兽医微生物综合实习实验报告作业.doc

华南农业大学实验报告实验项目名称：兽医微生物综合实习 所属课程名称：兽医微生物学学生姓名：杨滨 学号：200730330126 专业年级：07动医（1）班 成绩：一、实验目的1掌握营养肉汤、血琼脂平板、麦康凯平板、普通琼脂、三糖铁层琼脂的配置方法。2细菌的分离培养技术（解剖、病料的采集，从组织中分离细菌、培养细菌、移植细菌、纯化细菌，细菌接种）。3细菌的鉴定技术（光学显微镜油镜的技术，组织涂片，在组织材料中认识细菌、辨别细菌、生化实验、血清学实验技术及细菌片的涂片、染色、镜检等技术）。4病毒的鸡胚分离培养技术（鸡胚死活的鉴定、鸡胚的接种、胚液的收集）病毒的血凝试验和血凝抑制试验。5认识真菌（酵母菌、青霉菌、曲霉菌、毛霉菌、根霉菌）的形态。二、实验要求1通过本次综合实习全面系统地掌握兽医微生物学的基本技术和细菌检验的基本程序，掌握各种生理生化试验的原理及试验方法，将理论与实践有机统一。2加强对临床常见病原菌鉴定本领的操作训练。3熟练掌握微生物实验常用仪器的使用及培养基制备的原则和方法。4对每一步实验要认真对待，对实验结果应详细记录，仔细分析，以便得出正确的鉴定结论，实习结束后，全面总结并写出实习报告。三、实验内容1细菌的分离及诊断2病毒的分离及诊断3真菌的观察四、实验材料与设备1实验材料 (1) 无菌注射器、抗凝剂、健康鸡、健康兔、血琼脂基础、锥形瓶、蒸馏水、麦康凯琼脂粉、三糖铁琼脂粉、营养琼脂粉、营养肉汤基础、雏鸡、小白鼠、木板、图钉、剪刀、接种环、接种针、镊子、各种染色液、移液枪、葡萄糖培养管、蔗糖培养管、乳糖培养管、甘醇培养管、靛基质培养管、硫化氢培养管、H2O2、氧化酶试纸、巴氏杆菌标准毒、巴氏杆菌阳性血清、靛基质指示剂、载玻片、显微镜等(2) 装有不明病毒的80编号小管一支、9-10日龄鸡胚、打孔器、一次性注射器、剪刀、记号笔、镊子、灭菌乳钵、离心管、空平皿、玻璃沙、空试管几支、西林瓶、青霉素、移液管、锥型瓶、U型96孔微量反应板、蛋架(3)载玻片、接种环、酵母菌玻片、青霉菌玻片、曲霉菌玻片、毛霉菌玻片、根霉菌玻片、镊子、盖玻片、显微镜2实验设备高压消毒炉、恒温培养箱、离心机、电子天平、冰箱、轻微振荡器五、实验方法和步骤（一）细菌的的分离及诊断1实验前准备（此步分量为一组6个人）（1）心脏采血：触摸健康兔左前肢以下、胸骨以上、靠左的位置，通过心跳感觉心脏位置，用碘酒、酒精棉球消毒，用无菌注射器抽取1ml抗凝剂，并润湿注射器，待酒精干后，将针插入，边插边回抽，当有血冲上针筒时，即抽取血9ml，用作血平板。(2）血琼脂平板：称取琼脂基础3.3g，加100ml蒸馏水，加热溶解，倒入锥形瓶，高压灭菌15min，待冷却至50，加入无菌脱纤维鸡兔血10ml，摇匀，倾注至灭菌平皿。 (3)麦康凯平板：称取麦康凯琼脂粉14.3g，加600ml蒸馏水，加热溶解，倒入锥形瓶，高压灭菌15min，倾注至灭菌平皿。（实验室准备） (4)三糖铁琼脂：称取三糖铁琼脂粉15g，加240ml蒸馏水，加热溶解，分装到试管，每支约10ml，高压灭菌15min，趁热摆斜面，待其凝固。（实验室准备） (5)营养肉汤：称取营养肉汤基础4.4g，加200ml蒸馏水，加热溶解，分装到试管，每支约10ml，高压灭菌15min。（实验室准备）2分离培养 取一因细菌感染而致死的小鼠，腹部向上固定于木板上，用酒精棉球消毒体表，打开腹腔，暴露肝脏，用剪刀夹一燃烧酒精棉球，在肝脏表面烫之杀死表面杂菌，用灭菌接种环插入烧灼部，将接种环旋转1圈，然后取材划线接种于血琼脂平板上，置37温箱培养24h。3形态与染色小鼠作分离培养后，用灭菌镊子和剪刀取一小块肝脏，作组织涂片，进行瑞氏染色，镜检。观察细菌形态特征。4肉汤增菌培养观察血琼脂平板上的细菌菌落形态特征，然后用灭菌接种环挑取可疑菌落，涂抹到载玻片上，进行革兰氏染色，镜检。用灭菌接种针环挑取可疑菌落，接种到加有血清的营养肉汤，摇匀，置37温箱培养24h。5生化实验 观察肉汤变化情况，用灭菌接种环取肉汤中已纯化细菌，涂抹到载玻片上，进行革兰氏染色，镜检。进行生化试验。 (1)用灭菌接种环取肉汤中已纯化细菌，分别在麦康凯平板、营养琼脂上划线 (2)用灭菌接种针取肉汤中已纯化细菌，分别在葡萄糖培养管、蔗糖培养管、乳糖培养管、甘醇培养管、靛基质培养管、硫化氢培养管进行穿刺 (3)用灭菌接种针取肉汤中已纯化细菌，在三糖铁琼脂上进行划线并穿刺。 将所有生化培养管及培养皿，置37温箱培养24h。6氧化酶和触酶试验用氧化酶试纸按压于菌落之上，若试纸变色则为阳性。取过氧化氢滴加菌落，若产生气泡，则为阳性。7观察生化实验结果。往靛基质培养管滴加指示剂，观察变化，其它生化管直接进行观察。（二）病毒的实验诊断1实验前准备(1)心脏采血：触摸健康鸡左翼以下、胸骨以上、嗉囊靠左的位置，通过心跳感觉心脏位置，用碘酒、酒精棉球消毒，用无菌注射器插入，边插边回抽，当有血冲上针筒时，即抽取鸡血23ml，装入密封管中，用于血清得制备；用无菌注射器抽取1ml抗凝剂，并润湿注射器，用同样方法取鸡血9ml，并装入离心管中，用于鸡红细胞的制取。 (2)血细胞悬浮液：往无菌离心管注入23ml鸡血，再加入4ml生理盐水，摇匀，放入离心机以2000r/s离心10min，然后取出离心管并用无菌注射器吸去其上清液，重复4次。用移液枪吸取1ml血细胞到100ml无菌玻璃瓶中，再加入99ml生理盐水，冷藏。2病毒病料的采集 通过无菌手术，取病鸡的脾脏、肝脏、肺、脑的组织块，将其剪碎后，加入少量玻璃砂研磨，然后加入4ml生理盐水和双抗各0.01ml，用注射器将其注入离心管，以10000r/s进行离心10min。3. 接种接种鸡胚，采用绒毛尿囊腔接种，通过照胚检测鸡胚死活，在气室边缘避开胚体和血管处作一记号，作为接种的部位，碘酒、酒精消毒，并用打孔器在此处打孔；用1ml注射器吸取病毒液0。1ml，注射器沿小孔插入鸡胚约1。5CM，注入病毒液以胶布封孔，置于37。C温箱中直立培养。4.观察已接种鸡胚24小时后观察鸡胚未死亡。5.处理已接种鸡胚接种48小时后观察鸡胚已死，将鸡胚置4。C冷冻过夜。6.收胚收获病毒液。采用无菌手术去气室顶壳，开口直径为整个气室大小，用无菌镊子撕去部分蛋膜，撕破绒毛尿囊膜而不撕破羊膜，用镊子轻轻按住胚胎，用消毒注射器吸取尿囊液，置于西林瓶中，备用。解剖胚胎。7.血凝及血凝抑制试验采用1%红细胞，以及新城疫的血清和禽流感血清，按下表操作。 血细胞凝集试验（HA）（单位：l）孔号123456789101112稀释度1：21：41：81：161：321：641：1281：2561：5121：10241：2048对照生理盐水病毒50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 弃鸡红细胞505050505050505050505050用轻微震荡器震荡12min， 放入37箱中1530min.判断1个单位血凝价,并配成4个单位病毒溶液.血细胞凝集抑制试验（HI）（单位：l）孔号123456789101112稀释度1：21：41：81：161：321：641：1281：2561：5121：10241：2048对照生理盐水新城疫血清50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 弃4单位病毒505050505050505050505050用轻微震荡器震荡12min，放入37培养箱中1530min鸡红细胞505050505050505050505050用轻微震荡器震荡12min，放入37培养箱中1530min。（三）真菌的形态观察直接在显微镜下观察酵母菌装片、青霉菌装片、曲霉菌装片、毛霉菌装片、根霉菌装片。六、实验结果与分析(一) 细菌的的分离及诊断1瑞氏染色后，显微镜观察到蓝色、两极浓染的球杆菌2在血琼脂平板上培养24小时后，长出灰白色、湿润、有光泽、露珠状的小菌落3对血琼脂平板上的菌体革兰氏染色后，显微镜观察到红色、两极浓染的球杆菌4在营养肉汤中培养24小时后，原本清亮的液体变为浑浊，说明菌体在营养肉汤中大量繁殖5对营养肉汤中的菌体革兰氏染色后，显微镜观察到红色、两极浓染的球杆菌，说明该菌是革兰氏阴性菌。6生化试验结果：培养基类型三糖铁麦康凯葡萄糖蔗糖乳糖甘醇靛基质硫化氢现象+-三糖铁琼脂：培养基底部变黄，说明产酸，但不产气，不产硫化氢，可能被污染麦康凯平板：不生长葡萄糖生化管：由原本的紫色变为黄色蔗糖生化管：由原本的紫色变为黄色乳糖生化管：原来的紫色变浅甘醇生化管：由原本的紫色变为黄色靛基质生化管：滴加指示剂后，产生玫瑰红色硫化氢生化管：由于缺乏硫化氢指示剂，无法对硫化氢一项做出判定，该培养管并未变色。7氧化酶和触酶实验：氧化酶试纸变紫色，为阳性；而触酶试验产生气泡，为阳性。以上结果与课本对照后较为接近，极有可能是巴氏杆菌。（二）病毒的实验诊断124小时后检查鸡胚未死亡，说明实验操作严格无菌操作，未感染其他细菌。2鸡胚收获及解剖打开蛋壳后,提取病毒。同时接种老师提供的病毒3HA试验：HA试验结果如下表：（结果第一排为自己所收病毒液，第二排为老师所给病毒：）孔号123456789101112稀释度1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121：10241:2048血细胞对照结果# # #+- 结果：自己所收病毒血凝价为1：256。老师所给病毒血凝价为1：128。4.HI试验HI试验结果如下表：（结果第一排为自己所收病毒液，第二排为老师所给病毒）孔号123456789101112稀释度1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:1024病毒对照血清对照结果-+-+-#+#+#-#-#-结果：自己所收病毒的HI效价为1：32。老师所给病毒的HI效价为1：128。 (三)真菌的形态观察酵母菌青霉菌曲霉菌 根霉菌毛霉菌七、实验总结1通过本次实验可了解并熟悉检验位置菌种的方法，推断菌种时要综合分析 可能污染杂菌的实验要重复进行。病毒的接种及吸取尿囊液时，要注意保持无菌操作，以防带进其他细菌，影响实验结果。2在实验过程中，我就被灌输了很强的意识：一进到实验室中，就要尽可能地做好一切保护措施，这是保护自己的基本条件和要求。3实验中所涉及的基本实验操作，我们都要清楚了解并且知道其中的原理，这对于我们来说尤为重要。4实验中必然会遇到一些