（环境工程专业论文）基于水生动物的苯系物水环境基准值研究.pdf

摘要 摘要 从水环境标准体系来看，我国是一个“只有环境质量标准，而没有污染环 境修复标准 的国家。通常采用环境质量标准来判断污染环境修复工作是否达 到要求，特别是指导对应急环境问题的处理又太不现实，容易出现“欠保护 与“过保护 的问题。 苯系物( b t e x ) ，包括苯( b e n z e n e ) 、甲苯( t o l u e n e ) 、乙苯( e t h y l b e n z e n e ) 和二甲苯( x y l e n e ) ，属于单环芳烃类物质，主要存在于原油和石油产品( 如天 然气) 中，也作为工业原料广泛应用于农药、塑料和纤维合成等行业中。近年 来，由于此类物质的广泛使用，我国水环境中苯系物的污染问题日益严重，其 含量逐年升高，对水生生态系统和人体健康产生了重大危害。 本论文选择水环境中典型有毒污染物b t e x 作为研究对象，就我国污染水体 修复基准的研究作初步尝试。论文选择大型潘、颤蚓、斑马鱼和鲫鱼四种水生 生物作为受试生物，对其进行了急性和慢性毒性试验。通过急性毒性试验研究 发现水环境中苯系物对水生生物都有很大的毒性作用，呈明显的剂量一效应关 系。实验得到甲苯对大型潘、颤蚓、斑马鱼和鲫鱼四种生物的半数抑制( 致死) 浓度分别为：1 3 6 9 、1 7 0 4 、7 7 5 和3 3 6 m g l ；乙苯对大型潘、颤蚓、斑马鱼和 鲫鱼四种生物的半数抑制( 致死) 浓度分别为：4 2 9 、3 8 8 、3 1 o 并f 1 2 1 2m g l ；二 甲苯对大型潘、颤蚓、斑马鱼和鲫鱼四种生物的半数抑制( 致死) 浓度分别为： 5 0 3 、6 9 9 、3 4 8 和2 6 7m g l 。 同时，实验对颤蚓、斑马鱼和鲫鱼三种生物进行了2 1 天半静态慢性实验， 通过检测生物体内乙酰胆碱酯酶和抗氧化酶( s o d 、c a t 和g s t ) 等，以酶活作为 指标，指示水生生物长时间低浓度水平条件下受到苯系物污染胁迫的水平。试 验得到甲苯对颤蚓、斑马鱼和鲫鱼三种生物的慢性中毒阈值分别为：1 7 0 4 、7 7 5 和6 7 3 m g l ：乙苯对颤蚓、斑马鱼和鲫鱼四种生物的慢性中毒阈值分别为：7 7 6 、 3 1 2 和4 2 4m g l ；二甲苯对颤蚓、斑马鱼和鲫鱼四种生物的慢性中毒阈值分别 为：1 4 3 2 、3 4 8 9 1 5 7 4m g l 。 最终确定甲苯、乙苯和二甲苯的水环境质量基准最大浓度值分别为3 3 6 0 、 2 1 2 和2 6 7m g l 1 ，污染修复基准推荐值为2 3 6 、1 4 8 和1 8 7m g l ，环境质量基 准连续值分别为6 7 、3 1 和3 5 m g l 。参考水体中苯系物的相关标准值，认为用 摘要 酶活变化作为指标确定长时间低剂量污染物质环境质量基准值的方法是可行 的。 关键词：环境基准水环境质量基准污染水体修复基准苯系物生态毒理学 i i a b s t r a c t ab s t r a c t t h e r ea r eo n l ye n v i r o n m e n t a l q u a l i t yc r i t e r i o n s , n oc r i t e r i af o rm a n a g i n g c o n t a m i n a t e ds i t e st ov a l u et h e e f f i c i e n c y o ft h er e m e d i a t i o ni nc h i n a a n d e n v i r o n m e n t a lq u a l i t yc r i t e r i o n sw e r eu s e do f t e nt oj u d g et h er e m e d i a t i o ne f f i c i e n c y , w h i c hw a su n r e a s o n a b l e b e c a u s e u n d e r - p r o t e c t i o n o r o v e r - p r o t e c t i o n o fs o m e p o l l u t e ds i t e so f t e nh a p p e n e da c c o r d i n gt h ee n v i r o n m e n t a lq u a l i t yc r i t e r i o n s m o n o c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n ss u c ha sb e n z e n e ，t o l u e n e ，e t h y l b e n z e n ea n d x y l e n e s ( b t e x ) a r ec o m m o n l yu s e di nt h eb l e n d i n go fp e t r o la n da l s ou s e da sa s o l v e n ta n dr a wm a t e r i a li nc h e m i c a l p r o d u c t i o ns u c ha sp a i n t s ，p o l y m e r sa n d p h a r m a c e u t i c a l s a sac o n s e q u e n c eo ft h e i rw i d eu s a g e ，t h e ya r ec o m m o nw a s t e m a t e r i a l s a n dh i g hl e v e l so fb t e xc o m p o u n d si na q u a t i ce n v i r o n m e n th a v eo f t e n b e e nd e t e c t e df r e q u e n t l y , a n dw h i c hl e a dt oh e a v e ne f f e c t st ot h ea q u a t i cs y s t e m sa n d h u m a n w ei n v e s t i g a t et h ea c u t ea n dc h r o n i ct o x i ce f f e c t so fb t e xt of o u ra q u a t i c o r g a n i s m s ，d a p h n i am a g n a ，t u b i ：c i d s ，b r a c h y d a n i or e r i oa n dc a r a s s i u sa u r a t u s a c u t er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e9 6 h l c s o ( 4 8 h e c s o ) v a l u e so ft o l u e n eo n d a p h n i a m a g n a ，t u b i f i c i d s ，b r a c h y d a n i or e r i oa n dc a r a s s i u sa u r a t u sw e r e13 6 9 17 0 4 ，7 7 5 a n d3 3 6 m g l r e s p e c t i v e l y ；t h e9 6 h l c s 0 ( 4 8 h e c s 0 ) v a l u e so fe t h y l b e n z e n eo i l d a p h n i am a g n a ，t u b i f i c i d s ，b r a c h y d a n i or e r i oa n dc a r a s s i u sa u r a t u sw e r e4 2 9 ，3 8 8 ， 31 0a n d2 1 2 m g l 1r e s p e c t i v e l y ；t h e9 6 h l c 5 0 ( 4 8 h e c s o ) v a l u e so f x y l e n eo nd a p h n i a m a g n a ，t u b i f i c i d s 声r a c h y d a n i or e r i oa n dc a r a s s i u sa u r a t u sw e r e5 0 3 ，6 9 9 ，3 4 8 a n d 2 6 7 m g l 1r e s p e c t i v e l y a l s o ，u n d e rt h ec o n d i t i o no ft h el a b o r a t o r ys i m u l a t i o n ，a c h ea n da n t i o x i d a n t d e f e n s e ss y s t e m ( s o d ，c a ta n dg s t ) i n f l u e n c e so f t o l u e n e ，e t h y l e n ea n dx y l e n et o r u b i ：c i d s ，b r a c h y d a n i or e r i oa n dc a r a s s i u sa u r a t u sa tl o wl e v e la f t e r21d a y sw e r e s t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tc o m p a r e dw i t hc o n t r o l ，t h ea c t i v i t yo fa c h e ，s o d ， c a ta n dg s tw e r ed i f f e r e n ts i g n i f i c a n t l y ( p 4 1 4 第。一章绪论 羟基3 甲氧基苯酸 4 羟基苯甲酸。m a r t i n e z v e l 缸q u e z 等 4 0 l 研究也发现，苯的 代谢物可以诱导小鼠淋巴细胞凋亡。实验发现，暴露于含苯代谢物的淋巴细胞 的存活性比对照组显著降低，且主要是苯的中间代谢产物己二烯己二酸协同污 染物诱导鼠淋巴细胞凋亡。 1 3 3 苯系物在环境中的迁移转化 由于b t e x 具有挥发性，地表水中的b t e x 会挥发进入大气中，残留的小部 分可以被生物降解，其中苯的生物降解的半衰期大约是几天到几周。进入大气 环境中的b t e x ，以气溶胶形式或以气体形式存在。一般用辛醇空气系数( k o a ) 来表示其在气溶胶和气体间的分配【4 1 1 。大气环境中存在的b t e x ，通过参与光化 学反应和干湿沉降等途径转化，并以光化学反应为主。b t e x 主要与h o 、n 0 3 和 0 3 。自由基反应，并且以与h o 自由基的反应为主。如苯与h o 自由基反应的生命 周期为9 4 d ，与n 0 3 自由基反应的周期大于4 年，与0 3 自由基反应的周期大于4 5 年。而且研究发现，b t e x 中不同的化合物反应降解速度也不同，在同样条件下 与h o 自由基反应，苯的周期是9 4 d ，甲苯的周期为1 9 d ，间二甲苯的周期仅为5 9 h 【1 1 】 o 土壤和地下水中的b t e x 从泄露点通过非饱和土层向下运移，在地下水位之 上形成高质量分数区，并沿地下水面侧向迁移，部分溶解的b t e x 在水体扩散。 地下水流动使得污染物b t e x 顺水迁移，导致其横向污染范围扩大，下游污染物 浓度增加而上游略有降低【4 2 1 。可见，地下水对b t e x 的迁移特征有一定的影响。 污染物b t e x 在迁移过程中能够自然衰减，影响因素主要有挥发、吸附、溶解和 生物降解等，其中生物降解是最主要的影响因素 4 3 j 。挥发作用主要是由于b t e x 分子量较低且具有较高的蒸汽压，容易从土壤或地表水表面蒸发进入大气中， 且以苯的挥发性最强。吸附作用主要是b t e x 吸附到土壤颗粒表面，而由于b t e x 不像脂肪族物质那样牢固地吸附到土壤基质中，容易溶解到地下水中，污染地 下水。 图1 5 描述了b t e x 在各环境介质中的迁移转化过程。其中，干湿沉降、蒸 发或挥发作用、吸附或解吸作用、溶解或沉积作用以及生物降解作用等，带动 了这类污染物的迁移转化。 第一章绪论 图1 5 b t e x 在环境中的迁移转化 b t e x 的生物降解既可以在有氧的条件下进行，也可以在无氧的条件下进 行。好氧生物降解反应容易受到氧气的限制时，通常单独的降解菌如恶臭假单 胞菌( p s e u d o m o n a sp u t i d a ) 不能将b t e x 完全降解【4 4 】，而目前研究发现恶臭假 单胞菌和荧光假单胞菌( 尸f l u o r e s c e n s ) 共同存在时，缺氧条件下也可以将苯和 甲苯完全矿化成c 0 2 和h 2 0 1 4 5 , 4 6 】。在有氧的情况下先进行有氧代谢，由于氧气消 耗的速率比其从大气或周围区域扩散到反应区域的速率小，一般都转入了厌氧 代谢。厌氧条件下的电子受体主要有n 0 3 。、s 0 4 2 - 4 7 1 、f e 3 + 和m n 4 + 【4 8 1 。因此，厌 氧条件下添加硫酸盐、络合三价铁离子或硝酸盐都会提高b t e x 的厌氧降解1 4 引。 豆俊峰和刘翔1 5 0 j 试验证明在硝酸盐还原条件下，苯系物b t e x 能够被反硝化混合 菌有效降解。在整个试验过程中，n 0 3 - 的消耗与苯、甲苯、乙苯、邻二甲苯、 间二甲苯、及对二甲苯生物降解之间的摩尔比分别为：9 4 7 ，9 2 6 ，1 1 1 4 ，1 2 4 6 ， 1 3 3 6 ，1 3 0 2 。 r o y c h o u d h u r y 和m e r r e t t ”j 研究发现，硫酸盐和三价铁是主要的 代谢途径。土壤中现在已经确定且分离出的降解菌主要有假单胞杆菌 ( p s e u d o m o n a ss p ) 、黄杆菌属( f l a v o b a c t e r i u ms p ) 和红球菌属( r h o d o c o c c u s s p ) 【5 2 】。丁克强等删研究发现，土著真菌f u s a r i u ml k ( 简称f ) 和真菌 p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p r i u m ( 简称p ) 可以对石油污染土壤中的石油进行降解， 经过一段时间的适应后，外来菌株p 对石油的降解速度超过土著菌株f ，15 0d 后p 和f 对土壤中石油污染物的降解速率分别达到7 0 1 和5 9 8 ，可以用于石油污 染土壤的生物修复。m a r g e s i n 等1 5 4 j 对土壤中b t e x 的生物降解速率进行了研究， 发现：乙耖甲苯 苯 对二甲苯，且n 、p 、k 肥料可促进b t e x 的降解，特别是对 苯和甲苯的降解；相反，亲脂性的肥料则会抑制其生物降解。b t e x 的降解动力 1 6 第一章绪论 学一般符合一级反应动力学模型，但g s d e k e 等【5 5 】研究却显示甲苯用莫诺动力学 模型比一级反应动力学更能模拟其过程。 在受污染环境中，降解b t e x 的微生物群落比较复杂。然而，并不是所有的 微生物都参与污染物的降解过程【5 酬。在污染带的边界区存在着的不同微生物群 落，可以降解从污染区迁移过来的b t e x ，从而减少了污染面积的进一步扩散【57 1 。 姚德明等1 5 8 】对辽河油田4 种不同类型原油污染的土壤中微生物类群分析发现， 石油污染土壤中，以利用石油烃为碳源的细菌数量比真菌数量多，但群落种类 没有真菌丰富。细菌以革氏染色阴性杆菌为优势，其中以动胶菌属为主，其次 黄杆菌属。革氏染色阳性杆菌以芽孢杆菌为主。真菌以毛霉菌属、小克银汉菌 属占优势。其次是镰刀菌属、青霉菌属、曲霉菌属，酵母最弱。放线菌以链霉 菌属为优势。从石油污染土壤生物处理系统中分离到的各类优势微生物均具有 降解石油烃的能力。同时，在微生物群落中添加优势真菌，可以提高生物处理 石油污染效果。在微生物降解b t e x 的同时，b t e x 也会对微生物群落的结构和 功能等方面产生影响。f e f i s 等 5 9 1 研究了受b t e x 污染的浅层含水层微生物群落的 多样性问题，结果表明，微生物群落结构依赖于多种相互作用的因素，如污染 物b t e x 的浓度以及c u 、k 、c a 和m g 等离子存在的量等；而且，b t e x 可以引起 微生物群落中种的变化，但不能改变整个群落。 第四节课题研究目的、内容及技术路线 1 4 1 课题研究目的及意义 从水环境标准体系来看，我国是一个“只有环境质量标准，而没有污染环 境修复标准”的国家。由于缺乏污染环境的修复标准，污染环境的修复效果评 价，特别是应急环境污染事故的处理，至今没有相应的修复标准或相应的法规 作为参照或作为依法环境管理的依据。而采用环境质量标准来判断污染环境修 复工作是否达到要求，特别是指导对应急环境问题的处理又太不现实，因此只 能“弄虚作假，结果事与愿违，与经济发展产生严重冲突，达不到环境保护的 目的，最终是环境越“保护”，问题越多，效果越差f l 邡】。另一方面，我国现行 的水质标准主要参考了美国、日本、苏联和欧洲以及w h o 的水质标准【6 1 1 ，基本 上没有体现符合我国实际的水生生态毒理学数据。从生态学观点看，不同的生 1 7 第一章绪论 态区存在对污染物敏感性不同的生态系统，对一个生态区无害的毒物浓度也许 会对其他生态区的生物产生不可逆转的毒性效应。因此，只参考美国等国家的 水生态基准数据来制定的我国水质标准，本身就缺乏充分的科学依据，更不能 作为评估污染修复效果的标准。 相比之下，美国和加拿大等发达国家在污染环境修复基准研究及标准制定 方面比较超前。尤其是，美国环保局近年来还启动了多项超基金发展计划，开 展了污染环境修复基准研究以及标准制定的工作，甚至不少州都在制定或已经 颁布了各自的修复标准。如康涅狄格州环保局已经颁布了修复标准规则 ( r e m e d i a t i o ns t a n d a r dr e g u l a t i o n s ) ，马里兰州环保部的自愿清洁规划( v o l u n t a r y c l e a n u pp r o g r a m ) 就涉及清洁标准( c l e a n u pc r i t e r i a ) 和州最大污染水平( s t a t e m a x i m u mc o n t a m i n a t i o nl e v e l s ) ，新泽西州正在制定修复、控制地表水和地下水 污染的最低修复标准( m i n i m u mr e m e d i a t i o ns t a n d a r d ) 。加拿大环境议会( c c m e ) 早在1 9 9 1 年就颁布了加拿大污染场地修复环境质量临时标准【6 2 1 ，以提高污 染场地的修复和评价的一致性，消除污染，保持、提高或保护环境质量和人体 健康。加拿大萨斯喀彻温省环保部于2 0 0 3 年颁布的土壤中b t e x 和p h c 组分 的临时标准，分别列出了基于土壤( 农业、居民区公园及商业t 业) 和地下 水用途( 淡水、灌溉用水、牲畜用水、饮用水和非饮用水) 的b t e x 的1 级基准、 表层土和下层土p h c ( f 1 f 4 ) 的加拿大宽量标准( c a n a d aw i d es t a n d a r d ) 和土 壤地下水中蒸发态吸入途径的风险管理标准。 污染环境修复标准的建立，将有助于缓解甚至从根本上解决我国环境保护 工作中长期存在的“欠保护与“过保护”之间的矛盾，以及由于“过保护” 对国家经济建设所造成的重大经济损失。 近年来，我国水环境中b t e x 的污染问题口益严重，其含量逐年升高，主 要来源于含有b t e x 的大气污染物的沉降，汽油或其他石油产品泄露以及各种 相关污染事件的发生，和化工厂的废水排放等。如2 0 0 5 年，由于中石油吉林石 化公司双苯厂发生爆炸事故，引起的重大松花江水污染事件，就有b t e x 的污 染问题。资料显示，我国水环境中广泛存在的b t e x 污染问题，已经构成对水 生生态系统和人体健康产生了重大危害。 因此，选择水环境中典型有毒污染物b t e x ，就我国水环境修复基准的研究 在国家层面上开展一次尝试，为我国今后系统开展污染水环境修复基准研究提 供示范，这对于我国经济可持续发展和构建和谐社会，特别对于生态安全和人 1 8 第一章绪论 体健康的保证，具有极其重要的实践意义。 1 4 2 课题研究内容 以我国水环境中最为重要的一类有毒化学污染物b t e x 为例，重点开展以 下2 个方面的研究： 1 ) 基于水生生物( 大型潘，斑马鱼，鲫鱼，颤蚓) 生态毒理学效应的研究； 2 ) 探索综合的适合我国实际的污染水体修复基准确立的方法。 1 4 3 课题研究技术路线 污染水体修复基准的确立是一项非常复杂的系统工程，它包括以保护人类 健康为最高目标的修复基准和以水环境生态安全为取向的水生态修复基准。本 项目重点研究水生态修复基准，选取合适的受试生物开展生态毒理学试验研究， 在科学合理的试验基础上，用数学模型、统计学等工具推算出受污染水生生态 系统的修复基准限值，同时探讨和建立适合我国实际情况的水环境污染修复基 准方法体系，为制定我国污染水环境修复标准提供科学依据，具体技术路线图 见图1 6 。 鱼类的慢性试验是其中重要的试验，我国拥有很多重要的经济鱼类，如青、 草、鲢、鳙、鲫等。虽然这些鱼类的生态、生理特性资料相对说来较为完整， 但由于一般慢性指标为生长、繁殖( 产卵数、孵化率等) ，这些鱼类从毒性试验 角度考虑，并不符合慢性试验用鱼的要求【6 3 1 。生物受到污染物污染胁迫时，会 在体内产生大量的自由基，生物体内的抗氧化系统可以清除体内多余的活性自 由基。当自由基的生产量超过了生物体内的清除能力时，就会导致氧化胁迫。 因此，一般通过抗氧化酶活性的变化可以间接反映环境污染的存在，作为环境 污染胁迫的指标。本实验试从污染物对鱼类体内抗氧化酶系统的影响角度，探 讨其作为确定水质基准指标的可能性。 1 9 第章绪论 1 4 4 课题研究创新点 确保数据完整 性和结构准确 性 确定水环境 b t e x 环境基 准推荐值 图1 6 试验技术路线图 总结 建立 水质 修复 基准 的方 法学 体系 1 ) 国内b t e x 研究过去主要集中在人体健康毒性、环境行为和降解机理等 3 个方面，关于b t e x 对水生生态系统影响的研究几乎没有。本论文选择了大型 涵、颤蚓、斑马鱼和鲫鱼4 种水生动物，研究了苯系物对其急性和慢性毒性效 应。 2 ) 国内缺乏对污染水环境修复基准的研究，更没有从国家层面上制定出 第。一章绪论 台污染环境修复标准。通过对b t e x 污染水体修复基准及其限值的研究，为b t e x 污染水体修复标准的制定提供科学依据，为以后类似研究提供参考。 3 ) 国内尚无污染水体修复基准方法学的研究。本项目通过参考国外相关先 进方法，探讨、构建适合我国实际的污染水体修复基准研究方法的初步框架， 为以后大规模开展污染水体修复基准研究提供样板。 2 1 第二章试验测定方法与数据处理 第二章试验测定方法及数据处理 2 1 1 主要试验仪器 第一节试验材料 t u 1 9 0 1 双光束紫外分光光度计，p t c 2 帕尔贴恒温控制器( 北京普析通用 仪器有限责任公司) ；h e t t i c h3 2 r 冰冻离心机( 德国h e t t i c h 公司) ；恒温水浴锅 ( 天津市中环实验电炉有限公司) ；s z 9 3 自动双重纯水蒸馏器( 上海亚荣生化仪 器厂) ；p b 1 0p h 计( s a r t o r i u s ) ；h q 1 0 溶解氧测定仪( 溶解氧测定仪) ；电子天 平( 北京赛多利斯仪器有限公司) 。 2 1 2 主要试验药品 g s h ，s d s 购于美国a m r e s c o 试剂公司；牛血清蛋白b a s ( b o v i n es e r u m a l b u m i n ) ，考马斯亮蓝g 2 5 0 ，吐温8 0 购于s i g m a ( 美国) ；d t n b ( 5 ，5 - d i t h i o b i s 2 - n i t r o b e n z o i e a c i d ) 购于t o k y o 化学试剂公司( 日本) ；c n d b ( 1 - c h l o r o 2 4 d i n i t r o b e n z e n e ) ，t b a ( 2 一t h i o b a r b i t u r i ca c i d ) ，t c a ( t r i c h l o r o a c e t i e a c i d ) ，购于i n t e r n a t i o n a ll a b o r a t o r y ( 美国) 。甲苯、乙苯和二甲苯及其他常用药 品，购于天津市津东天正精细化学试剂厂。 第二节酶活性测定方法 2 2 1 乙酰胆碱脂酶活a c h e 活性测定 a c h e 活性的测定采用e l l m a n ! “1 方法并稍作修改。碘化硫代乙酰胆碱被 a c h e 分解的产物硫代胆碱与d t n b 结合生成黄色络合物，于4 1 2 n m 处比色，以 酶促反应的初速度来确定酶的活性。 将受试生物脑组织置于玻璃匀浆器中，加入5 0 0 l 预冷的磷酸盐缓冲液( 含 第二章试验测定方法与数据处理 5 0 r e t o o l l 1 磷酸钠、1 0 0 m m o l l d 氯化钠、o 1 t r i t o nx 1 0 0 ，p h = 7 4 ) ，冰浴中 匀浆。匀浆液倒入1 5 m l 离心管中，4 。c 下1 0 0 0 0 r r a i n - 1 离心3 0 m i n 。上清液即为 粗酶液。吸取3 m l 磷酸缓冲液( o 2 t o o l l ，p h = 8 o ) 于1 0 m l 比色管中，依次 加入2 0 p l 碘化硫代乙酰胆碱( 7 5 m m o l l 以) 、1 0 0 p ld t n b 溶液( 2 0 r e t o o l l j ) ， 混合后加入1 0 0 此酶液，反应总体积为3 2 2 m l 。在波长4 1 2 n m 下，于1 c m 比色 皿中比色，测定时每隔o 5 m i n 读数1 次，连续测定3 m i n 。酶活力定义为每毫克 脑组织蛋白水解底物的p m o l 数，即： a c h e 酶活力( u m g 1 p - 。) = v x a x l 0 6 x k x l x c ) 式中，v 一反应体系的总体积( m l ) ，v = 3 2 2 ；a 一吸光度随时间的变化率 ( o d m i n d ) ；v 一加入酶液的体积( g l ) ，v = 2 0 ；k 一消光系数( l m m o l - 1 r a m - 1 ) ， k = i 3 6 ；l 一测定酶活力时溶液的光径长度，即比色皿光程( m m ) ，l = 1 0 ；c 一 匀浆液中脑蛋白的浓度( m g l 以) o 2 2 2s o d 活性测定 s o d 活性的测定，采用改进的邻苯三酚自氧化法1 6 引。取1 0 m l 试管，加入 1 0 m l5 0 m mt r i s h c l ( p h 8 2 ) 缓冲液，2 5 保温2 5 分钟；立即加入预热的5 0 此 2 0m m 邻苯三酚，迅速摇匀，倒入l c m 石英比色杯中，放在一号样品池，测定 邻苯三酚的自氧化速率。要求邻苯三酚的自氧化速率控制在0 0 7 0 d m i n 左右。 s o d 酶活测定样品池加入邻苯三酚前加入2 0 u l 待测酶液，参比池同邻苯三酚自 氧化速率测定。分光光度计设置时间扣描，在3 2 5 n m 波长下，每隔2 0 s 测定一次 吸光度，持续l m i n 。1 个酶活单位定义为2 5 0 c 下每毫升反应液中，每分钟抑制 邻苯三酚自氧化速率5 0 的酶量，并有蛋白进行矫正。 2 2 3 过氧化氢酶( c a t ) 活性测定 c a t 活性的测定采用徐镜波等陋6 1 的方法。分光光度计设置为时间扫描，在 2 5 0 n m 波长下，每隔1 0 s 测吸光度一次，连续一分钟。参比池为1 0 止酶样3 0 m l 磷酸盐缓冲液in l e m 石英比色杯中；样品池为1 0 此酶样3 0 m lh 2 0 2 磷酸盐缓 冲液i i 到l c m 石英比色杯中。1 个酶活单位定义为：在2 5 0 c 1 0 0 s 内使h 2 0 2 分解一 半时的酶蛋白量。 第二章试验测定方法与数据处理 2 2 4 谷胱甘肽硫转移酶( g s t ) 活性测定 g s t 活性测定采f f j h a b i g t 6 7 j 的方法。测定管中加入2 8m lo 1 m 磷酸缓冲液 ( p h 6 5 ) 、0 5m l2 0m m 还原型谷胱甘肽( g s h ) 水溶液及5 0 山酶样，混匀。2 5 预热5 分钟后，加入3 0m m l 一氯2 ，4 二硝基苯( c d n b ) 的乙醇溶液1 0 0 山，2 5 反应3 分钟后，加入3 3 三氯乙酸( t c a ) 0 3m l 终止反应。3 0 0 0r m i n 转速下 离心5 分钟，取上清液于3 4 0n l n 处比色，读取吸光度值。参照管先加入3 3 - - - 氯乙酸( t c a ) ，其他操作同上。1 4 - g s t 酶活力单位定义为：每m g 蛋白，扣除非 酶反应，每分钟使g s t 浓度下降1 u m o l l 。 2 2 5 脂质过氧化( m d a ) 活性测定 取组织匀浆液2 0 0 m l ，按如下顺序依次加入8 i s d s ，0 2 m l 2 0 醋酸缓冲 液( p h = 3 5 ) 1 5 m l ，i t b a l 5 m l ，双蒸水l m l 。将上述反应液于9 0 c 水溶液 6 0 m i n ，冷却后，3 0 0 0 r m i n 离心1 5 m i n ，取上清液于5 3 2 n m 处测定d o 值。计算： 脂质过氧化m d a 以nm o l t b a r s m gp r o 表示。克分子消光系数为1 5 6x1 0 5 。 2 2 6 蛋白质测定 蛋白含量测定采厍 b r a d f o r d t 6 8 1 方法测定。以牛血清白蛋白( b s a ) 为标准蛋白 配制标准溶液，分别测定各标准样品的吸光值绘制标准曲线。测定样品的吸光 值，在标准曲线上读出样品中的蛋白含量。 第三节试验数据处理 试验结果采用s p s s l 3 0 统计软件进行分析，用平均数标准偏差( a v _ s d ) 表示。用“f 检验法对组间数据进行差异显著性分析，p 1 0 0 0m g l 。1 属于低毒。甲苯对大型潘4 8 h 半数抑制浓度 4 8 h e c 5 ，o 1 0 0 0m g l ，毒性水平属于低毒，乙苯和二甲苯对大型潘的4 8 he c s o 均 在1 0 0m g l 1 0 0 0m g l d 范围内，其毒性作用属于中毒水平。 3 3 1 甲苯对大型洛的急性毒性效应 在2 4 h 暴露条件下，甲苯对大型潘不产生毒性效应的最大浓度为1 0 0 0 m g l 一。当浓度大于1 0 0 0 m gl “时，大型潘的游动能力受到不同程度的抑制。当 浓度达到1 2 3 0m g l 以时，2 0 大型潘活动受到了抑制，而在暴露浓度增加到 2 7 2 0m g l 一时，9 5 的大型涵活动均受到了抑制。在4 8 h 暴露条件下，当暴露浓 度达1 0 0 0m g l 。时，就有2 0 的大型潘活动受到抑制。随着水体中甲苯浓度的 增加，大型潘活动抑制率逐渐升高，使大型潘个体活动全部受到抑制的甲苯浓 度为2 7 2 0m g l 。2 4 h 和4 8 h 毒性效应结果经单样本k s 检验，均属于正态分布 ( p 0 0 5 ) 。同时，将甲苯暴露浓度和大型潘抑制率进行剂量效应相关性分析，分 别得到2 4 h 和4 8 hp e a r s o n 相关系数r 分别是0 9 7 3 和0 9 6 4 。可见，甲苯对大型潘 毒性作用存在明显的剂量效应关系。随暴露浓度的增加，甲苯对大型涵活动抑 第章苯系物对大型溢毒性效应与环境基准研究 制率增加，且抑制率随时间延长而增加。 表3 1 甲苯、乙苯和二甲苯对大型潘半抑制浓度e c 5 0 及回归方程 注：“y ”为物质浓度概率：“x ”为物质浓度对数；“r 2 ”毒性回归方程相关系数 3 3 2 乙苯对大型潘的急性毒性效应 当乙苯浓度为3 2 0 m g l d 时，2 4 h 和4 8 h 内分别使1 0 和2 0 的大型潘活动 受抑制情况。随乙苯暴露浓度的增加，大型潘抑制率增加。当水体中乙苯浓度 达到7 8 0m g l 以时，8 0 大型潘在2 4 h 内活动受到抑制，9 0 大型潘在4 8 h 内活 动受到抑制。将乙苯对大型潘2 4 h 和4 8 h 内抑制率经单样本k - s 检验，均属于正 态分布( p 0 0 5 ) ) 。同时，将乙苯浓度及暴露于其中的大型潘抑制率进行剂量效 应相关性分析，分别得到2 4 h 和4 8 hp e a r s o n 相关系数r 分别是0 9 4 3 和0 9 4 4 。可 见，乙苯对大型潘的毒性效应存在明显的剂量效应关系。 3 3 3 二甲苯对大型潘的急性毒性效应 大型潘暴露在浓度为4 3 0 m gl - i 的二甲苯中时，2 4 h d 、时内1 5 大型潘活动 受抑制，4 8 h 1 内3 5 大型潘活动受到抑制。随暴露浓度增加，大型潘活动受抑制 程度增强。当二甲苯浓度达到8 7 0 m g l 以时，2 4 h 内8 5 大型淹活动全部受抑制， 延长至4 8 h 时，全部大型潘个体活动均受到抑制。2 4 h 和4 8 h 抑制率经单样本k s 检验，均属于正态分布( p o 0 5 ) 。同样，二甲苯浓度与大型潘抑制率经统计分析 第一章苯系物对大型溢毒性效应与环境基准研究 发现，暴露浓度与抑制率存在明显的正相关性( r 分别为0 9 7 3 和0 9 9 5 ) 。 3 3 4 毒性大小机理研究 由表1 和表2 试验结果可知，3 种物质对大型涵产生了很大的毒性作用，且 毒性大小顺序均为：乙苯 - - 甲苯 甲苯。如，乙苯和二甲苯对大型涵的2 4 h 半抑 制浓度e c s o 分别是5 0 1 和6 3 6m g l ，甲苯2 4 he c 5 0 为1 7 2 1m g l 。可知， 乙苯和二甲苯对水生生物的毒性作用相差不大，都大于甲苯。这可能与3 种物 质的分子结构有关。 依据化学结构不同，可以将化合物分为4 类：1 ) 惰性化合物；2 ) 亚惰性 化合物；3 ) 反应性化合物；4 ) 特殊作用型化合物。惰性化合物和亚惰性化合 物毒性作用模型都是非极性麻醉型。非极性麻醉化学物质引起麻醉的能力依赖 于其疏水性【7 1 。7 3 1 。根据相似相溶原理，生物体细胞膜及细胞中类脂物质都会吸 附麻醉型化合物。疏水性越大，非极性麻醉型物质越容易非选择性通过细胞膜。 因此，非极性麻醉型化合物的毒性可以用辛醇水分配系数( k w ) 确定其基本的 毒性r 7 4 i 。甲苯、乙苯和二甲苯三种化合物均属于非极性麻醉型化合物。我国学 者王连生等嗍以及戴朝霞等【7 6 】也认为，芳香烃类有机物分子对生物活性以及毒 性作用与分子结构有关，贡献顺序为：疏亲水性 电性效应 空间效应，且取代 芳香烃对生物的毒性主要受2 个因素影响，即化合物的疏水性和污染物反应能 力与趋势。c r o n i n 等【7 7 】认为，污染物对水生生物的毒性作用机制可能是首先穿透 细胞膜，然后通过各种过程与生物活性点反应。 甲苯、乙苯和二甲苯3 种化合物均属于非极性麻醉型化合物。根据相似相 溶原理，生物体细胞膜及细胞中类脂物质都会吸附非极性麻醉型化合物。疏水 性越大，非极性麻醉型物质越容易非选择性通过细胞膜，然后通过各种过程与 生物活性点反应。因此，非极性麻醉型化合物的毒性可以用辛醇水分配系数 ( 1 9 k o w ) 确定其基本的毒性。甲苯、乙苯和邻、间、对位二甲苯2 0 。c 辛醇水 分配系数l g k o w 分别是2 6 9 、3 1 5 、2 7 7 、3 2 0 和3 1 5 ，即3 种物质疏水性顺序 为：乙苯 二甲苯( 总) 甲苯。根据以上理论，乙苯相对于二甲苯和甲苯更容 易通过大型潘细胞膜，进而对其产生毒性作用，其次是二甲苯( 总) 和甲苯。 本试验得到的3 种物质对大型潘的毒性作用大小顺序为：乙苯 - - 甲苯 甲苯， 这与理论推测相吻合。 第二章苯系物对大型溢毒性效应与环境基准研究 第四节基于大型潘的环境基准值研究 通过对大型潘4 8 h 急性毒性研究发现，b t e x 对大型潘有比较大的毒性效应。 2 4 h 暴露条件下，甲苯、乙苯和二甲苯使大型潘半数受到抑制的浓度分别为1 7 2 1 、 5 0 1 和6 3 6m g l 。当延长暴露时间到4 8 h 时，半数抑制浓度e c 5 0 又分别降至 13 6 9 、4 2 9 和5 0 3m g l 。根据化学物质对潘类毒性等级评价标准，化学物质 对滔类4 8 h e c 5 0 s 1 0m g l - 时，属于剧毒； _ 1 0 0 0r a g l 。1 属于低毒。甲苯对 大型潘4 8 h 半数抑制浓度4 8 h e c s o 1 0 0 。0m g l ，毒性水平属于低毒，乙苯和二 甲苯对大型涵的4 8 he c 5 0 均在1 0 0m g l 1 0 0 0m g l 。1 范围内，其毒性作用属于 中毒水平。 受试物质对大型潘具有一定的毒性作用，但毒性大小不同，其毒性大小顺 序为：乙苯 - - 甲苯 甲苯。这与三种物质的分子结构有关，分子结构的不同导 致物理性质的差异，而三种物质的毒性大小于其本身的疏水性有关，疏水性越 大，对大型溢的毒性越明显。 根据对大型潘的急性毒性试验，推导苯系物甲苯、乙苯和二甲苯的环境质 量最大值分别为1 7 2 1 、5 0 1 和6 3 6m g l ，环境污染修复值分别为1 2 0 4 7 、3 5 0 7 和4 4 5 2m g - l 。 第四章苯系物斑马鱼毒性效应与环境基准研究 第四章苯系物对斑马鱼毒性效应与环境基准研究 第一节前言 斑马鱼( b r a c h y d a n i or e