 1 ) 含铁卟啉结构过氧化氢酶，又称铁卟啉酶，典型性过氧化氢酶和过氧 化氢酶过氧化物酶属于此类：( 2 ) 含锰离子替代铁的卟啉结构，又称为锰过氧化氢酶 ( m n c a t ) ，非典型性过氧化氢酶属于此类1 6 j 。 1 1 2 过氧化氢酶的结构特点、功能及作用机理 目前己知的过氧化氢酶分为两大类，绝大多数从不同机体分离出的过氧化氢酶都是 含有血红素基的，由4 个具有相同多肽链的亚基组成，每个亚基含有一个血红素辅基作 为活性位点，该辅基的形式为铁叶琳，一个分子中含有四个铁原子，其作用基团是血红 素，跨越4 个结构域，有7 0 - 4 6 0 个氨基酸残基，相对分子量一般在2 4 0 k d a 左右1 6 。 来自哺乳动物以及某些真菌和细菌的过氧化氢酶还含有4 个紧密结合的n a d p h ( 烟酰胺 腺嘌呤二核苷磷酸) 分子【7 1 。还有一类是分别从乳酸菌和嗜热生物组织中分离出的锰过氧 化氢酶( m n c a t ) ，不含有血红素基，通过电子光谱与电子自旋共振( e s r ) 谱证实m n c a t 中含有2 个紧邻的锰离子，m n c a t 的活性中心结构、催化机理都与血红素辅基的过氧 化氢酶不同 7 1 。过氧化氢酶可以被氰化合物、苯酚类、叠氮化物、过氧化氢、尿素及碱 等物质所阻抑1 7 j 。 江南大学硕士学位论文 过氧化氢酶催化分解h 2 0 2 符合诱导契合学说【扪。酶分子的构象与底物原来并非恰 当吻合，只有底物分子与酶分子相碰，可诱导后者的构象变得能与底物配合，然后才结 合成中间络合物，进而引起底物分子发生相应的化学变化。此即所谓酶作用的诱导契合 学说，其作用模式表示如图1 1 所示( 9 】： 厂壤物 侈一 e s 络合物 一过氧化氢酶 图卜1 底物与酶相互作用的“诱导契合”模式 过氧化氢酶是一种多功能酶，除了具有过氧化氢酶的活性之外，还表现出过氧化物 酶的活性。 ( 1 ) 过氧化氢酶活性：过氧化氢酶催化分解的反应概括如下：其中化合物可能是通过 与酶配位后，被氧化形成自由基的形式，自由基再与该化合物发生反应。在反应中实质 上发生了歧化反应。在需氧代谢中，不可避免地产生的还原中间物。在清除保护细胞的 酶系中，过氧化氢酶负责的分解i lj ： h 2 0 2 + c a t f e ( i i i ) 一h 2 0 + c a t f e ( i v ) = o h 2 0 2 + c a t f e ( i v ) = o h 2 0 + c a t f e ( i ) + 0 2 ( 2 ) 过氧化物酶活性：过氧化氢酶还表现出中等强度的过氧化物酶的活性，它还能够 加速与过氧化氢的反应，由光谱证明过氧化氢酶与过氧化氢反应时类似于过氧化物酶形 成三种化合物。当过氧化物酶与过氧化氢反应时，首先形成化合物，它是一种中间态的 酶底物化合态，能够进一步氧化过氧化氢，可被两种单电子还原作用恢复，首先被还 原的是反应基的位置，生成的物中具有形式上含铁基f e ( i v ) = o 中心，称为化合物i i ， 化合物i i i 是化合物i i 与过氧化氢的氧化反应形成的，它具有三价的氧化态f e ( i i ) 。化合 物i 具有很高的活性，在参加酶反应过程中不仅过氧化氢而且其他的可提供氢的物质都 能够与化合物i 反应，例如：甲酸盐、亚硝酸盐，化合物i i 比化合物i 活性低1 0 4 ，而 化合物i i i n 没有酶活性。它可以催化一些有机物的氧化，其反应式表示如下： h 2 0 2 + a h 2 一a + 2 h 2 0 如在肝脏中，可以通过这一反应把乙醇氧化。这一反应的第一步与过氧化氢酶催化 分解的反应第一步相同，化合物与被氧化的底物作用使之氧化i l 】。 1 1 3 过氧化氢酶的应用领域 自2 0 世纪8 0 年代以来，织物和纸张的生产者以及其他工业就已经开始使用过氧化 氢代替有毒的氯气来漂白和消毒产品【_ 7 1 。过氧化氢可用于消除新鲜水果和蔬菜上有害的 细菌，如沙门氏菌和大肠杆菌，还可用于消毒奶制品，为食品的纸包装如果汁盒消毒也 2 陵一 眵 绪论 不必冷藏储存等1 7 j 。在去除生产过程中剩余的过氧化氢的过程中，人们将注意力转向了 具有非常高的催化效率的生化酶一过氧化氢酶，因此过氧化氢酶在食品、医药、临床， 纺织等行业都有着广泛的用趔7 1 。虽然主要的纺织用酶制剂是一些蛋白酶和水解酶【i o ， 但过氧化氢酶等纺织预处理中使用的酶制剂的用量也在逐年升高【j 。 过氧化氢漂白工艺在染整行业推广以来，在过氧化氢大规模工业化生产的支持下， 其在染整生产中得到了稳定而快速的应用【9 l 。过氧化氢稳定性好、污染小，对设备无腐 蚀作用，适用于多种纤维及其混纺织物的漂白，且漂后织物白度高，深受印染企业欢迎 例。但如果氧漂后织物上残留过氧化氢，就会在染液中将染料反应基团氧化分解，使染 料和纤维不能产生充分有效的键合，从而产生色浅、色花，甚至色光改变i l 。因此，对 氧漂后织物上残留的过氧化氢必须充分有效地去除。 漂白后织物上的过氧化氢处理手段之一是用水清洗，但随之而来的是成本问题。另 一个处理方法是用化学法处理，但其产生的有害残余物本质上又抵消了使用过氧化氢的 环境效益憎】。最直接的处理方法是使用过氧化氢酶分解过氧化氢。 过氧化氢酶一般只能催化分解过氧化氢，对其他反应的活力很低。目前在纺织工艺 中的应用是彻底快速地去除过氧化氢漂白的残余过氧化氢，以达到纺织品的染色加工要 求。 图卜2 除过氧化氢的传统工艺与酶法工艺的流程比较 近年来，随着绿色环保意识与要求的不断加强，在染整工艺中利用酶替代多次水洗 去除织物上的过氧化氢已成为大势所趋。过氧化氢酶在棉织物前处理过程中的主要作用 江南大学硕士学位论文 是去除织物漂白残余的过氧化氢，以免给后续染色工序带来问题，不仅能节省大量的水、 电、汽的消耗，提高生产效率，还能减少废水的排放，有利于环保i 们。图1 2 是染整工 艺中除过氧化氢的传统工艺与酶法工艺的流程比较【1 2 l 。 通过比较传统工艺与酶法工艺流程，发现：在染整工艺中使用过氧化氢酶替代多次 清洗及化学还原剂去除漂白液中残留的过氧化氢，具有很大的经济优势和环保优势【l 2 1 。 1 2 酶的固定化 上世纪6 0 年代，一项新的技术一固定化酶技术开始发展起来。最初主要是将水溶 性酶与不溶性载体结合起来，成为不溶于水的酶的衍生物，称为“水不溶酶”或“固相 酶”1 1 3 】。后来发现，也可以把酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中。把酶置于超滤装置中 时，高分子底物与酶被截留在超滤膜一侧，而反应物可以透过膜流出，在这种情况下， 酶自身仍是可溶的，只不过被固定在一个很有限的空间内，因此用水不溶酶和固相酶的 名称不恰当【13 1 。1 9 9 7 年第1 届国际酶工程会议正式建议采用“固定化酶”的名称【13 1 。 酶在水溶液中一般不太稳定，并且酶只能与底物作用一次，使用起来很不方便。而 将酶固定在各种载体上使用具有重要意义：( 1 ) 当酶被固定时，可得以很快的从反应混合 物中分离，并能重复使用；( 2 ) 通过合适的控制固定化酶的微环境，可增强稳定性【1 1 。 1 2 1 酶的固定化方法 从上世纪6 0 年代起，固定化酶的研究迅速发展，固定化方法目前已超过2 0 0 种以 上i l 引。酶的固定化方法大致可分以下几类：吸附法、包埋法、共价键合法和交联法。 ( 1 ) 吸附法 经非水溶性载体物理吸附或离子结合作用使生物酶固定，称为吸附法。吸附法是最 简单、最具经济吸引力的方法，操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可以同时 达到纯化和固定化的目的，且酶失活后可重新活化再生l l l3 1 。吸附的牢固程度与溶液的 p h 值、离子强度、温度、溶剂性质和种类以及酶的浓度有关3 1 。所以为了得到最好的 吸附并保持最高的活性，控制实验条件十分重要。吸附法分为物理吸附法和离子交换吸 附法。常用的载体有无机载体、有机载体、有机大分子物质掣1 t ”】。 ( 2 ) 包埋法 包埋法是将酶包埋于凝胶或其他聚合体格子内，这种结构可以防止酶渗出，但是底 物能渗入格子内与酶相接触。此法的优点是适用范围广，许多种酶都可用此法固定，工 艺简便，酶分子仅仅是被包埋起来，固定化过程中酶未参与化学反应，故可得到活力较 高的固定化酶【l i 川。但是，用此法制成的固定化酶，不能对大分子底物的生化反应起催 化作用。包埋法分为凝胶包埋法和微囊化法( 界面聚合法、分相法、流体干燥法、流膜 法) m 3 】。 ( 3 ) 共价键结合法 共价键结合法是酶蛋白分子上功能团和固相支持物表面上的反应基团之间形成化 学共价键连接，以固定酶的方法。通常要求在低温( 0 ) 、低离子强度和生理p h 值条件 下进行，并通常加入酶的底物以防止酶的活性部位于电位表面发生键合【l 】。由于酶和载 体间连接牢固，不易发生酶脱落，有良好的稳定性及重复使用性，但因反应条件较为剧 4 绪论 烈，酶活性有所降低，且制备过程较繁琐l i l 。酶和载体的共价键合有三种方式：( 1 ) 与载 体直接反应连接：( 2 ) 通过同源双功能试剂与载体连接：( 3 ) 通过异源双功能试剂与载体 连接后再与载体反应连接川。 ( 4 ) 交联法 交联法是用多功能试剂进行酶蛋白之间的交联，是酶分子和多功能试剂之间形成共 价键，得到三向的交联网架结构，除了酶分子之间发生交联外，还存在着一定的分子内 交联【i 】。交联剂有多种，最常用的是戊二醛。其它交联剂有异氰酸衍生物、双氮联苯、 n ，n 聚甲烯双碘丙酮酰胺和n ，n 乙烯双马来酰亚胺等【1 3 】。此法的缺点是可能使酶活性 降低，很少单独使用，一般与其它方法联合使用【l 4 1 。 各种固定化方法的优缺点比较见表1 1 所示【1 3 】。 表1 1各种固定化方法的优缺点比较 t a b 1 1a d v a n t a g e sa n dd i s a s v a n t a g e so f t h ev a r i o u si m m o b i l i z a t i o nm e t h o d s 1 2 2 固定化酶的性质变化 将酶固定化制成固定化酶后，由于受到载体等的影响，酶的特性可能会有些变化【1 5 1 。 ( 1 ) 稳定性 固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好。主要表现在：( 1 ) 对热的稳定性高，可 以耐受较高的温度。( 2 ) 贮存稳定性好，可以在一定条件下贮存较长的时间。( 3 ) 对蛋白 酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解。( 4 ) 对变性剂的耐受性提高，在尿素、有机溶剂和 盐酸胍等蛋白质变性剂的作用下，仍可保留较高的酶活力等【l5 | 。 ( 2 ) 最适温度 固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能也变化不大。但有些固定化 酶的最适温度与游离酶比较会有较明显的变化。其可能会受到固定化方法和固定化载体 的影响，使用时要注意【1 5 】。 ( 3 ) 最适p h 值 酶经固定化后，其作用的最适p h 值会发生一些变化。影响固定化酶最适p h 值的 因素主要有两个，一个是载体的带电性质，另一个是酶催化反应产物的性质【1 5 j 。 ( 4 ) 底物特异性 固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物分子量的大小有 一定关系i l5 。对于那些作用于低分子底物的酶，固定化前后的底物特异性没有明显变化。 而对于那些可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶而言，固定化酶的底物特 江南大学硕士学位论文 异性往往会发生变化【i5 1 。固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起 的。酶固定在载体上以后，使大分子底物难于接近酶分子而催化速度大大降低，而分子 量较小的底物受空间位阻作用的影响较小或不受影响，故与游离酶的作用没有显著不同 u s l o 1 3 研究内容及意义 1 3 1 研究的目的和意义 从化学反应机理上看，纺织品的漂白是利用氧化剂或还原剂破坏织物上色素的一种 化学加工过程，而染色则是将有色物质施加于织物上的过程【l6 1 。因此，若将漂白浴不经 处理而直接用于染色，则残留的漂白剂会破坏染料或影响染料对织物的上染，这是漂白 废水用于染色的一个难题【l6 1 。漂白废水处理后再用于染色，则其优势在于【1 6 】：首先，与 其它加工过程相比，漂白废水含杂量低，组分相对简单。退浆、煮练已去除大量的浆料、 纤维半生物等杂质，漂白去除的杂质主要是纤维上的色素，对于成熟的棉纤维而言，这 部分的含量不足纤维重量的o 5 ；另外，漂白工作液处方中助剂的种类及用量较少， 因此，工作液的总浓度不高，这对废水的再利用是有利的。其次，对于棉针织物间歇式 生产加工，染色是漂白的下一道工序( 若不丝光) ，废水处理后便可直接用于染色。 漂白废水回收用于染色，这样可以节约用水，节约能源，合理的利用资源。而对于 过氧化氢漂白废水来说，其中含有的杂质和助剂的量在染整过程中相对较少，因而可以 将过氧化氢漂白废水处理作为染色用水，但必须要除掉过氧化氢【1 1 】。虽然过氧化氢自己 会分解，但在一定的条件下其分解的速度比较慢。在过氧化氢酶的催化下会很快的分解， 最终产生水和氧气。直接利用游离的过氧化氢酶来处理过氧化氢漂白废水，对于酶的使 用次数有一定的限制。用完一次不好回收，酶的利用率不高。而目前固定化酶技术发展 的越来越快，在各行各业中的应用也越来越广泛。因而可以利用酶固定化技术对过氧化 氢酶进行固定，这样过氧化氢酶可以重复利用，而且回收方便，只要将载体回收就可以。 并且过氧化氢酶在固定化后，其性能、作用条件和作用环境都会有一定程度的改变，可 以更好的加以利用。 1 3 2 国内外研究现状 目前，国内关于过氧化氢酶固定化的研究主要应用在制作过氧化氢生物传感器，研 究其电性能和电催化作用。还有在牛奶保鲜中用的比较多，主要是利用过氧化氢酶分解 过氧化氢时具有一定的杀菌消毒作用。而所用的固定化载体主要集中在乙基纤维素、丝 素蛋白、壳聚糖、海藻酸钙、尼龙6 等材质上【l7 - 2 1 , 国外关于固定化过氧化氢酶分解过 氧化氢方面的报道较多，研究其分解的动力学、热力学、稳定性等。c e t i n u sa n d6 z t o p 将过氧化氢酶固定在用戊二醛预处理的壳聚糖膜上，研究了固定化酶的动力学参数、热 稳定性、贮存稳定性和操作稳定性。他们还将牛肝过氧化氢酶固定在用7 , - - 醛预处理过 的壳聚糖膜上用于过氧化氢的催化分解【2 2 2 3j 。t u k e la n d a l p t e k i n 研究了用硅酸镁经戊二 醛共价交联固定化过氧化氢酶，并分析了固定化酶的特性和稳定性【2 4 】。h o r o z o v a a n d d i m c h e v a 则将过氧化氢酶固定在改良的硅酸盐中【d j 。h o r s t 等分析了以磁铁矿( f e 3 0 4 ) 为载体用戊二醛交联固定过氧化氢酶，并研究了其分解过氧化氢的活力【2 6 1 。d o m i n ka n d 6 绪论 r a y m o n d 采用了溶胶凝胶法固定过氧化氢酶并探讨了固定化酶的催化活性和重复使 用性1 27 l 。o p w i s 等则将过氧化氢酶固定在纺织纤维材质上，采用氰脲酰氯在棉织物上固 定过氧化氢酶，还研究了在尼龙6 织物上采用戊二醛交联固定过氧化氢酶1 2 引。c o s t a 等 利用无机材质氧化铝( 矾土) 经戊二醛交联固定过氧化氢酶，用于处理氧漂废水，回收并 用于染色，发现染色效果不错【2 9 , 3 0 】。可见，利用固定化过氧化氢酶处理氧漂废水用于染 色，具有一定研究价值和意义。在国内，虽然关于过氧化氢酶的报道已有很多1 1 7 训j ，但 很多不是采用吸附法就是利用戊二醛交联，吸附法容易但不能重复使用，而使用戊二醛 交联法，戊二醛对酶有严重的恶化作用，使酶的活性降低【2 2 1 。因而在固定化方面，我们 可以选用新的载体材料，寻求新的方法。长期以来，纤维素作为一种重要的化工原料， 由于来源广泛、价廉以及良好的再生性、反应性和通用性，被广泛用作载体材料【3 3 】。而 关于应用高碘酸钠氧化棉织物作为载体固定过氧化氢酶，并用于处理氧漂废水的报道还 尚不多见，且利用棉织物作为载体，回收也比用无机盐等载体要方便很多。 1 3 3 研究的主要内容 由于纤维素与高碘酸钠发生选择性氧化反应生成2 ，3 二醛基纤维素，二醛基纤维素 是纤维素衍生物的一种，具有良好的生物相容性、生物可降解性及环境友好和无毒等特 点p 。目前，关于二醛基纤维素固定化葡萄糖氧化酶、固定化血红蛋白和固定化脂肪酶 的研究已有了一定的进展，而在固定化过氧化氢酶方面尚未见报道【3 2 3 4 】。本文主要利用 棉织物与高碘酸钠发生选择性氧化反应生成的2 ，3 二醛基纤维素为载体，通过纤维素上 氧化产生的醛基与酶蛋白上的氨基发生共价交联反应，固定化过氧化氢酶。主要内容有 以下几个方面： ( 1 ) 研究了高碘酸钠氧化棉织物固定过氧化氢酶的固定工艺。 ( 2 ) 对固定化过氧化氢酶的性能和游离酶进行了比较，考察了酶的最适温度、最适 p h 值、热稳定性、操作稳定性、贮存稳定性、以及一些添加剂对酶活性的影响等。 ( 3 ) 采用了不同的处理方法对固定化酶的动力学参数进行了求解和分析。 ( 4 ) 对于固定化过氧化氢酶催化分解过氧化氢的应用进行了初探。 江南大学硕士学位论文 第二章试验材料、仪器和方法 2 1 试验材料 载体材料：1 4 5t e x 1 4 5 t e x5 2 4 2 8 4 根l o c m 纯棉平纹漂白织物。 酶：过氧化氢酶( t e r m i n o x u l t r a ) 商品酶( 活力4 0 0 0 0u m l ) ，诺维信( 中国) 生物技术 有限公司。 试验药品及试剂：高碘酸钠、3 0 过氧化氢、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠、 柠檬酸、甘氨酸、甲醇、乙醇、盐酸羟胺、百里香酚蓝、氯化钡、氯化钙、氯化铜、氯 化锌、e d t a 、硫酸镁、硫酸铝、硫酸铁、碳酸钠、氯化钠、尿素、硅酸钠、硅溶胶、 十二烷基硫酸钠、考马斯亮蓝g - 2 5 0 、磷酸均为分析纯；润湿剂j f c 、阳离子1 2 2 7 、非 硅型氧漂稳定剂1 9 7 、平平加o 、活性红k 2 b p 为工业级。 2 2 试验仪器 表2 1 试验仪器 t a b 2 - la p p a r a t u so fe x p e r i m e n t a t i o n 2 3 试验及测定方法 2 3 1 游离过氧化氢酶活力的测定方法 酶反应速度随着酶浓度的增加而成比例地升高，因此，测定反应的速度就可以知道 过氧化氢酶的含量和活性水平的高低【35 1 。过氧化氢酶活力的测定是选用紫外可见分光光 度法，即动力学方法，衡量在2 4 0 n m 处过氧化氢吸光度的减少值，从而计算出过氧化氢 酶的活力p 川。 酶活力的定义：一个过氧化氢酶单位相当于在规定条件下，于温度3 0 c ，p h = 7 0 ， 每分钟分解1 p m o l 过氧化氢所需的酶量。酶活力的单位通常用u m l 来表示。 ( 1 ) 底物溶液配制：用p h = 7 0 的磷酸盐缓冲液把0 6 0 r a lh 2 0 2 ( 3 0 ) 稀释至1 0 0 m l 。 ( 2 ) 酶溶液的配制：在测定即将开始时把酶溶于p h = 7 0 磷酸缓冲液中。l m l 配制 溶液中应含有5 2 0 u 。 ( 3 ) 操作步骤：用移液管将1 0m l 底物溶液和1 9 m l 蒸馏水滴入一规格为l c m 的 比色皿。为了检查在不加酶的情况下吸光度是否也降低，就得在2 4 0 n m 处以蒸馏水为参 试验材料、仪器和方法 比测定吸光度。若吸光度的降低幅度超过0 0 1 ，则在计算主值时须减去此值。将0 1 m l 酶液加到比色皿中，并同时计时，在2 4 0 h m 处以蒸馏水为参比在连续5 r a i n 内测定吸光 度，每隔l m i n 读取一次结果，直至每分钟吸光度的降低值达到稳定为j p i 3 s 。根据公式 ( 2 1 ) 计算酶的活力1 3 5 l 。计算公式如下： 兰堕竺= 酶活力( u m l )( 2 1 ) 0 0 4 3 6 e 。 、 易，d 2 4 0 r i m 处每分钟内吸光度的降低值： e 广每0 1 m l 所用酶液中含酶的量( m l ) ； 0 0 4 3 6 - - 2 4 0 n m 处l 岬o l 过氧化氢的吸光度： 3 一反应混合液的总体积。 2 3 2 过氧化氢标准曲线 准确配置不同浓度过氧化氢溶液，在其特征吸收波长2 4 0 n m 下测定其吸光度4 【3 5 】， 以溶液浓度c ( m o f l ) 为横坐标，吸光度4 为纵坐标，进行线性回归分析，得到溶液浓度 与吸光度相关的标准曲线，如图2 - l 所示。 3 2 ，5 2 b 昏 l o 5 0 00 010 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 浓度c ( m o l l ) 图2 一l 过氧化氢标准曲线 f i g 2 - is t a n d a r dc u r v eo fh y d r o g e np e r o x i d e 2 3 3 固定化过氧化氢酶活力测定方法 在3 0 * ( 2 下，将0 5 0 0 9 固定化酶加入到5 0 m lo 0 5 m o l l 的过氧化氢磷酸盐缓冲溶液 中，反应1 r a i n 后取出固定化酶，在过氧化氢特征吸收波长2 4 0 n m 处分别测定反应前后 溶液的吸光度值，根据过氧化氢的标准曲线求得过氧化氢的浓度，按式( 2 2 ) 计算固定化 酶活力【1 9 1 ，酶活力的定义：在规定条件下，于温度3 0 c ，p h = 7 0 ，每分钟分解1 9 m o l 过氧化氢所需的固定化酶量( 以固定化酶后棉织物的质量为基准) 。酶活力的单位用u g 来表示。 竖掣：鳓( u g ) ( 2 - 2 ) fx 聊 矽乙_ 过氧化氢溶液体积( m l ) ； 卜反应时f n - j ( m i n ) ： ，扩固定化酶后棉织物质量( g ) ： 9 江南大学硕士学位论文 q 一过氧化氢初始浓度( m o l l ) ； c 卜过氧化氢剩余浓度( m o l l ) 。 2 3 4 固定过氧化氢酶的工艺 2 3 4 1 载体制备 将1 0 0 0 9 漂白棉织物浸入2 0 m l 0 0 4 0 0 m o l l 的n a l 0 4 溶液中，置于全封闭水浴 恒温振荡器中，于2 5 - - - , 5 0 c 避光反应一定时间后，用0 1 0 0 m o l l 的丙三醇溶液洗涤3 0 m i n p 7 】，以除去残余的n a l 0 4 ，再用蒸馏水充分洗涤，洗去丙三醇，用滤纸吸干备用。 2 3 4 2 过氧化氢酶的固定化 将上述制备的载体二醛基棉织物置于5 0 m l 不同浓度的酶溶液中，在4 c 反应数小 时后，用蒸馏水充分洗涤，即得到固定化的过氧化氢酶，室温晾干并置于4 c 的冰箱中 贮存备用。实验中以失活酶和载体反应作为空白样。 2 3 4 3 考马斯亮蓝试验 蛋白试剂考马斯亮蓝g 2 5 0 的配制：称取1 0 0 m g 考马斯亮蓝g 2 5 0 ，溶于5 0 m l 9 5 的乙醇中，加入8 5 的( w v ) 的磷酸1 0 0 m l ，最后用蒸馏水定容到1 0 0 0 m l 。 将棉织物在最佳条件下氧化，然后和未经氧化的棉织物一起分别加到相同的酶溶液 中，在4 。c 下作用2 4 h 后用蒸馏水洗6 次，室温晾干。 取相同大小的未处理的棉织物、未经氧化直接吸附酶的棉织物和固定酶的氧化棉织 物三种样品，分别加到1 0 m l 配制的考马斯亮蓝g 2 5 0 的试剂中，在室温下反应5 m i n 后取出水洗2 次，室温晾干，用数码相机拍照。 2 3 5 固定化过氧化氢酶的性质 在下面的一系列酶的性质实验中所用的固定化过氧化氢酶和空白样都是在优化的固 定条件下所得，并且在下面所涉及的固定化过氧化氢酶用固定化酶表示，游离的过氧化 氢酶用游离酶表示。 2 - 3 5 1 最适温度 在2 5 c 、3 0 。c 、4 0 c 、5 0 和6 0 c 下，分别按常规方法测定游离酶和固定化酶的 活力，并分别以各自最大的酶活力作为1 0 0 ，用相对酶活来表示在不同温度下酶活力 变化的情况。 2 3 5 2 最适p h 选择p h 的范围为3 0 1 0 0 ，用n a 2 h p 0 4 一柠檬酸配制浓度为o 2 m o l l 的p h = 3 0 8 0 的缓冲液，用甘氨酸- n a o h 配制浓度为0 2 m o l l 的p h = 9 o 1 0 0 的缓冲液。用相应p h 的缓冲液配制底物溶液。按常规方法分别对游离酶和固定化酶在不同的p h 值下的酶活 力进行测定，以各自最大的酶活力为1 0 0 ，用相对酶活来表示在不同p h 值下酶活力 变化的情况。 2 3 5 3 固定化酶的操作稳定性 在5 0 m l 浓度为o 0 4 5 m o l l 的过氧化氢溶液中，加入0 5 0 0 9 固定化酶，反应1 0 m i n 后，取出酶，测定溶液中过氧化氢的浓度。固定化酶用蒸馏水洗涤后，再重新置于新取 l o 试验材料、仪器和方法 的上述底物溶液中，再次反应1 0 r a i n ，这样反复多次，直到酶活性很低，以第一次的酶 活力为1 0 0 ，结果用相对酶活来表示。 2 3 5 4 抑制剂和鳌合剂对酶活力的影响 乙醇的影响：在底物溶液中分别加入一定量的乙醇，使得其浓度为0 0 2 m l m l 、 0 0 4 m l m l 、0 0 6 m l m l 、0 0 8 m l 札按常规方法测定游离酶及固定化酶的酶活力，以 未加乙醇所测定的酶活力为l o o ，用相对酶活来表示酶活力的变化。 尿素的影响：配制尿素的浓度分别为2 m o f l 、4 m o l l 、6 m o l l 、8 m o l l 的底物溶液， 分别按照常规方法测定各自的酶活力，以未加尿素的底物溶液测定的酶活力为l o o ， 用相对酶活来表示酶活力变化的情况。 e d t a 的影响：配制e d t a 的浓度分别为l m m o l l 、2 m m o l l 、3 m m o l l 、4 m m o l l 、 5 m m o l l 的底物溶液，分别按照常规方法测定各自的酶活力，以未加e d t a 的底物溶液 测定的酶活力为1 0 0 ，用相对酶活来表示酶活力变化的情况。 2 3 5 5 酶的热稳定性 将游离酶和固定化酶分别置于4 0 、5 0 、6 0 的环境中分别保温1 5 r a i n 、3 0 m i n 、 4 5 m i n 、6