（环境工程专业论文）基于gfp标记的镉生物传感器构建及其对镉毒性的检测.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 墨 如需保密，解密时间年月 日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特另9 加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名： 互芗巧组 时同：似叼- 7 年月乃日 规定”，印学生必须按 提交论文的印刷版和电 描等复制- 1 - 段保存、汇 体上发表，传播学位论 学位论文作者签名：王彳巧经 导师签名： 7 签名日期：饥彬7 年f 月2 多日签名日期：。刁年 蜘哆日 基于g f p 标记的镉生物传感器构建及其对镉毒性的检测 摘要 利用本实验室保存的两株高抗重金属的细菌为出发菌株，导入g 争标记的质粒 构建出两株生物传感器。研究了g f p 标记菌株的发光定量方法及其在c d 毒性检测 中的应用，主要包括斫，标记工程菌的构建、荧光量与镉离子浓度的关系和发光细 菌法在c d 毒性检测中的应用等三个方面。结果如下： 1 以ec o l i 为宿主菌，构建含有c h 积阳即标记的质粒，并将质粒导入大肠 杆菌中，在培养基中加入不同浓度镉进行诱导，当镉离子浓度小于o 0 5m m 时，荧 光强度随启动子效率增加而升高；当镉离子浓度在o 0 5l t i m 0 1 5m m 时，荧光强 度受菌体浓度和启动子效率的双重影响，在曲线上呈现先增加后下降的钟型分布； 当镉离子浓度大于o 1 5m m 时，荧光强度主要取决于细菌的浓度，当细菌浓度达到 稳定期时，荧光强度保持不变。 2 以ec o l i ( p n q 2 1 ) 为对象，检测了在不同土壤固体颗粒存在的情况下，传感 器荧光量的变化情况，表明在蒙脱石和高岭石存在情况下，传感器荧光强度下降8 0 ，针铁矿和石英砂对传感器几乎无影响。 3 将c a d r - e g f p 标记抗重金属菌株产气肠杆菌n g 0 1 和恶臭假单胞菌x 4 ，并 将这两种工程菌投入含有重金属的土壤，进行烟草盆栽试验，荧光显微镜能够监测 到土壤中传感器发出的强烈荧光信号，说明该传感器能够检测土壤的镉污染，而且 添加传感器的烟草生长明显优于未添加传感器处理的烟草，意味着该传感器还能降 低土壤中金属镉对烟草的毒害作用。 关键词：生物传感器；镉；污染检测；构建；土壤； 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 a b s t r a c t g 行o - t a g g e dp l a s m i dw a st r a n s f o r m e di n t ot w oh e a v y m e t a l - r e s i s t a n tb a c t e r i a ls w a i n s t h el u m i n e s c e n c eq u a n t i t a t i v em e t h o do fg t p t a g g e ds t r a i n sa n dt h ea p p l i c a t i o no f b i o s c n s o ri nd e t e c t i o no f c a d m i u mt o x i c i t yw g t es t u d i e d t h i ss t u d yi n c l u d e sc o n s t r u c t i o n o fg f p - t a g g e ae n g i n e e r e ds t r a i n s ，c h a r a c t e r i z a t i o no ft h er e l a t i o nb e t w e e nc a d m i u mi o n c o n c e n t r a t i o na n df l u o r c s o e ai n t e n s i t y , a n dt h ed e t e c t i o no fc a d m i u mt o x i c i t yb y l u m i n e s c e n c em e t h o d p l a s m i dw i t hc n d r - e g f pt a gw a sm m s f o r m e dt oe c d i , a n dd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so fc a d m i u mw a sa d d e dt oi n d u c e 耐g a n ee x p r e s s i o n f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t yi se n h a n c e dw i t hi n c r e a s e dp r o m o t e re f f i c i e n c yi nt h ep r e s e n c eo fl e s st h a no 0 5 m mc a d m i u m w h e nc a d m i u mc o n c e n t r a t i o nw a si nt h er a n g eo f0 0 5 - 0 1 5r a m , f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yw a si n f l u e n c e db yb o t hb a c t e r i a lb i o m a s sa n dp r o m o t e re f f i c i e n c y , a n da b e l l ”c u r v ew a so b s e r v e d w h e nc a d m i u mc o n c e n t r a t i o nw a sa b o v e0 1 5m m ， f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t yw a sm a i n l yd e p e n d e n to nb a c t e r i a lb i o m a s s ，w i t h as t e a d y f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t ya tt h es t a t i o n a r yp h a s e t h ef l u o r e s c e n c eo fec o i l ( p h q 2 1 ) a si n f l u e n c e db ys o i lp a r t i c l e sw a se x m i n e d o r e 咖c ei n t e n s i t yw a sd e c r e a s e db y8 0 i nt h es y s t e mo fm o n t m o r i l l o n i t ea n d k a o l i n i t e n os i g n i f i c a n ti n f l u e n c ew a sf o u n do nf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yf o rs a n da n d g o e t h i t es y s t e m s c a d r - e g f pm a r k e de n t e r o b a c t e ra e r o g e n e sn t g 0 1a n dp u t i t ap s e u d o m o n a sx 4 a n dx 4w a su s e di np o tc u l t u r ee x p e r i m e n t sw i t ht o b a c c oa n dc d rp o l l u t e ds o i l s t r o n g f l u o r e s c e n c es i g n a lw a so b s e r v e db yf l u o r e s c e n c em i c r 0 叩e ，s h o w i n gt h a tt h ex 4 b i o s e n s o rc a nd e t e c tc 矿p o l l u t i o nf r o ms o i l 皿eg r o w t ho f t o b a c c ow a se n h a n c e di nt h e t r e a t m e n to fx 4s t r a i na sc o m p a m dw i t hn ob i n s a n s o rt r e a t m e n t t h er e s u l t ss u g g e s t e d t h a tt h eb i o s e n s o rm a ya l s oh a v ep o t e n t i a l si nt h er e m e d i a t i o no fh e a v ym e t a lp o l l u t e d s o i l s k e yw o r d s ：b i o s e n s o r ；c a d m i u m ；p o l l u t e dd e t e c t i o n ；c o n s t r u c t i o n ；s o i l ； 2 基于g f p 标记的镉生物传感器构建及其对镉毒性的检测 刖舌 随着工业化、城市化、农村集约化进程的不断加快，我国的土壤污染问题日益 突出，受不同程度污染的土壤面积不断扩大。据农业部调查，在约1 4 0 万公顷的污 水灌区中，遭受重金属污染的土地面积占6 4 8 ( 崔德杰，2 0 0 4 ) 。因此，有效地进 行重金属污染的检测成为一项紧迫的课题。目前，用于重金属污染检测的方法主要 有化学和生物学方法。传统化学检测方法通常测定的是体系中的重金属总量，并不 能正确反映重金属对生物的毒性效应( p o n g r a t z , 1 9 9 8 ) 。重金属对生物的毒害作用取 决于生物可利用态的重金属含量，而非重金属总量( f a n e l l ，1 9 9 3 ) 。有研究者利用 不同化学抽提剂如e d t a 、醋酸等，提取和测定体系中的可溶态重金属，用以表征 生物可利用的重金属量( m aa n du r e n ，1 9 9 8 ；q u e v a u v i l l o , 1 9 9 7 ) 。这些方法毕竟是通 过化学测定来模拟生物体对重金属的吸收利用，能否正确表示重金属对生物造成的 实际影响尚存争议。 生物学方法则是直接检测污染物对生物体的毒理作用，它更能体现重金属在环 境中的实际污染程度。微生物学方法特别是细菌对于抗重金属的机制，以及在重金 属污染土壤中的实际应用方面，近年来的研究十分活跃，包括细菌筛选、抗性检测j 传感器构建和微生物修复环境污染等。目前抗重金属菌株的研究主要有 p s e u d o m o n a s 、x a n t h o m o n a s 、ec o l i 、e n t e r o c o c c u s 、s t a p h y l o c o c c u s 、r a l s t o n i a s h i g e l l a a l c a l i g e n e s 等，研究的抗重金属基因主要涉及c o p 、c z c 、n c c 、加，、c u p 、 c a d s 玎、m e r 、c c c 等( 叶锦韶，2 0 0 2 ) 。有关细菌的抗重金属机制以及重金属生物 传感器的研究进展主要有以下几方面。 1 微生物抗重金属的机制 虽然当重金属超过一定浓度时，对微生物具有毒害作用，但是某些微生物可以 通过生物解毒对重金属毒性产生抗性。重金属生物解毒是指微生物把抑制其正常生 长繁殖的有毒重金属通过运输、结合与转化等方式使细胞内重金属减少、毒性减弱 并对重金属毒性产生抗性的生理代谢过程。 1 1 生物吸附 生物吸附是利用生物体及其衍生物来吸附环境中的重金属的过程。重金属离子 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 对生物体有很强的毒害作用，超过一定的浓度就会抑制生物生长或使生物体死亡， 有的微生物如某些藻类、细菌、真菌，本身或是经过驯化以后对重金属有一定的耐 受性，能够去除环境中的重金属离子。 这种吸附过程不依赖于细胞的代谢活性，重金属由被动运输进入细胞后，通过 “区域化作用”分布在细胞内的不同部位，被封闭为低毒的形式。另外微生物还能通 过多种途径将重金属吸附在其细胞表面。例如：革兰氏阳性细菌的细胞壁一般有 5 0 1 5 0i l i a 厚，主要由肽聚糖构成，约占整个细胞壁物质的3 0 9 0 ，网状的肽聚 糖大分子由大量小分子单体聚合而成，由于其网状结构，肽聚糖层对分子量在 1 2 0 0 - 7 0 0 0 0 d a 的分子有很高的通透性，其中含有较多的磷壁酸，带有较强的负电荷， 能吸附阳性重金属离子；而革兰氏阴性细菌细胞壁的肽聚糖含量占细胞壁的1 0 ， 在肽聚糖层的外层有8 - 1 0n l n 厚的脂多糖，因其带有较强的负电荷，故也能吸附较 多的重金属阳离子。真菌的细胞壁由甘露聚糖、葡聚糖、几丁质、纤维索和蛋白质 等成分组成，这些物质同样带有较多的负电荷，能吸附重金属阳离子。 1 2 代谢累积 1 2 1 微生物对重金属的氧化还原 1 9 9 7 ) ，将有毒物质转化成无毒或低毒物质。假单胞菌属在金属及类金属离子的甲基 化作用中具有重要的贡献，它们能够使许多金属或类金属离子发生甲基化反应，从 而使金属离子的活性或毒性降低。 微生物通过有机汞裂解酶催化有机汞的碳汞键断裂，再由依赖n a d p h 和f a d 为 辅酶的二聚体酶一汞还原酶把无机h 9 2 + 还原为h g o ，使之挥发离开菌体细胞，这一过 程是可诱导的，有机汞裂解酶和汞还原酶的底物都是该酶的诱导剂。j o n a t h a n 等 ( 1 9 9 9 ) 的研究表明，与运输汞相关的基因有：m e r a ，m e r b 、m e r c ，m e r d ，m e r p ， m e r r 和m e r t , 它们位于同一个操纵子上。其中m e r a 编码汞还原酶，该酶常以二聚 体形式在细胞质内与内膜呈松疏的结合，m e r b 编码有机汞裂解酶，但它的定位尚未 确定， 细巧n 朋打c 编码有关h 矿+ 吸收的内膜蛋白，m e r r 编码调节蛋白，朋a 护编码 位于周质空间结合h 9 2 + 的蛋白，m e r d 是革兰氏阴性菌中除m e r r 之外的第二个调节 基因，它们均编码调节蛋白，结合于操纵子的o p 处，调节m e r 操纵予上的结构基因。 当无 i g z + 存在时，调节蛋白结合于操纵子的o p 处，阻止r n a 聚合酶与d n a 结合。当 h 矿+ 存在时，h 矿+ 与朋毫穰蛋白结合，j _ 旦h 9 2 + 和胍袱蛋白的复合物并不离开d n a ， 而是在o p 处使d n a 发生扭曲、折叠，使r n a 聚合酶与d n a 结合，激活m e r t ，m e r p ， 4 基于g f p 标记的镉生物传感器构建及其对镉毒性的检测 m e r c ，m e r a ， 拒以转录，前三个蛋白组成h 矿+ 吸收、转运系统，将h 矿+ 运至施硝 作用部位，从而高效、快速地将h 矿+ 还原成h 酽，降低h 9 2 + 对细胞的毒性。 1 2 2 输出系统对重金属的作用 某些二价金属离子由于没有足够的还原酶所需的n a d p h ，又缺乏甲基化或其 他共价修饰机制，因此不能像h g o 那样挥发出细胞，但可以借助于输出系统完成这 一任务，其中有三种系统( r n d 、c d f 和p - a t p a s e ) 介导二价金属阳离子排出细胞 ( n i e s ，1 9 9 7 ) ，目前这种输出机制主要用于抗镉和抗铜系统。例如在真养产碱杆菌 a l c a l i g e n e se u t r o p h u s 中p m o l 3 0 质粒上发现的革兰氏阴性菌对c d 2 + 、z n 2 + 、c 0 2 + 输出的c 那系统，c 系统编码r n d 驱动的跨膜输出子c z c c b a 和c d f 型的c z c d ， 其中c z c c b a 由c z c a 、c z c b 和c z c c 组成，c z c a 是位于细胞质膜的质子阳离子反向 运输子，c z c b 是位于周质空间的膜融合蛋白，c z c c 则位于细胞外膜，它带有前导 序列，它的原肽在跨过细胞质膜的过程中被加工成熟，c z c d 对c z c c b a 的表达起到 调节的作用。 1 2 - 3 形成金属硫化物或磷酸盐 金属硫化物和磷酸盐是重金属复合物中较为常见的形式，细胞内s ( i i ) 的来 源可以分为两类，一类通过硫酸盐还原酶的作用将硫酸盐还原成二价硫离子，以硫 化氢形式溢出细胞，然后与重金属离子结合生成金属硫化物，这种酶一般存在于s r b 中，需要厌氧环境( b a n g ，2 0 0 0 ) ；另一类来源于半胱氨酸脱硫化氢酶的作用，这种 酶一般在好氧条件下催化生成的二价硫离子与镉沉淀。磷酸盐是在细胞表面磷酸酶 的介导下，将有机磷( 例如甘油一2 一磷酸) 的h p 0 4 。解离，在u 0 2 2 + 存在时生成生 物结晶h u 0 2 p 0 4 ，h u 0 2 p 0 4 中的质子和重金属离子在反向运输子的作用下达到沉积 重金属的目的( b a s n a k o v a ，1 9 9 8 ) 。 2 镉生物传感器研究现状 生物传感器是指将报告基因连到污染物代谢调控基因的启动子内，并且转入抗 重金属的菌株中。当特定的污染物存在时报告基因被表达，报告基因的表达可以通 过肉眼或仪器观测到，从而判断环境是否被该污染物污染。镉作为一种毒性较强、 污染范围较广的重金属受到广泛的重视，下面以镉生物传感器为例叙述生物传感器 的研究现状。 5 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 y o o n 等( 1 9 9 1 ) 利用b l a z 作为报告基因研究& a l r e 谢的p i 2 5 8 质粒上的c d 诱导 基因c a d a 的金属诱导情况，表明c d 、p b 和b i 对c a d a 具有较强的诱导作用，z n 和c o 为弱诱导。c o r b i s i e r 等( 1 9 9 3 ) 用l u x a b 作为报告基因也得到相同的结果，c d 和p b 的诱导浓度分别为0 5 和l m 。t a u r i a n i n c n ( 1 9 9 8 ) 使用l u c f f 作为报告基因构 建了c a d a 1 u c f f 的生物传感器p t 0 0 2 4 , 分别导入且s u b t i l i s 和& a l l r e 螂中。& a l d t h l s 受c d p b 和s b 诱导的浓度分别为l o 、3 3 和l m 。b s u b t i l i s 受c d 、p b 和s b 诱导 的浓度分别为3 3 、3 3 和1m 。其它金属对c 口剃基本上没有诱导作用。 i k n s i n g 等( 1 9 9 8 ) 构建出c a d c - l a c z 生物传感器，并把它导入两个不同的ec o l i 菌株中，一株为野生型，另一株为r a t a 缺失型( z n t a 位于ec o l i 染色体上的抗c d 相关基因) 。结果表明c a d c 可被p b ，c d 以及z n 诱导，诱导顺序为p b c d z n 。 p b 的检测范围是2 5 也0 0n m 。野生型菌株的p b 诱导，若要达到最大诱导量，其需 要的p b 浓度要大于缺失型的菌株约1 5 倍之多。而对c d 而言，这种不同菌株间所 表现的差别就要小很多。s h c t t y 等( 2 0 0 3 ) 比较了l a e z 和斫，作为报告基因的c d 生物 传感器，检测菌株为z n t a 缺失型的ec o l i 。结果表明，以l a c z 为报告基因的检测中， c d 和p b 的敏感度均为lo 1 1m ，大大低于缸c 野为报告基因的传感器。然而，细胞 的裂解使得l a c z 的方法不如l u c f f 简便且适用于原位检测。对于g f p 菌株而言，c d 、 p b 和z n 对c a d d 都有诱导作用，而且p b 的诱导要强于c d 。b i r a n ( 2 0 0 0 ) 等使用 z n t a - l a c z 构建的传感器对c d 有特异检测性，检测灵敏度为5 0h i d ，对z n 和n g 也 z n 进行检测，结果这些金属均有诱导作用，分别是0 3 、1 、3 0 和3m 。i v a s k ( 2 0 0 2 ) 等使用胁c 阡为报告基因构建了ec o i lm c l 0 6 1 ( 册纠1 u c f f ) ，测试的n g 、c d 及z n 的检测限度分别为0 0 0 4 、0 0 0 6 和2 6m g l 。 3 新型报告基因g f p 特点 g f p 作为环境微生物的标记基因具有许多优点：荧光特性稳定。只有过热 ( 6 5 ) 、过酸( p h i ) 、过碱( p h 为1 2 1 3 ) 或其他变性剂存在时，g f p 的荧光才会消 失。一旦恢复中性p h 环境或除去变性剂，其荧光仍可恢复并具有和原来一致的发 射光谱( z i m m e r ，2 0 0 2 ) 。检测极为方便。对g f p 的检测只需蓝光和近紫外光激 发，不需要任何外源基质，也不必对细胞进行预处理、固定或染色；用普通荧光显 微镜或手提式紫外灯( 3 6 5n m ) 照射即可进行观察，使用激光共聚焦扫描显微镜效果 更佳，还可以使用细胞分选仪检测。然而以往的标记基因多使用荧光脂酶，荧光检 测需加辅助因子，操作繁琐，而且价格昂贵。g f p 的表达与受体细胞的种属无关， 原核和真核细胞都能表达，而且对细胞没有毒性，不会扰乱受体细胞的正常功能。 6 基于c - f p 标记的镉生物传感器构建及其对镉毒性的检测 能进行单细胞和活细胞观察，也可进行实时原位观测，不会破坏被观察的细胞及 其生长环境。土著微生物中不含有g f p ，因而检测g f p 时一般不会出现假阳性 结果。但是g f p 作为标记基因也存在一些缺点，如：g f p 在不同未知细菌中的表达 是变化的；细胞死后其荧光在较长时间内仍然存在；因g f p 生色团的形成需要0 2 的存在，故在严格厌氧条件下g f p 不能产生荧光( z i m m e r ，2 0 0 2 ) ；g f p 不像酶一 样具有信号放大作用，因此一般都需要强启动子以驱动g f p 基因在细胞内大量表达 ( 赵华，2 0 0 3 ) 。 目前对g f p 的荧光发光机制还不清楚，m o r i s e 等( 1 9 7 1 ) 曾提出一个能量传递 模式图来解释水母的发光机制，但并未获得认同。c h a t t o a j 等( 1 9 9 6 ) 对g f p 进行 了光谱分析，结合前人工作提出，g f p 有两个明显的吸收带，对应于g f p 的两种不 同构象的基态a 和b 。基态a 对应于3 9 5 n m 的吸收峰，基态b 对应于4 7 5 n m 的吸 收峰，基态a 占优势，基态b 的分子数量约是基态a 的1 6 ，两种基态间能缓慢地 转换，但激发态( ) 之间的转换很快且发生了质子转移，a 快速高效地衰变至另一激 发态，应该存在一个中间过度态i ，质子转移使a 崎专变成i ，i 回迁到基态i 时产 生发射峰- - 4 n l n 的荧光，构象改变使i 转变成b ，由b * 至i jb 发射荧光而不发生质子 转移。目前，对于g f p 的作用机理较为认同的仅仅是：g f p 是生物发光过程中的能 量受体，并且是最终的发光体，不同的生物发光机制各不相同，不同的突变体发光 机制也有很大差异。 绿色荧光蛋白g f p 不同于l u x a b 发光标记，是一类存在于水母等腔肠动物体内 的生物发光蛋白，当受到紫外或蓝光激发时，g f p 蛋白便会发出绿色荧光。s 这种发 光是g f p 蛋白特有的性质，不需要参与发光反应，也不需要其它底物或辅助因子 ( c h a l f i e , 1 9 9 4 ) 。g f p 蛋白的三维结构为一个由l l 条b 桶状结构绕成的一个圆柱体， 一条n 螺旋缠绕在圆柱体的轴心上。蛋白生色团就固定在螺旋上，包埋于圆柱体 中心从而得到很好的保护( y a n g ，1 9 9 6 ) ，这种结构使g f p 蛋白的半衰期较长。 4g f p 蛋白在环境微生物研究中的应用 4 1 生物膜和活性污泥 许多学者利用生物膜反应器对废水和饮用水进行处理取得较好效果，但对生物 膜的生长和菌群特征了解甚少。利用g f p 标记基因可以方便地研究生物膜的生长特 性及其菌落特性。m o i l e r 等( 1 9 9 8 ) 发现g f p 标记的p p u t i d ar i 细菌主要聚集在 生物膜的表层，而a c i n e t o b a c t e r s p c 6 则附着在生物膜底层生长。s k i l l m a n 等( 1 9 9 8 ) 7 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 将g f p 标记的e a g g l o m e r a n s 细菌和没有标记的足p n e u m o n i a e 细菌混合培养1 6h 驯养生物膜，然后用碘化丙锭( p r o p i d i u mi o d o d e ，p d 染色( 不掩盖g f p 发出的荧光) ， 用以观察g f p 标记细菌的空间分布，同时可观察p i 染色的细胞( 在紫蓝光滤镜下用 p i 染色的细胞在显微镜下为红色) ，研究发现这两种细菌在生物膜的微菌落中紧密地 结合在一起，与表面结合的大分子物质是两种细菌相互结合的基础。 利用g f p 标记基因也可以研究活性污泥絮体中的菌落。e b e r l 等( 1 9 9 7 ) 用 m i n i - t n 5 - g f p 标记p p u t i d ak t 2 4 4 2 细菌研究活性污泥中的细菌存活情况，将这种 标记细菌加入污泥絮体中后，能立即观察到细胞自由游动，2m i n 后观察到原生动物 捕食标记细菌，3 d 后大多数标记细菌已进入污泥絮体中，这表明污泥絮体能保护细 菌免受原生动物的捕食。o l o f s s o n 等( 1 9 9 8 ) 利用g f p 标记e c o l i 和s 历口，c 咖 细菌，考察细菌附着于污泥絮体的过程。使用表面荧光显微镜能将带有g f p 标记的 细胞从活性污泥中区分开进行观察和计数，而采用激光共聚焦扫描显微镜能使g f p 标记细菌产生三维轮廓。结合表面荧光和c l s m 观察g f p 标记细菌，发现细胞表面 的疏水性对细菌附着于污泥絮体起重要作用，而且这两种细菌在污泥絮体上的附着 模式有很大差异。通过这种方法可更好地研究细菌的附着机理，有助于提高废水处 理的效果。 4 2 微生物降解及其迁移 细菌的数量、空间分布和代谢活性等能提供与微生物降解相关的重要信息。利 用g f p 标记基因进行的研究有助于获得与此相关的精确数据。b a s t o s 等( 2 0 0 1 ) 进 行了苯酚降解菌彳f a e c a l 缸染色体标记试验，通过p c r 和s o u t h e r nb l o t 分析，证实 g f p 基因成功整合到受体细胞的染色体中，而且试验证明标记g f p 基因并不影响细 菌降解苯酚的能力。 g f p 标记基因也可以用来研究细菌在环境介质中的迁移。罗启仕等( 2 0 0 4 ) 以 克隆有g f p 的根瘤菌r h i z o b i u mm e l i l o t i l 0 2 1 作为标记菌，研究土壤中的基因工程菌 在电场作用下的迁移及其存活性，结果表明有标记的和没有标记的根瘤菌对电场的 反应相同。k 滞( 1 9 9 6 ) 将g f p 克隆到基因工程菌ec o l i 中，监测其在水环境中 的数量和去向，获得了同平版记述法相同的结果。 4 3 作为标记基因研究代谢过程 在生物强化过程中，原生动物的捕食作用决定着外源细菌能否成为优势菌群。 对细菌的捕食可以通过细菌数量的减少间接测定，但是直接观察原生动物对特定细 8 基于g f p 标记的镉生物传感器构建及其对镉毒性的检涮 菌的捕食作用则很困难。g f p 标记系统不需要外源基质，而且可以进行单细胞观察， 因而g f p 基因是研究原生动物捕食细菌的理想标记。用g f p 标记细菌有助于实时 跟踪细菌的去向，估计原生动物对细菌的瞬时捕食速率。 l e u n g ( 2 0 0 0 ) 等用g f p 标记能降解p n p 的m o r a x e l l a 菌株g 2 1 ，研究z t h e r m o p h i l a 对该标记菌的捕食作用。由于 3 2 1 能发绿色荧光，因而可以直接观察捕 食过程和zt h e r m o p h i l a 体内的单个荧光细胞。结果表明，大多数( 3 2 1 细菌在z t h e r m o p h i l a 中发生胞溶作用，g f p 释放出来在原生物动物体内形成明亮的荧光空泡。 e b e r l 等( 1 9 9 8 ) 将g f p 标记的p p u t d ag r e e n 3 1 细菌加入活性污泥中，很快就观 察到钟形虫和自由游动的原生动物体内出现绿色荧光细胞。 利用g f p 标记基因可以研究病毒、细菌和真菌等浸染植物的过程和机制。以前 常用荧光染料标记病原菌，病原菌的分裂使染料被稀释，因此长期以来未能观察到 病原菌侵入活细胞的实时实态过程。b o w y e r 等( 2 0 0 0 ) 在小麦病原菌中构建了含异 柠檬酸酶启动子的g f p 基因，监测到z y a l l u n d a e 侵染小麦时的碳代谢过程。 5 本研究的目的 综上所述，抗重金属基因尤其是抗铜、镉、铅等基因的克隆已经成为当前分子 生物学和环境微生物学领域研究的热点。但是如何快速有效地对环境中的重金属进 行检测，特别是原位检测技术还不是很成熟，这就要求我们开发灵敏、简便的生物 传感器。镉离子对生物具有较强的毒性，是环境中的一种重要污染元素，开展重金 属抗镉基因的研究具有重要的理论和实践意义。我们所筛选分离的抗重金属污染的 菌株对镉的抗性达5m m ，并且还能在含较高浓度的其它重金属培养基中生长。本 研究的目的是将绿色荧光蛋白( g f p ) 导入抗重金属菌株中，利用荧光标记来构建 特异性镉响应生物传感器，探讨该传感器的应用范围，建立了传感器的生物模型， 并通过盆栽实验验证该生物传感器的检测效果，为土壤重金属污染的微生物学检测 提供有力的工具。 9 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 1 实验材料 1 1 菌株与质粒 材料与方法 本文涉及到的菌株与质粒见表1 。 表1 供试菌株及质粒 t a b l e1b a c t e r i a ls t r a i n sa n dp l a s m i d su s e d 1 2 培养基 l b 液体培养基：细菌培养用胰蛋白胨1 0g l ，细菌培养用酵母抽提物5 9 ，l ， n a c i1 0 9 l ，p h7 0 - 7 2 。 s o c 培养基：细菌培养用胰蛋白胨2 0 9 l ，细菌培养用酵母抽提物5 班，n a c l 0 5 9 l ，2 5 0m mk c i ( 1 0 m 1 ) ，使用前再加入：2mm g c l 2 ( 5l l l l ) ；1m 葡萄糖( 2 0 m 1 ) ：p h ( 7 0 - 7 2 ) 。 1 0 基于g f p 标记的镉生物传感器构建及其对铺毒性的检测 上述培养基在1 2 1 条件下蒸汽灭菌3 0m i n 。若需固体培养基则向其中添加 1 5 的琼脂粉。 1 3 试剂 质粒抽提试剂： s o l u t i o ni ：5 0m m 葡萄糖；2 5 m mt r i s - c l ( p h8 o ) ；1 0 m me d t a ( p h8 o ) s o l u t i o n l i ：2 0 0 m m n a o h ；i s d s ( 先配好母液，使用时现配现用) s o l u t i o n ：5m 乙酸钾6 0m l ；冰乙酸1 1 5 m l ；水2 8 5 m l 苯酚氯仿混合溶液： i r i s 饱和酚：氯仿：异丙醇- - 2 5 ：2 4 ：1 t e 缓冲液： t r i s - c l ( 1 0r a m ) ；e d t a ( 1 m m ) ：p h8 0 。 5 0 t a e 电泳缓冲液： t r i s - b a s e ( 2 4 2 2 9 ) ；5 0 0m l v le d t a ( 1 0 0 m 1 ) 冰乙酸调节p h ( 8 0 ) ；d h 2 0 ( 1 0 0 0 m 1 ) 。 溴化乙锭( e b ) 染色剂： e b ( 1 0 0 9 ) ；d i - 1 2 0 ( 1 0 m 1 ) ：避光保存，使用浓度为o 5i ig m l 。 感受态细胞制备试剂： s o l u t i o n a ( 重悬液) o i mm g c l 2 - c a c l 2 ； s o l u t i o nb ( 冻存液) 含1 5 甘油的s o l u t i o n a 。 总d n a 抽提试剂 溶菌酶( 1 0m g m 1 ) ：使用前用1 0m mt r i s c i ( p h 8 o ) 即刻溶解溶菌酶，配制 成1 0 m g m l 浓度的贮存液。 蛋白酶k ( 2 0m g m 1 ) ：购来的蛋白酶k 是冷冻干燥的粉末状物质，用灭菌的 5 0m mt f i s ( p h8 o ) ，1 5m l v i 乙酸钙溶解，配制成浓度为2 0 m g m l 的溶液。将贮存 液分装，在一2 0 下保存。 s d s ( 1 0 ，m v ) ：用9 0 0 m l 水溶解l o 吨电泳级s d s 。 x - g a l 溶液( 2 ，m v ) ： 用二甲基甲酰胺溶解x - g a l 配成2 0 m g m l 的贮存液，于玻璃器皿或聚丙烯管中 保存。装有x - g a l 溶液的试管需用铝箔包裹以防因光照而被破坏，并贮存于一2 0 。 i p t g ( 2 0 ，m ，v ，8 0 0m m ) ： 用8 m l 蒸馏水溶解2 9i p t g 配制成2 0 的溶液，用蒸馏水定容至l o m l 。用o 2 2 i jn l 过滤器过滤除菌。分装成l m l 小份，贮存于一2 0 。 实验中使用的抗生素见表2 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 1 4 试剂盒和酶 本研究使用的胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司，超薄d n a 产物 纯化试剂盒购自北京天为时代科技有限公司，限制性内切酶n c oi 、e c o ri 、x b a i 、s a l i 、h i n di i i 、b a m h i 、b g l i i 、t 4 d n a 连接酶购自t a k a r a 公司，t a q 酶和 高保真d n a 聚合酶k o d 酶购自t o y o b o 公司，引物由北京三博科技公司合成： m a r k e r i 、m a r k e d 、 h i n d 等d n a m a r k e r 购自天根生化科技有限公司。 1 5 仪器 荧光分光光度计：日本岛津r f 5 3 0 0 p c ，荧光显微镜：奥林巴斯b x 5 1 。 2 实验方法 2 1 菌体培养 菌体的培养用l b 培养基，p r i 为7 0 - 7 2 ，1 2 0 ( 2 灭菌3 0 m i n 备用，供试重金属 c d 2 + 为c d ( n 0 3 ) 2 ，c u 2 + 为c u s 0 4 ，c d 2 + 和c u 2 + 浓度为1 0 0m m ，灭菌后作为母液待 用。含重金属培养基配制：将l b 固体培养基熔化后冷却至5 0 c 左右，无菌操作按 计算好的用量加入重金属母液使其达到所需浓度，摇匀后倒平板接菌种培养。 将活化好的n t g - 0 1 和x 4 菌株各挑取一环，分别接种于l b 液体培养基中， 于2 8 、2 0 0r p m 振荡培养2 4 h 。 基于c , f pg - h 3 的镉生物传感器构建及其对镉毒性的检测 2 2 最低抑菌浓度检测 最低抑菌浓度( m i n i m a li n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n , m i c ) 是指在体外试验中，各 种重金属能抑制培养基中细菌生长的最低浓度，m i c 值越大，说明细菌耐受重金属 的能力越强，相反，m i c 值越小说明细菌容易被该种重金属抑制。 分别挑取产气肠杆菌( n t g 0 1 ) 和恶臭假单胞菌( x 4 ) 的单菌落于新鲜的l b 液体培养基中，2 8 、2 0 0r p m 振荡培养2 。h 使细菌达到对数生长期时，按1 0 的 接菌量加入数个含有新鲜定量的l b 液体培养基中( 根据所测定的重金属样品数以 及设置的浓度梯度个数决定培养多少瓶菌液) ，2 8 1 2 、2 0 0r p m 继续振荡培养，待o d e , o o 值达到0 2 左右，将其中加入相应的重金属浓度( 其中一份不加重金属，4 保存， 作为对照) ，大约1 5h 后取出，测定含各种不同重金属的菌液o d e , o o 值。 2 3 构建镉响应荧光表达单元 2 3 1e g f p 基因的克隆 用限制性内切酶n c oi 和e c o ri 双酶切质粒p e g f p 获得含有e g f p 基因的片 断，并将其连接在用同样双酶切的载体p e t - 1 5 b 上。并将连接产物转化迸大肠杆菌 t g l 中。 p e g f p 和p e t - 1 5 b 胶回收： ( 1 ) 割下含d n a 的琼脂糖块，使它尽可能小，放入1 5m l 离心管中。 ( 2 ) 按每1 0 0n a g 琼脂糖加入3 0 0 1 - l 1s 1 液的比例加入s 1 液，置5 0 水浴1 0m i n ， 使琼脂糖块完全溶化，每2m i n 颠倒混匀一次。 ( 3 ) 当目的片段0 0 b p 时，加入l ，3s l 液体积的异丙醇，混匀。5 0 温浴1m i n 后，混匀。当目的片f 受 5 0 0b p 时，可省略此步骤，直接进行步骤( 4 ) 。 ( 4 ) 将溶化后的a g a r o s e 液移入吸附柱，1 2 ，0 0 0r p m 离心3 0 s 。收集管中液体， 再将吸附柱放入收集管。 ( 5 ) 在吸附柱中加入5 0 0 1 a lw l 液，1 2 ，0 0 0r p m 离心1 5 s 。收集管中液体，将吸 附柱放入收集管。 ( 6 ) 在吸附柱中加入5 0 0 1 a lw l 液，静置lm i n ，1 2 ，0 0 0r p m 离心1 5 s 。收集管中 液体，将吸附柱放入收集管。1 2 ，0 0 0r p m 再离心2m i n 。 ( 7 ) 将吸附柱放入干净的1 5m l 离心管中，在吸附膜中央加入3 0 i _ t lt 1 液，静 置1m i n ，1 2 ，0 0 0r p m 离心1m i n 。得到的d n a 贮存于2 0 。 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 感受态细胞t g 1 的制备： ( 1 ) 从新活化的l b 平板上挑取3 _ 4 个较大的单菌落，接种到含1 0 0 m ll b 培养 基的2 5 0m l 烧瓶中。3 7 振荡( 2 5 0r p m ) 4h 左右，至o d c 伽= o 3 0 4 。 ( 2 ) 提前开启冷冻离心机，设置温度为4 c ，放置5 0m l 转头预冷。a 、b 液放 置冰中预冷。5 0m l 离心管放置冰中预冷。1 5m l 离心管置于加冰的7 2 孔冰盒中预 冷。 ( 3 ) 将菌液倒入预冷的5 0 m l 离心管中，冰浴1 0 m i l l 。 ( 4 ) 4 下5 0 0 0r p m 离心6m i n ，小心地倒尽上清液。将离心管倒扣在吸水纸上 l m i n 沥干上清。 ( 5 ) 每管加3 0l l l l 预冷的s o l u t i o n a ，用5 m l 枪头轻轻吹吸( 勿使枪头接触沉淀) ， 重悬细胞沉淀。重悬后迅速将离心管放置冰上。 ( 6 ) 4 下5 0 0 0r p m 离心6r a i n ，小心地倒尽上清液。 ( 7 ) 每管加2m l 预冷的s o l u t i o n b ，用1m l 枪头吹吸重悬细胞沉淀( 需比步骤 5 更小心) 。重悬后迅速将离心管放置冰上。 ( 8 ) 向每个预冷的1 5m 1 离心管中加入2 0 0 i t l 细胞悬液( 吸取和加入细胞悬液 时，按下和放松移液器按钮的动作要轻、慢，否则会产生巨大的剪切力破碎细胞) ， 置一8 0 x 2 冰箱中长期保存。 一牵刊告早g * ( 1 ) 将5h l 酶连产物加入到2 0 0 p l 感受态细胞t g 1 中，充分混匀； ( 2 ) 冰上静置3 0m i n ；于4 2 水浴热激9 0s ； ( 3 ) 加入8 0 0p ls o c 液体培养基，充分混匀，3 7 ( 2 、1 5 0 r p m 摇动复苏4 5r a i n ： ( 4 ) 5 , 0 0 0r p m 离心1m i n ，弃上清液，吹打混匀下层菌体( 约2 0 0 “1 ) ；