（环境工程专业论文）土霉素对蚯蚓rna基因表达的影响.pdf

摘要 摘要 土霉素( o x y t e t r a c y c l i n e ) 是目前我国畜禽养殖业中较为常用的抗生素之一， 易于随畜禽粪便排放至水体和土壤环境中，由此带来较为严重的环境污染。但 目前国内外围绕环境中土霉素的生态毒理效应研究尚主要处在生物个体、组织 和细胞水平上，所采用的毒理指标也主要适用于表征高污染状况下的毒性效应， 而对于低污染水平下的毒理评价则显得无能为力。因此，细致表征土霉素的遗 传毒理，建立更为精确和敏感的土霉素生态毒理指标和方法，将有助于土壤环 境中土霉素的生态毒性的早期评价和诊断。 基于此，本论文以赤子爱胜蚓( e i s e n i af e t i d a ) 为受试生物，以土霉素为目 标污染物，采用荧光实时定量p c r 技术( s y b rg r e e n 染料法) ，以f l - a c t i o n 为 内参基因，在m r n a 表达水平上较为系统地研究了土霉素对赤子爱胜蚓超氧化 物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、热休克蛋白( h s p 7 0 ) 的基因表达情况 的影响，得到以下初步结论： ( 1 ) 在土霉素的污染下，蚯蚓体内s o d 、c a t 、h s p 7 0 的基因表达率均对 其产生了不同程度的响应，但是不同基因对毒性响应的规律不同：s o d 表达率 基本呈现“先增加后减少”的响应趋势，且s o d 表达率最高时间基本出现在2d ( 0 1 、1 、1 0 0 、2 0 0m g k g 最大表达率分别为2 7 3 2 、0 0 2 5 、3 8 5 8 6 、2 6 6 3 ) ， 而实验组1 0m 非g 的表达率最高时间出现在2 8d ，表达率为5 9 3 8 。c a t 表达率 基本呈现“先减少后增加”的响应趋势，且c a t 表达率最高时间都出现在2 8d ( 各 处理组表达率最大值分别为0 7 4 7 、1 9 1 2 、2 0 9 2 、4 4 6 9 、1 8 9 9 ) 。h s p 7 0 表达率 基本呈现“先增加后减少”的响应趋势，h s p 7 0 表达率最高时间基本上在7d ( 1 、 1 0 、1 0 0 、2 0 0m 班g 处理组的表达率最大值分别为8 0 5 6 、8 3 9 8 、6 6 1 2 、5 5 7 9 ) ， 而0 1m 眺g 处理组表达率最大值出现在1 4d ，为1 2 9 7 。 ( 2 ) 由s o d 、c a t 、h s p 7 0 的表达率的时间响应趋势可得，在土霉素污染 胁迫下，s o d 和h s p 7 0 首先被激发，c a t 随后被激发，三者协同作用增强细胞 的自我保护能力。 ( 3 ) 三种基因的表达率的相关性分析表明，s o d 和c a t ( p = o 9 8 5 ) 、s o d 和h s p 7 0 ( p = o 0 5 9 ) 、c a t 和h s p 7 0 ( p = o 8 1 9 ) 之间，p 值均大于0 0 5 ，三者不 存在明显相关性。 摘要 ( 4 ) 通过方差分析发现，作用( 染毒) 时间的长短对s o d 、c a t 、h s p 7 0 三种基因的表达率均有显著影响( p 值分别为o 0 6 0 0 、0 0 0 3 4 、o 0 0 11 ) ，而土霉 素在实验浓度范围内对这三种基因的表达率影响均不显著( p 值分别为0 2 4 0 1 、 0 2 3 2 7 、0 2 1 7 6 ) 。 ( 5 ) 在实际应用过程中，可考虑在不同时间段选择s o d ，c a t ，h s p 7 0 的 基因表达率作为生物标志物，以丰富和完善土霉素污染胁迫下的生态毒性效应 评价和诊断指标体系。 关键词：土霉素，赤子爱胜蚓，荧光定量实时p c r ，基因表达 a b s t r a c t a b s t r a c t o x y t e t r a c y c l i n ei so n eo ft h ec o m m o n l yu s e da n t i b i o t i c si na q u a c u l t u r e ，w h i c h e a s i l ya c c u m u l a t e si nw a t e ra n ds o i lw i t hp o u l t r ya n da n i m a lf e c e se m i s s i o n s i t s p o l l u t i o ni ss e v e r e ，a n dc a u s e sh u g ed a m a g et ot h ee n v i r o n m e n ta n dh u m a nh e a l t h t h es t u d ya b o u te n v i r o n m e n t a lo x y t e t r a c y c l i n e t o x i c o l o g i c a le f f e c ta th o m ea n d a b r o a dw a si ni n d i v i d u a l - t i s s u e - c e l ll e v e la n dc a nb ea p p l i c a b l et ot h eh i g hp o l l u t i o n m e d i u mt o x i c i t ya s s e s s m e n t ，b u tt ol o wl e v e l so fe n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o ne v a l u a t i o n w i l lb ep o w e r l e s s t h e r e f o r e ，b u i l dam o r ea c c u r a t ea n ds e n s i t i v ei n d e xa n dm e t h o dt o d i a g n o s et h et o x i c o l o g i c a le f f e c ta n dd a m a g eo fa n t i b i o t i c si sn e c e s s a r y t h e r e f o r et h i sp a p e rs t u d i e d s o d ，c a t , h s p 7 0g e n ee x p r e s s i o nu n d e rt h e o x y t e t r a c y c l i n eo fa n t i b i o t i ct e t r a c y c l i n ee x p o s u r ea tm r n ae x p r e s s i o nl e v e lo f e i s e n i af e t i d au s i n gr e a l - t i m ep c rm e t h o d ，w i t ht h em o s tc o m m o nd n a b i n d i n g d y es y b rg r e e na n db a c t i o n a sa l li n n e rn o r m a l i z eg e n e t h er e s u l t sw e r e a b s t r a c t e da sf o l l o w s ： ( 1 ) i nt h ee x p e r i m e n t ，t h ed i f f e r e n c eo fs o d ，c a t , h s p 7 0g e n ee x p r e s s i o nb a s e d o nt h ec o n c e n t r a t i o n so fo x y t e t r a c y c l i n ea n dt i m e a tt h eo x y t e t r a c y c l i n ee x p o s u r e ， s o d ，c a t , h s p 7 0g e n ee x p r e s s i o nh a dd i f f e r e n tr e s p o n s et oi t ，a n dt h er e s p o n s e m e c h a n i s m sw e r ea l s od i f f e r e n t s o dg e n ee x p r e s s i o nr a t i oh a da “m o r ef i r s tl e s s l a s t t r e n dr e s p o n s et ot h ec o n c e n t r a t i o n so fo x y t e t r a c y e l i n e ，a n dt h em a x i m u m a l m o s ta p p e a r e da t2 d ，( t h em a x i m u me x c e p t10m g k ga r e2 7 3 2 ，o 0 2 5 ，3 8 5 8 6 ， 2 6 6 3 ) ，t h e10m e g k gt r e a t m e n tg r o u pc a m e t ot h ep e a ka t2 8 d ，v a l u ew a s5 9 38 c a t g e n ee x p r e s s i o nr a t i op r e s e n t e dt h er e s p o n s et r e n d “l e s sf i r s tm o r el a s t ”，b u tt h e m a x i m u ma l m o s ta p p e a r e da t2 8 d ( t h em a x i m u ma r e0 7 4 7 ，1 9 1 2 ，2 0 9 2 ，4 4 6 9 ， 1 8 9 9 ) h s p 7 0g e n ee x p r e s s i o nr a t i op r e s e n t e dt h er e s p o n s et r e n d “m o r ef i r s tl e s sl a s t a n dt h em a x i m u ma l m o s ta p p e a r e da t7 d ( t h em a x i m u me x c e p to 1m g k g8 0 5 6 ， 8 3 9 8 ，6 6 1 2 ，5 5 7 9 ) ，t h e1 0m g k gt r e a t m e n tg r o u pc a m et ot h ep e a ka t1 4 d ，v a l u e w a s1 2 9 7 ( 2 ) b a s e d o nr e s p o n s et r e n d so fs o d ，c a t , h s p 7 0 ，w h e ne x p o s e dt o o x y t e t r a c y c l i n es o d a n dh s p 7 0w a sf i r s t i n s p i r e d ，c a ti s t h e ns t i m u l a t e d ，t h e i r i i i s y n e r g yc a ne n h a n c ec e l la b i l i t yo fs e l f - p r o t e c t i o n ( 3 ) b a s e do nt h ec o r r e l a t i o na n a l y s i so ft h r e ek i n d so f g e n ee x p r e s s i o n s o da n d c a t0 = o 9 8 5 ) ，s o da n dh s p 7 0 ( p - - 0 0 5 9 ) ，c a ta n d h s p 7 0p = 0 8 1 9 ) ，a 1 1o f t h e 矽a r e g r e a t e rt h a n0 0 5 ，s ot h e yh a v en oc o r r e l a t i o n ( 4 ) b a s e do nt h ev a r i a n c ea n a l y s i s ，t h eg e n ee x p r e s s i o nr a t i oo fs o d c a t a n d h s p 7 uh a v es 仃o n gc o r r e l a t i o nw i t ht i m e = 0 0 6 0 0 ，0 0 0 3 4 ，0 0 0 1 】) ，w h e r e a sh a v e l i t t l ec o r r e l m i o nw i t hc 。n c e n t r a t i o n s p = o 2 4 01 ，0 2 3 2 7 ，0 217 6 ) ( 5 ) i nt h ea p p l i c a t i o n ，m a yc o n s i d e rs o d ，c a t , h s p 7 0 g e n ee x p r e s s i o nr a t i oa s b l o l o g i c a lm a r k e r s ，w h i c hc a ne n r i c ha n dp e r f e c tt h ei n d e xs y s t e mo f e v a l u a t i o na 1 1 d d i a g n o s i st ot o x i ce f f e c t so no x y t e t r a c y c l i n e k e yw o r d s = o x y t e t r a e y c l i n e ；e i s e n i a f e f i d a ；r e a b t i m ep c r ；g e n e e x p r e s s i o n i v 南开大学学位论文使用授权书 根据南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法，我校的博士、硕士学位获 得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。 本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理规定。南开大学拥有在 著作权法规定范围内的学位论文使用权，即：( 1 ) 学位获得者必须按规定提交学位论文( 包 括纸质印刷本及电子版) ，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论文， 并编入南开大学博硕士学位论文全文数据库；( 2 ) 为教学和科研目的，学校可以将公开 的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读，在校园网上提供论文目录检索、文 摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务；( 3 ) 根据教育部有关规定，南开大学向教育部 指定单位提交公开的学位论文；( 4 ) 学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所及其万方 数据电子出版社和中国学术期刊( 光盘) 电子出版社提交规定范围的学位论文及其电子版并 收入相应学位论文数据库，通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其他媒体发 表论文的权利。 非公开学位论文，保密期限内不向外提交和提供服务，解密后提交和服务同公开论文。 论文电子版提交至校图书馆网站：h t t p ：2 0 2 1 1 3 2 0 1 6 1 ：8 0 0 1 i n d e x h t m 。 本人承诺：本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品，并已通过论文答辩； 提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致，如因不同造成不良后果由本人自负。 本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份，由研究生院和图书馆留存。 作者暨授权人签字： 魏壹蕉 2 0 1 2 年5 月2 6日 南开大学研究生学位论文作者信息 论文题目土霉素对蚯蚓m r n a 基因表达的影响 姓名 魏春花学号 2 1 2 0 1 0 0 5 4 5 答辩日期2 0 1 2 年5 月2 5 日 论文类别博士d 学历硕士口硕士专业学位团高校教师口同等学力硕士口 院系所环境科学与工程学院专业环境工程 联系电话 e m a i l 通信地址( 邮编) ： 各注： 是否批准为非公开论文 否 注：本授权书适用我校授予的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写( 一式两份) 签字后交校图书 馆，非公开学位论文须附南开大学研究生申请非公开学位论文审批表。 第一章引言 1 1 1 概述 第一章引言 第一节土霉素 土霉素( o x y t e t r a c y c l i n e ) ，别名地霉素，地灵霉素，氧四环素等，分子式为 c 2 h 2 4 n 2 0 9 ，相对分子质量4 6 0 4 4 。像其他四环素类抗生素一样，作为一种两性 化合物，土霉素能和各种酸、碱形成盐，其中盐酸盐性质最为稳定，因此在实 际生活中通常使用的为其盐酸盐。1 9 5 3 年生物化学家r o b e r tbw o o d w a r d 解析出 土霉素的结构，如图1 1 所示。 h 2 n oooo ho h 图1 1 土霉素结构式 f i g 1 1t h es t r u c t u r eo fo x y t e t r a c y c l i n e 土霉素是一种广谱抗菌药物，由于其广谱抗菌活性和低费用常作为牛、禽、 猪、家鱼等动物疾病的预防和感染的治疗用药，在低剂量添加时用来作为畜禽 的生长促进剂，而高剂量使用时可用来治疗疾病。土霉素进入畜禽体后，兽药 原形及其体内代谢产物会随粪尿等排泄物进入环境，给环境带来风险。有研究 表明，施用畜禽肥农田表层土壤中四环素的平均残留量是未施用畜禽肥农田的 1 3 倍，说明四环素的大量应用将给土壤带来严重的污染【l 】。并且土霉素的代谢 产物在结构和功能上与土霉素原形有一定的共性【2 】，在环境基质中具有难降解、 第一章引言 强吸附且易蓄积等特性【3 训。 1 1 2 土霉素在环境中的污染状况 作为广谱类抗生素中重要的一员，土霉素因其价格便宜、使用方便、并且具 有很好的抗菌促生长作用，是目前我国养殖业中最为常用的兽药添加剂。然而， 牲畜的高度集约化饲养也使得大量的兽药添加剂通过畜禽粪便、污水排放等方 式进入到土壤环境中【5 8 】，对生态系统和人类健康造成危害【9 , 1 0 】。据报道，四环素 类抗生素在世界上畜禽生产和使用量排名第二，而在中国排名第一【1 1 】。据统计， 2 0 0 2 年全国畜禽粪便产生量约为1 7 3 亿t ，是工业固体废弃物的2 7 倍，其中全 国猪粪产生量为1 2 亿吨，占畜禽粪便总量的4 6 9 1 2 】，a j i tks 报道：在欧洲， 超过2 5 0 0 吨四环素类作为治疗用兽药，并以土霉素应用最广泛【b 】。资料显示， 我国在2 0 0 3 年土霉素产量达到了1 0 0 0 0 吨，占世界总产量的6 5 【1 4 】，而且目前 土霉素的产量和用量还继续呈上升趋势。然而目前我国并没有畜禽养殖业抗生 素添加剂量的相关标准，导致土霉素常被过量使用甚至滥用。 土壤中土霉素【l5 j 的主要来源为含有土霉素的畜禽粪便、污泥和废弃物的土地 利用。我国畜禽粪便土霉素平均含量为9 0 9m g k g t l 6 】。另据报道，我国农村8 0 以上的畜禽粪便没有经过综合处理，直接被施于农田，经动物粪便排出的各种 抗生素及其代谢产物极易进入农田土壤环境中，导致各种抗生素尤其是土霉素 等在土壤环境中的累积 1 7 】，降低土壤生物活性，减弱土壤的生物功能【1 8 】。 在我国，土壤中可检测到的土霉素含量高达2 0 0m g k g ，水产养殖场沉积物 中土霉素浓度可高达2 8 5m g k g t 旧】。可见土霉素在土壤中的污染比较严重。对环 境和人体健康造成巨大危害，主要表现：抗生素在饲料中的长期使用会造成药 物残留和耐药基因的产生( 包括动物致病菌和内在微生物菌群) 【2 0 1 ，而且动物 间的粪便接触，特别是大规模圈养动物间又加速了这种耐药基因的扩散，进而 对人类染病的医治和微生态环境构成潜在威胁。另外，抗生素被动物吸收后， 可分布于体内各个部分，也可通过泌乳、产蛋而进入乳、蛋中，而在肉、蛋、 乳等动物产品中残留，残留的抗生素通过一般的食品烹饪方法不能完全使其分 解，从而对人产生毒副作用；饲用抗生素的使用不仅会使抗生素通过食品进入 人类食物链，还会随家畜的排泄物大量进入农田，被农作物吸收【2 。 在我国监测到的土壤中含有土霉素含有2 7g g 2 0 0m g k g 2 2 - 2 5 ，土霉素的实际 2 第一章引言 残留量在l a g k g m g k g 范围【2 6 。2 引。目前的研究表明土霉素对土壤动物的毒性较 低，效应浓度e c i o 值约为1 5 0m g k g 【2 9 1 。考虑到数值的变异，其显著低于不产 生影响的最高浓度( n oo b s e r v e de f f e c tc o n c e n t r a t i o n ，n o e c ) 值。这在生态毒 理学中属于相当普遍的状况。因此，许多研究人员建议在诸如风险评价环节中 使用e c l o 而不是n o e c 值。b a g u e r 掣3 1 】研究了土霉素和泰乐菌素对3 种土壤 动物( 蚯蚓、跳虫和线蚓) 的效应。结果发现在环境相应浓度下，二者对其均 无效应。最低观察效应浓度是3 0 0 0m g k g ，而大多数情况甚至在最高测试浓度 5 0 0 0m g k g 下也未观察到效应。曲萌萌等【3 2 】做土霉素对蚯蚓的毒性实验得到致 死浓度为大于溶液5 0 0m g l 。 此外，土霉素在水产养殖业中也广泛使用，通过饲料或直接添加于水体。 p o u l i q u e n 等【3 3 】研究发现，受养殖渔业的影响，海水中也存在不同程度的土霉素 污染，特别是海洋沉积物中土霉素含量更高，达到5 0 0i t g k g 4 0 0 0 1 x g k g 。g i o r g i a 等【3 4 j 曾报道，在意大利某水产养殖场附近的底泥中检测到土霉素的最高浓度为 2 4 6 3p g k g 。因此，水体环境中土霉素的残留已成为一个不容忽视的问题。且大 剂量或长期使用时会造成畜禽肝功能损害及二重感染，从试验结果也可看出， 虽然土霉素的急性毒性小于阿散酸，但在所设的浓度范围，能诱导鲫鱼肾细胞 严重的d n a 损伤，这表明土霉素可能有较强的基因毒性【3 5 】。 1 1 3 土霉素在环境中的暴露和归趋 据研究报道，对肉用动物使用的抗生素有2 5 7 5 以母体药物的形式从粪 便中排出体外。这些药物及其代谢物在环境中进行蓄积、迁移和转化，以及在 食物链中逐级浓缩，对生态系统造成不良的影响 3 6 】，图1 2 是兽药在环境中的暴 露途径。 土壤中土霉素的主要来源为含有土霉素的畜禽粪便、污泥和废弃物的土地利 用。土霉素在土壤中的残留主要受光照、温度、与土壤的结合和吸附能力、降 解速率和解吸性等影响【2 1 。 在不同的环境条件下，土霉素都会发生一种或多种降解反应。土壤中的降解 方式主要包括生物降解和非生物降解。非生物降解包括光解和水解。j i a o 等 3 7 】 研究表明，土霉素在土壤中的光解作用依赖于土壤溶液p h 的高低，p h 增高时， 光解作用加强。同时，在土壤溶液中存在硝酸盐和低浓度的可溶解的有机物时， 第一章引言 土霉素的光解也加强。在土壤环境中光降解可在土壤表层几厘米和液体粪肥表 面发生作用，但在土壤深层，由于光很难到达，因此光解对土壤中土霉素的影 响较小。 田 它 o 匕 一 。 田 盈 “。 n h c 力 渔场集约化畜禽场 散养牧场 - - _ - 一 1r 畜禽粪废弃物处理 1r +1r 污水和底泥处理后的粪污 畜禽害 心上 农田或牧场土壤 jl 么i 哥i 水心爿地下水 t 水生生物人类健康土壤生物 图1 2 兽药在环境中的暴露途径 f i g 1 2p o s s i b l ee x p o s u r er o u t e so fv e t e r i n a r ym e d i c i n ei ne n v i r o n m e n t 水解也是兽药在环境中发生降解的一个重要的非生物降解机制，有研究表明 土霉素在土壤间隙水中可以发生水解，水解过程受到土壤类型、p h 、离子强度 等影响。x u a n 等3 8 1 研究表明，土壤溶液p h 和温度是影响兽药土霉素水解的主 要因素，温度越高，水解越快，且兽药土霉素在中性溶液下的水解速度快于酸 4 第一章引言 性与碱性条件。但水解过程主要发生在水体环境中，在土壤中所起作用较小。 生物降解是兽药抗生素在环境中降解的最重要的途径。生物降解主要有植物降 解和微生物降解两种方式。土霉素在有氧条件下更容易进行，而在无氧活性污 泥、表层水体和土壤中的降解速率相似或者稍低于在有氧条件下的降解，微生 物降解中耐药细菌起最重要的作用。 吸附是四环素类抗生素在环境中迁移和转化的重要途径，在土壤中进行的吸 附过程反映了兽药与土壤的相互作用，同时可用于预测兽药对环境的影响程度。 四环素类抗生素一般含有多个可离子化功能团，在不同p h 条件下，会以不同离 子形态存在，根据图1 1 ，土霉素含有6 个o h 、2 个c = o 、1 个c o n 2 和1 个 - n ( c h 3 ) 2 ，其中带正电的n ( c h 3 ) 2 部分可通过静电与土壤中带负电的吸附位点作 用，或通过与土壤表面附着的阳离子发生交换而被吸附，分子中的一o h 和一c o n h 等功能基团，可在多价态金属离子键桥的作用下吸附到土壤中的负电荷吸附位。 土壤中有机质对四环素的吸附作用非常强，吸附作用的强弱与土壤类型和有 机质种类直接相关。鲍艳宇 19 】采用批量平衡方法，研究了土霉素在原土及去除 有机质土壤中的吸附和解吸。结果表明，土霉素在原土和去除有机质土壤中的 吸附和解吸等温线均不同程度地偏离线性模型，其中f r e u n d l i c h 模型可以对吸附 和解吸数据进行良好的非线性拟合，在不同土壤以及不同土壤处理中的拟合相 关系数( r ) 均达到极显著水平。去除有机质能够降低土霉素在土壤中的吸附容 量( 1 9 k f ) ，但增加了吸附强度( 1 n ) 。土霉素在土壤上的解吸过程存在明显的 滞后现象，在所设土霉素浓度范围内，土霉素在褐土和红壤中的平均滞后系数 ( 观) 分别为o 0 3 9 和0 0 1 5 ，去除有机质后的褐土和红壤对土霉素的解吸滞后 现象显著增强( p 可交换态 水溶态的规 律。鲍艳宇等【3 9 】在水溶液和土壤( 褐土) 培养条件下，测定了四环素和土霉素 对小麦种子发芽、根伸长和芽伸长的影响( 抑制率) 。结果表明，在不同介质 中，发芽率、根伸长和芽伸长对四环素和土霉素的生态毒性敏感顺序依次为根 第一章引言 伸长 发芽率 芽伸长，其中根伸长抑制率是评价2 种抗生素生态毒性较好的指 示指标。土壤对四环素类抗生素有很大的缓冲性，对土霉素的缓冲能力高于四 环素。小麦的根伸长抑制率( 或芽伸长抑制率) 与抗生素的浓度之间均存在明 显的剂量效应关系，四环素和土霉素在水溶液中对根伸长1 0 抑制浓度( 1 c l o ) 分别为2 5 8 8m g k g 、2 4 2 2m g k g ，在土壤中分别为3 7 7 8 0m g k g 、7 1 7 6 0m g k g 。 第二节荧光定量p c r 技术 p c r 是聚合酶链反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 的缩写，是一种在生物 体细胞外通过酶促合成特异d n a 或d n a 片段的方法，又称多聚酶链反应、无 细胞克隆技术等【4 0 1 。1 9 8 5 年美国p e c e t u s 公司的m u l l i s 及其同事发明p c r 技 术，此后研究人员一直致力于用其进行核酸精确定量。1 9 9 1 年h o l l a n d 等首次运 用不可延伸的寡核苷酸杂交探针与模板结合，然后利用d n a 聚合酶的5 一3 核 酸外切酶活性将探针切断，使探针的能量传递结构被破坏发出荧光来定量p c r 产物。1 9 9 2 年h i g u c h i 等在p c r 反应管中加入e b ，反应进行过程中，p c r 产 物增加，e b 与d n a 双链结合发出荧光强度也逐渐增加。他们通过连续照相动 态观察荧光强度的变化，并以此定量p c r 产物的多少，成为最早的实时定量 p c r 。1 9 9 6 年h e i d 等首先报道了t a q m a n p c r 的原理及方法。同年，美国a p p l i e d b i o s y s t e m s 公司推出商用实时定量p c r ( t a q m a n p c r ) 系列。之后，人们又设 计出不同的荧光探针，如分子信标技术( m o l e c u l a rb e a c o n ) 、l i g h tc y c l e rp c r 等。 随着研究的不断进展，研究人员不仅定量d n a 分子，还定量r n a 分子，从而 进一步定量基因的表达【4 1 j 。 定量p c r 不仅单指数性扩增r n a ，而且通过借助染料标志和特定的计算机 和软件设备检测每个循环p c r 产物的总量来达到很好的定量【4 2 】；不仅克服了使 用凝胶电泳等常规p c r 的不足，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能 实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点 4 3 1 。 1 2 1 荧光定量p c r 技术原理 实时荧光定量p c r ( r e a l - t i m ef l u r e s c e n tq u a n t i t i v ep o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n ，f q p c r ) 是通过在p c r 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的 6 第一章引言 变化实时检测p c r 扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过a 值和标准 曲线的分析对起始模板进行定量分析。循环阈值a 值( c y c l et h r e s h o l d ) 即p c r 扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，它 与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，模板d n a 量越多，荧光达阈值的循 环数越少，即q 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此 只要获得未知样品的q 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数【4 4 1 。 ( 如图1 3 ) 所示当信号增强到某一阈值( 根据荧光信号基线的平均值和平均标 准差，计算出以9 9 7 的置信度大于平均值的荧光值，即为阈值) ，此时的循环次 数即循环阈值a 。 1 02 03 0 p c ro d en u m b e r 图1 3q 值的确定 4 5 】 f i g 1 3d e f i n i t i o no f 呸v a l u e 4 5 】 按照荧光产生的原理，可将f q p c r 分为非特异性d n a 结合染料法和探针 法。目前国内外常用的荧光定量p c r 技术包括s y b r 荧光染料法以及荧光探针 法中的t a q m a n 技术、m o l e c u l a rb e a c o n 技术、杂交探针法 4 6 1 。 本实验将采用的s y b r 荧光染料法，其原理是利用荧光染料染色d n a 双链 结构，使荧光信号与被检测样品中d n a 含量成正比的原理进行定量。在d n a 双链结构的小沟中，当荧光染料处于游离状态时，检测不到荧光信号，当它与 d s d n a 结合后荧光强度明显增强，即被荧光探测系统检测到，荧光信号强度的 7 加 啦 叭 一一芒拭尘宝c kgbml d a z! 一e 8z 第一章引言 增加是与初始模板量相关的，由此可以进行定量d n a 分析 4 7 。例如s y b r 荧光 染料能特异性地掺入d n a 双链，发出荧光信号，而不掺入链中的s y b r 荧光染 料分子不会发出任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与p c r 产物的增加完 全同步。 s y b rg r e e ni 的优点：成本较低，不需合成和标记探针；适合初步筛查。 s y b rg r e e ni 的缺点：特异性差，不能分辨主带与杂带，给出的是总信号，所 以在低样本浓度时，不能进行基因突变分析；不能做多重检测，每孔只能检测1 个目标基因；灵敏度低，适合于5 0 0 0 拷贝以上的基因定量。 1 2 2 实时定量p c r 实验数据的分析方法 现在最常用的两种分析实时定量p c r 实验数据的方法是绝对定量和相对定 量。绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经 过处理的样品和未经处理的样品之间的表达差异。2 - a a c , 方法是实时定量p c r 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法 4 8 】。 1 2 2 1 标准曲线法 将标准品稀释成不同浓度的样品，并作为模板进行p c r 反应。以标准品拷 贝数的对数值为横坐标，以测得的c 值为纵坐标，绘制标准曲线。对未知样品 进行定量时，根据未知样品的e 值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。质 粒d n a 和体外转录的r n a 常作为绝对定量的标准品【4 9 】。 1 2 2 22 - z x z x c , 法 ( 1 ) 推导 目标基因的p c r 指数扩增的公式是： z n = 2 7 0 + ( 1 + e 。) ” x n 是第佗个循环后目标分子数；是初始目标分子数；乜是目标分子扩增 效率；礼是循环数。所以， x t = x 0 ( 1 + e x ) q ，。= k 。 ( 1 2 ) 吒是目标分子达到设定的阈值时的分子数；q 。是目标分子扩增达到阈值时 第一章引言 的循环数；k z 是一个常数。 对于内参反应而言，也有同样的公式： 用黾除以r 得到： r = r o ( 1 + e ) q ，= 群( 1 3 ) 旦：笠：k r巧 ( 1 4 ) 然而常数k 并不一定等于1 。假设目标序列与内参序列扩增效率相同： 或者 e 。= e r = e 石x o 0 + e p q k ( 1 5 ) ( 1 6 ) 。( 1 + e ) q = k( 1 7 ) 过均一化处理过的初始目标分子量；e 表示目标基因和内标基因q 值的差 异( c t 厂q ，) 。 由( 1 6 ) 整理可得， z 。= k ( 1 + e ) 一q( 1 8 ) 最后用任一样本口的除以参照因子c b ( c a l i b r a t o r ) 的得到， = ( 1 + e ) - a a c t ( 1 9 ) z n c 6 在这里如果优化条件使得扩增效率接近于1 ，则目标序列的量通过内均一化 处理之后相对于参照因子而言就是： a m o u n to ft a r g e t = 2 - a a q ( 1 1 0 ) ( 2 ) 方法的假设和应用 要使q 计算方法有效，目标序列和内参序列的扩增效率必须相等。看两 9 第一章引言 个反应是否具有相同的扩增效率的方法是看他们模板浓度梯度稀释后扩增产物 q 如何变化。对于每一个稀释样本，都用g a p d h 和c m y c 特异的荧光探针及 引物进行扩增。计算出c - m y c 和g a p d h 的平均q 值以及q 值，通过c d n a 浓 度梯度的对数值对q 值作图，如果所得直线斜率绝对值接近于0 ，说明目标基 因和内标基因的扩增效率相同，就可以通过q 方法进行相对定量( 图1 4 ) 。 图1 4c d n a 样品在1 0 0 倍稀释范围内的实验结果h 8 1 f i g 1 4a m p l i f i c a t i o no fc d n as y n t h e s i z e df r o m d i f f e r e n ta m o u n tso fr n a 【4 8 上图中，直线斜率是o 0 4 7 ，因而假设成立，a a c + 方法可以用来分析数据。 如果两个扩增反应效率不同，则需要通过定量标准曲线和绝对定量的方法来进 行相对定量；或者也可以重新设计引物，优化反应条件使得目标序列和内参序 列具有相同的扩增效率。 在做实时定量p c r 实验分析基因表达的时候首先明确的就是：数据最后会 以一个什么样的形式得到。如果需要知道绝对的拷贝数，就必须用绝对定量的 方法，否则只需要给出基因表达相对量就足够了。相对定量可能比绝对定量要 更容易一些，因为它不需要作标准曲线。本实验的定量方法即是2 - a z x c , 法。 6 s 4 3 2 l 0 9 8 7 6 s 4 3 3 3 3 3 3 3 2 2 2 2 2 2 u 勺 第一章引言 1 2 3 荧光定量p c r 技术的应用 聚合酶链式反应技术( p c r ) 自1 9 8 5 年问世以来，以其灵敏性、特异性和 快速性在医学和分子生物学等领域得到广泛的应用 5 0 巧1 1 。特别是实时荧光定量 p c r ( f q p c r ) 技术的出现实现了p c r 从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、 灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为分子生物学 研究中的重要工具，目前广泛应用于科学研究的各个领域。 1 2 3 1 实时荧光定量p c r 技术在基因定量表达中的应用 实时荧光定量p c r 技术的出现不仅加强了有关对基因的量的研究方法，而 且也加强了对基因的质所发生变化的研究。它可以检测基因突变和基因组的不 稳定性，已经被广泛应用于遗传分析。 毛晓露等【5 2 j 利用荧光定量p c r 法分析2 1 例p c a 组织、3 9 例良性前列腺增 生( b p h ) 组织d d 3m r n a 和p s am r n a 的表达，标准曲线对d d 3m r n a 、 p s a m r n a 和d d 3m r n a p s a m r n a 诊断p c a 的价值进行分析。p c a 组织d d 3 m r n a 和p s am r n a 表达量均增加，但组织中d d 3m r n a 的定量检测更具诊 断价值，联合检测有利于提高诊断敏感性，对p c a 的诊断具有一定临床应用价 值。田声望等【5 3 1 采用s y b rg r e e n 和t a q m a n 探针技术探讨非小细胞肺癌 ( n s c l c ) 组织e r c c l 调控区基因s n p 位点与正常对照胚系相应基因的分布 状态，以及肺癌组织e r c c l 基因m r n a 表达与其基因分型的关系。结果显示 e r c c l 基因m r n a 在7 0 的n s c l c 组织中呈低水平表达；肺癌组和正常对照 组在位点r s 3 2 1 2 9 8 6 上基因型和等位基因频率组间分布无显著性差异，而在位点 r s 3 2 1 2 9 4 8 上的等位基因频率分布有显著性差异( k o 0 5 ) ；肺癌组e r c c l 调控 区上述基因型与m r n a 定量表达无显著关联。穆瑞瑞等【5 4 】用实时荧光定量 r t - p c r 方法验证h 2 4 的外排泵e m r e 基因m r n a 表达水平和耐药的相关性，得 到e m r e 基因的相对表达量为内参基因g a p a 的2 万多倍；同一标本重复扩增， e m r e 和g a p a 基因相对拷贝数的平均变异系数分别为1 4 和1 3 ，提示本方法 可准确检测二者的相对拷贝数。同时由e m r e 基因的高表达可以推断它与志贺菌 的多耐药有正相关性，推断结果与以前通过克隆e m r e 基因的方法得到的结果一 致。柳玲【5 5 】应用实时荧光定量r t - p c r 技术检测实验组在位与异位内膜组织，及 对照组在位子宫内膜组织中h l a g m r n a 的表达，2 - 6 e , 法分析结果，得出 第一章引言 h l a g m r n a 在实验组在位与异位内膜组织中的表达均明显高于对照组 ( 萨o 0 5 ) ，两者比值约为3 1 5 ：l 。实验组在位与异位内膜组织中的表达无明显差 异( p 0 0 5 ) ，所以h l a g m r n a 的表达异常可能与e m 发病有关。张俭斌等【5 6 应用荧光定量r t - p c r 方法，研究c r b n 基因与常染色体隐性遗传非综合征轻 型精神发育迟滞( a r n s m r ) 的关系，探讨小鼠c r b n 基因m r n a 在不同组织 中的表达情况，得到结论小鼠c r b n 基因m r n a 在肺、大脑中表达量较高，在 心脏中表达量最低并且小鼠c r b n 基因广泛表达于不同组织，除了与学习、记 忆功能相关外，可能还有其他功能。张薇等【5 7 】利用r t - p c r 的方法研究小麦籽粒 灌浆期高分子量谷蛋白1 2 亚基基因m r n a 的表达水平，得到结论东农7 7 4 2 的 1 2 亚基在开花后6d 出现m r n a 的表达，花后1 4d 表达量最高。新克旱9 的1 2 亚基m r n a 的表达出现在开花后1 0d ，1 8d 表达量达最高。在籽粒灌浆的各个 时期，东农7 7 4 2 的1 2 亚基基因的m r n a 的表达量均明显高于新克旱9 。 1 2 3 2 实时荧光定量p c r 技术在环境监测中的应用 荧光定量p c r 可以用来检测环境中微生物在河流中随季节的变化情况【5 8 】。 t a y 等利用特异性1 6 sr d n a 引物扩增两种甲苯降解菌。荧