（环境工程专业论文）基于新型毒性敏感菌株的cellsense生物传感器毒性分析性能研究.pdf

摘要 摘要 生物传感器是以生物学组件( 如酶、微生物细胞、d n a 等) 作为主要功能 性元件，识别和感知被测物并按一定规律转换成可识别信号的器件或装置。因 其具有体积小、响应快、可实现原位在线监测等特点，在环境监测领域备受青 睐。 本论文从曲阳水质净化厂、安亭污水厂的回流污泥、同济新村污水处理装 置的剩余污泥和东区污水厂曝气池内的活性污泥的混合污泥中进行微生物的分 离、纯化和培养，从中筛选出2 株毒性敏感菌株，经鉴定后分别为嗜冷杆菌 ( p s y c h r o b a c t e rs p ) 和枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 。研究了基于 p s y c h r o b a c t e rs p 和b a c i l l u ss u b t i l i s 的c e l l s e n s e 生物传感器在重金属、有机物、 表面活性剂、抗生素等的单一毒性以及二元混合物的联合毒性分析中的应用性 能，并初步考察了其在皮革废水、油田废水、生活污水等废水毒性分析中的实 际应用性能。 研究结果表明，不同培养周期的b a c i l l u ss u b t i l i s 和p s y c h r o b a c t e rs p 对所选 分析对象的毒性敏感性能存在一定的差异性，基于对数生长后期的p s y c h r o b a c t e r 踢和b a c i l l u ss u b t i l i s 两种c e l l s e n s e 生物传感器具有较好的毒性响应特性。 基于b a c i l l u ss u b t i l i s 和p s y c h r o b a c t e rs p 的c e l l s e n s e 生物传感器分析得出7 种重金属离子的毒性顺序依次均为h 9 2 + c u 2 + z n 2 + c r 6 + c d 2 + p b 2 + c 0 2 + ，这与 根据传统的细胞计数法所得出的重金属离子的毒性顺序相一致，几种重金属对 b a c i l l u ss u b t i l i s 的e c 5 0 分别为0 9 4 、2 5 2 、1 0 7 3 、1 5 3 9 、3 2 1 3 、7 4 0 3 和3 8 0 4 ( e c 3 0 ) l ag m l ，对p s y c h r o b a c t e r s p 的e c s o 分别为o 7 6 、2 5 6 、1 0 9 3 、1 3 9 7 、 4 7 3 4 、1 0 0 1 2 和5 6 6 0 ( e c 3 0 ) 1 tg m l 。 基于p s y c h r o b a c t e rs p 型c e l l s e n s e 生物传感器的4 种重金属离子联合毒性分 析中，等毒性比混合时，c u 2 + c r 6 + ，c r 6 + z n 2 十和c u 2 + z n 2 + 的舢值分别为0 3 5 、 0 5 l 和0 5 8 ，均为负值，其对p s y c h r o b a c t e rs p 联合毒性表现为拮抗作用； c ? + c d 2 + 的值为0 ，表现为相加作用，c u 2 * c d 2 + 和z n 2 十c d 2 + 的砧值分别为 o 1 和0 1 9 ，联合毒性均表现为协同作用。等浓度比混合时，c u 2 y c r 6 + 、c r 6 - z n 2 + 、 摘要 c u 2 + c d 2 + 和c u 2 - z n 2 + 对p s y c h r o b a c t e rs p 联合毒性均表现为拮抗作用，c r 6 + c d 2 + 表现为相加作用，z n l c d 2 + 表现为协同作用。 基于b a c i l l u ss u b t i l i s 的c e u s e n s e 生物传感器的4 种重金属离子联合毒性分 析中，根据各混合体系的舢值，等毒性比混合时，c u 2 + c r 6 + 和z n 2 + c d 2 + 的越 值分别为- 0 0 7 和0 0 9 ，均接近于0 ，拮抗作用不显著，基本可以判定为相加作 用。c d + c d 2 + 、c r 6 + z n 2 + 、c u 2 + 伦d 2 + 和c u 2 + z n 2 + 的a i 值分别为0 1 3 、0 1 3 、0 7 6 和o 4 7 ，联合毒性表现为拈抗作用。等浓度比混合时，c u 2 + c r 6 + 、c r 6 + c d 2 + 、 c r 2 + z n 2 + 和c u 2 + z n 2 + 的联合毒性均表现为拮抗作用。 基于b a c i l l u ss u b t i l i s 和p s y c h r o b a c t e rs p 的c e l l s e n s e 生物传感器分析得四种 有机物2 c p 、2 , 4 d c p 、2 - n p 和4 - n p 的毒性强弱顺序均为 2 , 4 一d c p 4 一n p 2 - c p 2 n p ，几种有机物对b a c i l l u ss u b t i l i s 的e c 5 0 分别为4 5 0 8 4 、 4 8 6 9 7 、5 5 9 6 和5 8 8 4 5ug m l ；对p s y c h r o b a c t e rs p 的e c 5 0 分别为1 6 3 7 9 、 4 2 4 4 2 、4 4 5 4 7 和2 4 9 2 3 ( e c 3 0 ) ug m y 。 筛选出的b a c i l l u ss u b t i l i s 和p s y c h r o b a c t e rs p 菌株对四环素和十二烷基苯磺 酸钠具有良好的毒性敏感性，其中p s y c h r o b a c t e rs p 又优于b a c i l l u ss u b t i l i s 。 基于b a c i l l u ss u b t i l i s 型c e l l s e n s e 生物传感器的4 种有机物( 2 - n p 、4 - n p 、 2 - c p 、2 , 4 - d c p ) 二元混合物等浓度比混合时的联合毒性分析表明，2 ，4 二氯酚+ 邻氯酚与2 ，4 一二氯酚+ 对硝基酚混合体系呈协同作用( a i 0 ) ，2 , 4 二氯酚+ 邻硝 基酚与2 - 氯酚+ 对硝基酚的趟值分别为o 0 1 、0 0 7 ，均接近于0 ，协同和拮抗作 用不显著，基本可判断为相加作用( m = o ) ，邻氯酚+ 邻硝基酚与邻硝基酚+ 对 硝基酚混合体系呈拮抗作用( a i c u 2 + z n z + c r 6 + c d 2 + p b 2 + c 0 2 + ，w h i c hw a s i na c c o r d i n gt ot h er e s u l t so ft r a d i t i o n a lc e l l c o u n t i n gm e t h o d t h et o x i c i t ye c 5 0o f s e v e nh e a v ym e t a li o n st ob a c i l l u ss u b t i l i sw e r eo 9 4 ，2 5 2 ，1 0 7 3 ，1 5 3 9 ，3 2 1 3 ，7 4 0 3 ， 3 8 0 4 ( e c 3 0 ) 斗g r n l ，r e s p e c t i v e l y t h ee c s oo fs e v e nh e a v ym e t a l st op s y c h r o b a c t e r w e r e0 7 6 ，2 5 6 ，1 0 9 3 ，1 3 9 7 ，4 7 3 4 ，1 0 0 1 2 ，5 6 6 0 ( e c 3 0 ) p e d m l ，r e s p e c t i v e l y t h ej o i n tt o x i c i t yo ff o u rh e a v ym e t a l sb a s e do nc e l l s e n s eb i o s e n s o rw i t l l p s y c h r o b a c t e rs p s h o w e dt h a t ，w h e ni ne q u i t o x i c i t ym i x t u r e s ，t h ea iv a l u e so f c u 2 + c r 6 + ，c r 6 + z n 2 + a n dc u 2 + z n 2 + w e r e 0 3 5 ，0 51 ，0 5 8 ，r e s p e c t i v e l y 1 1 1 ej o i n t t o x i c i t y o ft h eb i n a r ym i x t u r e so ft h r e e h e a v ym e t a l s ( c r 6 + ，z n + ，c u 2 + ) w a s i i i a n t a g o n i s t i c t h ea iv a l u eo fc r 6 + c d 2 十w a s0s h o w e da l la d d i t i v i t yj o i n tt o x i c i t y t h e a iv a l u e so fc u z + c d 2 + a n dz n e + c d 2 + w e r eo 1a n do 19 ，w h i c hs h o w e das y n e r g y c o m b i n e dt o x i c i t y i ne q u i c o n c e n t r a t i o no n e s ，c u 2 + c r 6 + ，c r 6 + z n 2 + ，c u 2 + c d 2 + a n d c u 2 + z n 2 + w e r em a n i f e s t e da sa n t a g o n i s m ，c r 6 + c d 2 + s h o w e da d d i t i v i t yc o m b i n e d t o x i c i t y ，z n 2 + c d 2 + s h o w e ds y n e r g i s t i ct y p e t h ej o i n tt o x i c i t ya n a l y s i so ff o u rh e a v ym e t a l sb a s e do nc e l l s e n s eb i o s e n s o r 岍t hb a c i l l u ss u b t i l i ss h o w e dt h a t , i ne q u i t o x i c i t ym i x t u r e s ，t h ea iv a l u e so f c u 2 + c r 6 + a n dz n e + c d 2 + w e r e 0 0 7 ，0 0 9 ，b o t ho fw h i c hw e r ec l o s e dt o0 ，t h e a n t a g o n i s t i ce f f e c tw a sn o ts i g n i f i c a n t ，t h ej o i n tt o x i c i t yc o u l db cj u d g e da sa d d i t i v e t h ea iv a l u e so fc r 6 + c d 2 + ，c 6 + z n 2 + ，c u 2 + c d 2 + a n dc u 2 + z n 2 + w e r e o 13 ，0 13 ， - 0 7 6a n d - o 4 7 ，r e s p e c t i v e l y w h i c hs h o w e dt h ec o m b i n e dt o x i c i t yw a sa n t a g o n i s m i ne q u i c o n c e n t r a t i o nr a t i o ，t h ec o m b i n e dt o x i c i t yo fc u 2 + c r 6 + ，c r 6 + c d 2 + ，c r 2 + z n 2 + a n dc u 2 + z n 2 + w e r em a n i f e s t e da sa n t a g o n i s m t h ea c u t et o x i c i t ye f f e c t so ff o u ro r g a n i cc o m p o u n d s ( 2 一c p ，2 ，4 一d c p ，2 - n pa n d 4 - n p ) w e r ea s s e s s e db a s e d0 1 1c e l l s e n s eb i o s e n s o rw i mb a c i l l u ss u b t i l i sa n d p s y c h r o b a c t e rs p t h et o x i c i t yo r d e ro ff o u ro r g a n i cc o m p o u n d sw e r e2 , 4 - d c p 4 - n p 2 - c p 2 - n p t h ee c s oo f2 , 4 - d c p ，4 - n p ，2 - c pa n d2 n pt ob a c i l l u ss u b t i l i s w e r e4 5 0 8 4 ，4 8 6 9 7 ，5 5 9 6a n d5 8 8 4 5p g m l ，r e s p e c t i v e l y ，a n dt op s y c h r o b a c t e rs p w e r e16 3 7 9 ，4 2 4 4 2 ，4 4 5 4 7a n d2 4 9 2 3 ( e c 3 0 ) b g m l ，r e s p e c t i v e l y b o t hb a c i l l u ss u b t i l i sa n dp s y c h r o b a c t e rs p h a dg o o dt o x i c i t ys e n s i t i v i t i e st o t e t r a c y c l i n ea n ds d b s ，a n dp s y c h r o b a c t e rs p s h o w e dab e t t e rs e n s i b i l i t y i n e q u i c o n c e n t r a t i o nm i x t u r e s ，t h ej o i n tt o x i c i t y o f2 , 4 d c p + 2 - c pa n d 2 ，4 一d c p + 4 - n pt ob a c i l l u ss u b t i l i ss h o w e das y n e r g y 够p e ( a i 0 ) ，t h ea iv a l u e so f 2 ，4 一d c p + 2 一n pa n d2 - c p + 4 一n pw e r ec l o s i n gt o0 ( 0 01a n d0 0 7 ) ，s y n e r g ya n d a n t a g o n i s mw a sn o ts i g n i f i c a n t , t h ej o i n tt o x i c i t yc o u l db ej u d g e da sa d d i t i v i t y ( a i = 0 ) t h ej o i n tt o x i c i t yo f2 c p + 2 - n pa n d2 - n p + 4 n pm i x t u r e sw a sa n t a g o n i s t i ct y p e ( 食品类 电镀类 电池类 玻璃 类 橡胶类，对应的9 6 hl c 5 0 分别为：0 9 8 、4 7 3 、1 1 3 5 、1 3 6 0 和4 7 6 0 ， 其中橡胶类毒性最小，1 0 0 的工业废水对斑马鱼无致死效应，处理后的工业废 水毒性基本消除，但部分行业的工业废水处理后仍存在毒性。 在人为控制的条件下，所进行的各种鱼类毒性试验，不仅可以用于化学品 毒性测定，水体污染程度检测，废水及其处理效果检查，而且还可以作为制定 水质标准、评价水环境质量和管理废水排放提供科学依据。由于斑马鱼胚胎技 术具有成本低、操作简易、影响因素少、毒性指标丰富、灵敏度高等优点，正 逐步成为传统鱼类急性毒性试验的替代手段。 1 1 2 水蚤类毒性试验 水蚤属甲壳纲、鳃足亚纲的枝角类浮游生物，广泛分布于淡水中，是鱼类 的天然饵料，是淡水食物链中重要的一环，它繁殖快、生命周期短、培养简便、 对许多毒物敏感，是国际公认的标准试验生物。目前，对大型蚤生存繁殖能力 2 第一章绪论 影响的毒性试验已经成为环境污染物生态毒性评价的常规方法，已被许多国家 广泛地用于环境污染物的毒性评价l l 引。在蚤类毒性测试技术中，国际公认的、 应用较多的测试生物为大型涵d a p h n i a ，大型蚤的生物测试技术已广泛地用于各 种新的有机物和对人体和环境有生理影响的物质的测试。r o s a n a 1 5 j 以水蚤 ( d a p h n i as i m i l i s ) 、蚊( c h i r o n o m u sx a n t h u s ) 和鱼( h y p h e s s o b r y c o ne q u e s ) 为 受试对象，采用净水厂富含铁的污泥对水生生物进行了毒性试验研究。研究发 现，虽然污泥对试验生物无急性毒性影响，但是这些未经处理的污泥一旦排放， 随着受纳水体中s s 、浊度、电导率、c o d 和硬度的增加，其对下游的水生生物 群仍然存在慢性毒性效应。汪丽【1 6 j 研究了两种光照( 光暗比= 1 4 ：1 0 h 和0 ：2 4 h ) 条件下，2 0 种葸醌类化合物对大型涵的急性毒性，比较了两种助溶剂( 二甲基 亚砜和丙酮) 对此类化合物毒性的影响，并根据毒性数据建立了定量结构活性 关系( q s a r ) 模型。苏丽敏等人【1 。7 】利用大型水蚤研究了苯胺与6 种取代苯胺的 单一毒性和联合毒性，采用相加指数法对联合毒性进行了评价。于瑞莲等人i l 聊 测定了1 3 苯胺类化合物在不同p h 下( 6 0 ，7 8 ，9 0 ) 对大型蚤( d a p h n i am a g n a ) 的2 4 h 半数活动抑制浓度2 4 hi c 5 0 ，应用三种理化参数l o g p 、t s a 和p k a 对毒 性数据进行了定量构效关系( q s a r s ) 研究，并在此基础上初步探讨了苯胺类化 合物的毒性机制。李淑娆等人【l9 j 曾利用大型蚤急性毒性试验分析了铁岭市3 2 家 有代表性的企业所排放的废水的毒性，认为化工行业的废水毒性最大，电子、 仪器、仪表、机械等行业次之，食品、饮料行业所排放的废水毒性较小或无毒。 郜炜曾利用大型水蚤的慢性毒性试验来检验辽化( 长排) 、庆化( 南排) 、造 纸( 黄口) 三家工业废水的生物毒性，结合理化测试结果，完全可以说明废水 的水质状况和综合污染程度，为综合治理污水提供理论依据。 2 0 世纪9 0 年代中期，一些学者提出采用水生生物生理和行为上的变化如 呼吸率、游泳能力、捕食能力和趋光能力等作为反映所受环境压迫的灵敏指标。 因为生理变化往往是生物对外来环境胁迫的最初反应，在致死效应之前可以检 测到，可以作为早期警报指标。1 9 9 9 年，m i c h e l s 等采用单一种克隆大型蚤的趋 光行为作为生物检测指标，测试结果发现，利用蚤趋光性为指标所得的p c p 的 检测限为0 s m g l ，比2 4 h l c 5 0 值还低，证实了可以利用水生生物生理和行为变 化作为环境受污染的灵敏指标的可行性【2 0 1 。 此外，也有一些学者利用其它蚤类生物作为受试对象来研究污染物质的毒 性，如吴银宝等【2 l 】以隆腺蚤( d a p h n i ac a r i n a t a ) 为试验对象，测定了恩诺沙星 3 第一章绪论 对隆腺蚤的急性毒性。景体淞和徐镜波【2 2 】以标准试验潘类一蚤状潘( d a p h n i a p u l e x ) 为试验材料，研究了污水中常见的酚类、苯类、重金属( c u 、p b 、c d ) 对 蚤状潘的毒性作用，为制定相关的环境标准提供可靠依据。 1 1 3 藻类毒性试验 藻类是水体中主要的初级生产者，在光的作用下它们吸收水中的无机营养盐 类和二氧化碳，制造有机物，是水生态系统中物质循环和能量流动中的最基础 环节。通过各种途径进入水体的污染物首先作用于藻类，对其产生危害，因此藻类 是评价化学物质对水生生物的影响的主要环节之一。藻类对于许多毒物比鱼类、 甲壳类更敏感，具有生长周期短、易于分离培养、可直接观察细胞水平上的中 毒症状和可以得到化学物质对许多世代及种群水平影响等特点，是较为理想的 毒性分析试验材料。 目前，国内外研究大多数集中在研究不同污染物对不同种藻类单一毒性， x i a 等人 2 3 1 在研究铜和镉对g r a c i l a r i al e m a n e i f o r m i s 的生长代谢、光合作用及细 胞色素的影响研究中发现，当c u 2 + 浓度为2 , 5 ，1 0 l x m o l l 时，9 6 h 后 g l e m a n e i f o r m i s 的相对生长速率分别被抑制3 5 1 、7 1 9 和7 1 2 ，但此浓度 范围会使g l e m a n e i f o r m i s 光合放氧降低，r p c 含量显著降低，但c h l a 和类胡 萝卜素含量维持相对稳定；c d 2 + 浓度在1 0 0 - 2 0 0 1 a m o l l 时，g l e m a n e i f o r m i s 的生长受到明显抑制，光合放氧降低，叶绿素a 和类胡萝卜素以及r p c 含量显 著降低。p l e k h a n o v 等人【2 4 】的研究发现，z n 2 + 使小球藻c h l o r e u a p y r e n o i d o s ac h i o k s 3 9 光合放氧减少，叶绿素荧光( f v f m ) 降低，抑制p si i 的电子传输并降低p si i 活性。王山杉等人1 2 5 1 的研究发现当z n 2 + 浓度大于等于5 0 9 m o l l 时，固氮鱼腥藻 ( a n a b a e n aa z o t i c al e y ) 的生长和光合作用受到抑制作用，高浓度的z n 2 + 抑制碳酸 酐酶c a 活性。c a r l a 等人【2 6 】分别以生长抑制曲线和死亡抑制曲线作为效应标准， 研究了水产养殖中使用较多的两种抗菌剂土霉素( o t c ) 和弗苯尼考( f l o ) 对 两种水生生物扁藻( t e t r a s e l m i sc h u i i ) 和甲壳纲生物卤虫( a r t e m i a p a r t h e n o g e n e t i c a ) 的急性毒性，研究结果表明，o t c 和f l o 对扁藻的毒性相对 的比对卤虫的毒性要大，o t c 和f l o 对扁藻生长都有抑制作用，其9 6 h 的i c 5 0 值分别为l l 。1 8 和6 0 6 m g l ，o t c 对卤虫2 4 h 和4 8 h 的l c 5 0 值分别为8 7 1 和 8 0 6 m g l ，f l o 对卤虫没有抑制作用。胡双庆等1 27 j 以斜生栅y u 藻( s c e n e d e s m u s o b l i q u u s ) 为受试对象，在试验室条件下测定了吡虫清、吡嗪酮、恶草酮和精喹禾 4 第一章绪论 灵4 种新农药对斜生栅藻的急性毒性，并进行了了毒性等级划分。徐兆礼等【2 8 】 用长江口疏浚泥浸出液和悬浮液对小球藻进行生长试验和急性毒性试验，得出 了长江口疏浚泥浸出液和悬浮液对小球藻的毒性。 由于在实际水环境中，同时会存在多种污染物质，为了客观评价污染物质 共存对藻类的影响，近些年来，污染物质联合毒性的研究已越来越受到人们的 重视。李雪芹等人1 2 9 1 研究了扑草净和渗透剂o t 对蛋白核小球藻的联合毒性，结 果发现，低浓度混合使用时扑草净和o t 刺激蛋白核小球藻的生长，藻细胞密度 升高，叶绿素和可溶性蛋白含量呈上升趋势，抗氧化酶s o d 和p o d 活性均上升， 而高浓度混合使用时则对蛋白核小球藻有抑制作用。黄健等人【3 0 l 进行了3 种多 环芳烃葸( a n t h r a c e n e ) ，并【a 】芘( b c n z o a p y r c n e ) 及1 ，2 一苯并葸( 1 ，2 b e n z o n t h r a c e n e ) 单剂和混剂对青岛大扁藻( p l a t y m o n a sh e l g o l a n d i c a ) 、球等鞭金藻8 7 0 1 ( i s o c h r y s i s g a l b a n a8 7 0 1 ) 的急性毒性和联合毒性分析，结果表明，对于青岛大扁藻，葸与苯 并【a 】芘的联合和苯并 a 】芘和l ，2 苯并葸的联合表现为协同作用，蒽和l ，2 苯并葸 的联合以及葸，苯并 a 】芘及1 ，2 苯并葸联合表现为拮抗作用；对球等边金藻，苯并 【a 】芘和l ，2 苯并葸的联合表现为协同作用，其它联合均为拮抗作用。 一般而言，藻类毒性试验的重现性较差，而且，目前用藻类进行废水综合 毒性的研究报道还较少。 1 1 4 微生物毒性试验 用细菌来评价废水毒性是基于毒性效应对细菌的某些可见特性的作用，如 细胞生长、运动性、呼吸速率和生物发光、酶活性变化、a t p 水平、微热量等 的变化。细菌用来做毒性评价有以下优点：生物机体小、种群数量大、生长繁 殖快、保存简单方便、试验费用低、对环境变化的反应快、生长条件便利，并 且同高等动物有着类似的物理化学特性和酶作用过程等特点，因此特别适合于 生物毒性试验，有些已被许多国家定为废水毒性测定的标准方法【3 1 1 。 微生物毒性测试方法中应用最多的当属2 0 世纪8 0 年代发展起来的 m i c r o t o x 法，它是采用海洋发光茵( v i b r i of i s h i e r i ) 作为毒性测试的指标生物， 其原理是发光细菌体内的荧光素酶催化荧光素的氧化作用，反应如下式所示： f m n h 2 + 0 2 + r c o h - - * f m n + r - c o o h + h 2 0 + l i g h t 发光细菌与毒性物质接触时细胞的状态( 包括细胞壁、细胞膜、电子的转 移系统、酶及细胞质的结构) 将被改变从而将导致生物发光的减弱，通过测定 5 第一章绪论 发光强度的减弱程度确定污染的毒性强弱。j e n n i n g s 等人【3 2 】用三种发光菌测试 系统( t o x a l e r t1 0 ，m i c r o t o x a n dl u m i s t o x ) 测定了8 0 多种化合物的毒性并 将结果进行了比较，认为三种测试系统有很好的相关性。j o r g e 等人【3 3 】采用发光 细菌( v i b r i of i s c h e r i ) ，藻( c h l o r e l l av u l g a d s ) 、大型蚤( d a p h n i am a g n a ) 和 食蚊鱼( p 1 u c i d a ) 的肝癌细胞来评估硝酸铟的毒性，发现v i b r i of i s c h e r i 是对硝 酸铟最灵敏的指示生物，其最大无作用剂量是0 2 m m ，接触1 5 m i n 的e c 5 0 值为 0 0 4 r a m ，证明了硝酸铟对水生生物有慢性毒性危害。发光菌不但可以测试单一 化合物的毒性，还可以测试不同污染物混合之后的联合毒性效应。苏丽敏和袁 星【i7 】测定了苯胺及其衍生物对发光菌的单一毒性及不同毒性单位配比条件下的 联合毒性，并采用相加指数法对联合毒性进行了评价，发现苯胺与其衍生物的 二元混合物在不同配比下对发光菌的联合毒性均为相加作用。 国内学者在废水的发光细菌毒性方面也进行了大量的研究。董玉瑛等人【3 4 】 采用b o l i c h 百分数等级毒性划分标准和发光细菌法对啤酒、酿造、印染、化纤、 造纸等有机工业废水进行了生物毒性测试，结果表明，所测废水均对发光细菌 呈现毒性效应，其中化纤黑液的毒性最大。王兆群等人【3 5 】采用发光细菌法研究 了淮安市工业废水的毒性，结果发现，从行业分布看，毒性最强的是造漆厂、 化纤业，其次为造纸业、冶金行业，毒性较低的有制药厂、食品行业、日用化 工行业。易绍金等人p 6 】根据g b t1 5 5 4 1 1 9 9 5 ，参照美国糠虾生物试验法，建立 了快速测定钻井液完井液添加剂及其体系生物毒性的发光细菌测试方法。刘毅【3 7 】 用发光细菌法来评价大凌河水、底泥的总体急性生物毒性，来了解河流水质和 底泥受污染的情况。方战强等【38 j 运用发光细菌法对纸浆c e h 各段漂白废水进行 了毒性研究，评价了各个阶段漂白废水的毒性，并由此确定漂白废水应优先治 理的阶段以及治理的重要性。董玉瑛等p 川应用发光细菌法对火电厂和污水处理 厂各工艺段排水进行生物毒性分析，并对水样毒性进行评价，认为不同行业废 水的生物毒性与其c o d 值之间不存在相关性，与化学分析方法相结合，发光细 菌法可快速测定工业废水毒性。 由于海洋发光菌在测定条件下需加一定量的n a c l ( 2 5 ) ，对淡水体 系样品测试时高浓度c l 的存在会影响水样中的一些污染物，尤其是重金属污染 物的生物可利用性和毒性顺序，另外，明亮发光杆菌的p h 适应范围窄，必须将 样品p h 调至7 3 - 7 5 后才能测定，影响了样品中有毒组分毒性的真实性，因此， 该类毒性检测方法亦具有明显的局限性。1 9 8 5 年我国学者从青海湖的裸鲤 6 第一章绪论 ( c r y m n o c y p r i sp r z e w a l s k i i ) 体表分离得到一种淡水发光细菌( v i b r i oq i n g h a i e n s i s s p n o v 0 6 7 ) 作为化学品毒性试验的受试对象1 4 0 1 ，该试验有快速简便、灵敏度高 的特点，尤其适于重金属的毒性分析。熊蔚蔚等【4 1 】采用等毒性配比法，研究了 镉、铬和铅二元混合物对淡水发光细菌青海弧菌q 6 7 ( v i b r i oq i n g h a i e n s i s s p n o v q 6 7 ) 的联合毒性，为阐明重金属联合污染机制提供了基础数据。谢冰 4 2 1 利用淡水发光细菌法来研究废水毒性和可生化性之间的关系，发现废水毒性的 变化和可生化性的改变具有一致性，可用来有效、快速地估算有机废水的可生 化性。 发光细菌法对很多毒物特别敏感，该方法的灵敏度和可靠性可以与鱼体9 6 h 培养测定的急性毒性方法相比，具有简便、快速、可靠、经济等优点。目前， 国内外已开发出多种基于发光细菌法测定毒性的商品化毒性检测系统，如美国 a z u re n v i r o n m e n t a l 公司的m i c r o t o x o s 毒性检测系统、b e c k m a n 公司的 l u m i s t o x 及m e r c k 公司的t o x a l e r t 回等，国内的清华大学亦研制出一种基于类 似原理的在线水质毒性监测仪。因此，该方法已经成为快速、经济的毒性测试 方法，并得到了广泛的应用。 传统的生物毒性监测以水蚤、藻类或鱼类等为受试对象，可以反映毒物对 生物的直接影响，因此在水污染研究中，它已经成为监测和评价水体环境的重 要手段之一，但是这些方法的最大缺点是实验周期长，操作复杂，大部分现存 方法都是间歇式实验，不能及时反映水质情况。近年来，随着微生物固定化技 术的发展，微生物传感器检测生物毒性已显示出诱人的前景。 1 1 5 微生物传感器 生物传感器是以生物学元件( 如酶、微生物细胞、d n a 等) 作为功能性识 别元件，识别和感知目的被测物并且按一定规律转换成为可识别信号的器件或 装置。生物传感器通过生物分子识别部件将被感知物质的非电信号转换成可测 量的电信息。因此一个典型的生物传感器应当由生物分子识别和信息转换部件 组合构成。如图1 1 所示。 生物传感器的工作原理主要决定于敏感元件( 分子识别单元) 和待测物质 之间的相互作用，有以下几种类型：1 ) 将化学变化转化为电信号。2 ) 将热变 化转变为电信号。3 ) 将光信号转变为电信号。4 ) 直接产生电信号方式。除了 7 第一章绪论 上述四种外，随着科学技术的发展，基于新的原理的生物传感器将不断出现， 酶 电板 徽生物土 鹤广电i t 测 细胞或 物趴 光p 电 i 量 电信鹄 或 组织 或化弩 压电 ； 控 抗琢或 变 制 抗体 只丁阀 ：， 装 值电位 置 i 识别部件转换部件 、- 、，_ 生物传感器 图1 1 生物传感器结构框图 f i g 1 1s t r u c t u r ec h a r to fb i o s e n s o r s 出 生物体内许多物质如酶、抗体、抗原、激素、细胞器、动物细胞、植物细 胞、组织等都具有优异的分子识别功能，因此它们都可以构成相应的生物传感 器。生物传感器在最近十几年来发展非常迅速。目前，生物传感器大致可分为 以下几类：1 ) 酶传感器2 ) 组织传感器3 ) 微生物传感器4 ) 免疫和酶免疫传 感器5 ) 场效应( f e t ) 生物传感器。但生物传感器是将活性酶、生物组织、器官 等作为感受器，由于这些活性酶、生物组织或器官脱离其生存的母体，同时其 工作环境与其生存的条件有很大的差异，因此这些活性酶、生物组织或器官容 易失去活性，使其寿命较短，且多数价格昂贵，不是理想的水质监测器。 微生物细胞不同于一般的动、植物细胞，它能单独进行生长、呼吸、繁殖 等生命活动，不停地从周围环境中摄取物质进行同化作用，同时又不停地向环 境排出代谢产物及废物，因而，微生物可以看成是含有多种天然复合酶系。如 果用微生物来代替酶，作为分子识别部件将微生物固定在膜上，可制成具有复 杂功能的生物传感器，这种传感器的一个优点是稳定的时间长，可应用于工业 生产、环境监测及临床医学等领域，常见的作为分子识别元件的全细胞包括细 菌、酵母菌、真菌，植物和动物细胞等【4 3 1 。 8 第一章绪论 目前微生物传感器已经被用来分析污染物生物毒性，并取得了一系列成果。 闫鹏等人m 】以明亮发光杆菌为生物识别元件，以硅光电二极管作为细胞光信号 和电信号转换的敏感元件，构建了细菌发光传感器，分别对苯酚、乐果、乙醛、 h 9 2 + 、c u 2 + 、z n 2 + 等污染物急性毒性进行快速检测研究，同时和哺乳动物毒性 试验结果做对比。毒性测试结果表明，在p h7 0 ，温度2 0 c ，3 0 n a c i 底液条 件下，固定化菌膜发光强度达2 - , 4 n w ，稳定发光时间6 0 - - 8 0 m i n ，毒性测试的 e c 5 0 值与哺乳动物毒性试验的l d 5 , o 具有良好的相关性( 相关系数r = o 9 5 ) 。张 理兵等人【4 5 】采用光纤探头结构，以明亮发光杆菌作为指示物制作了光纤式发光 菌传感器，用于对z n 2 + 的毒性分析，试验结果表明，z n 2 + 的e c 5 0 大约为5 0 6 m g l ， 检测范围为1 0 p p b - 2 0 0 p p m ，与采用国标推荐的方法测得的结果有很好的一致 性。 近些年来，随着基因工程技术的发展，大大克服了天然菌的不足，扩大了 污染物毒性检测的范围及代表性。如a b d - e 1 - h a l e e md 等人【4 6 】将从工业废水中筛 选出的a c i n e t o b a c t e rs p d f 4 作为宿主，导入l u x 基因构建基于“l i g h to f f 模式的 基因工程发光菌生物传感器，用于测定废水中z n 、c d 、f e 、c o 、c r 等金属的生 物毒性。s i s k ot a u r i a i n e n 掣4 7 j 将质粒p 1 2 5 8 内的c a d a 抗性基因和l u c f f 基因融 合，分别建立以s t a p h y j l o c o c c u sa u r e u sr n 4 2 2 0 和b a c i l l u ss u b t i l i sb r l51 为宿主 的生物传感器，通过金属存在和不存在情况下发光强度的对比，考查金属浓度 及生物利用情况。m e r a vt a u b e r 等人1 4 8 】以2 一氯丙酸( 2 - - c p a ) 为模型污染物， 构建了一种全细胞生物传感器，所用质粒融合了假单胞菌d l d e x 译码基因的 转录启动子和无色杆菌的荧光素基因( 1 u x ) ，然后通过质粒转化到大肠杆菌宿 主细胞内，检测条件优化后，可以建立荧光强度和对应物质浓度之间关系，可 以测污染物浓度。但是这种传感器只有在2 一c p a 存在的条件下才可以表达，而 且存在质粒表达不稳定，灵敏度低，检测限下限超过1 0 0 m g l ，比环境实际值高 等一系列问题，有待进一步研究。 目前，已构建成功并用于传感器分析的基因工程发光微生物有大肠杆菌 ( e s c h e r i c h i ac o l i ) t 4 9 ：l 、欧洲亚硝化单胞菌( n i t r o s o m o n a se u r o p a e a ) 、酿酒酵母 ( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 、集胞藻( s y n e c h o c y s t i s ) 刚等，它们表现出一些新的特 点，如重组亚硝化单胞菌发光强度与硝化作用强度呈相关关系，使得一菌株同 时具备二种不同的代谢指征用于生物毒性检测p 。重组酿酒酵母能够检出具真 9 第一章绪论 核生物毒性的敌草隆( d i u r o n ) ，而相应的重组大肠杆菌则不能检出，显示了真核 微生物传感器的重要性【5 2 】。 生物传感器应用的是生物机能，与传统的化学传感器和离线分析技术相比， 生物传感器具有体积小、成本低、选择性好、灵敏度高、响应快等优势，能在 复杂的体系中进行快速在线连续监测，所以其在污染物急性毒性的检测中有着 广阔的应用前景。 1 2 联合毒性测试的意义 长期以来，毒理学研究大多数的研究工作仅局限于单一污染物的毒性研究， 对多种化合物引起的复合污染研究较少，因为单一物质的毒性研究易于操作， 耗资小，而且试验方法和原理相对简单。值得注意的是，生物体在环境中很少 甚至不可能暴露于单一污染物，而是同时或顺序暴露于多种污染物。毒理学中 把这种多种生物活性物质同时或先后在数分钟内作用于机体的生物学作用称为 联合作用。这种多种物质的联合作用与一种物质的单独作用可能完全不同。由 于化合物之间相互作用的复杂性，不能简单地根据其单一毒性来估计联合效应 的结果。仅仅研究单一污染物对生物体的毒性作用已不能真实地反映环境对机 体所造成的损害，研究多种污染物对生物体的联合毒性效应更加接近环境真实 性。1 9 3 9 年b l i s s 提出研究2 种毒物联合作用的毒性并首次提出了拮抗作用、加 和作用、协同作用的划分，至此污染物的联合效应才逐渐为人们所认识。很多 环境效应无法用单一污染物的作用机理来解释，过去依赖单一效应制定的有关 评价标准无法真实反映环境质量要求，因此复合污染研究逐渐成为环境科学发 展的重要方向之一。 目前，各国的水质标准绝大多数都是针对单一污染物的毒性数据制定的。 目前为止还没有一个系统的方法来解决混合物污染的标准问题值得注意的是。 当一种污染物在环境中的浓度低于其质量标准时，若与其它化合物共存，它也 对联合毒性起贡献作用。可见，仅仅根据化合物的单一毒性来制定标准是不够 的。这就需要我们进行联合毒性的研究，为制定环境标准和生态风险评价提供 科学依据。 1 0 第一章绪论 1 3 联合毒性作用机制 联合毒性作用机理的研究是进行联合毒性作用研究的重点之一，但目前关 于这方面的研究国内外都还处于起步阶段，缺少深入的研究。化合物间相互作 用的复杂性以及影响联合效应的因素的多样性，决定了其作用机理的复杂性。 ( 1 ) 影响生物细胞结构 两种或多种化合物通过影响生物的细胞结构，特别是膜结构而发生相互作 用。膜结构是污染物相互作用的优先部位，它的改变使膜的通透性发生变化从 而影响物质在生物体内的运输。湛灵芝【5 3 】研究了c ，和乙草胺对少根紫萍的9 6 h 联合毒性作用，发现它们对少根紫萍产生协同作用是由于它们均能破坏少根紫 萍的细胞膜结构与功能。由于其中一种污染物对细胞膜的作用，使得另一种污 染物更容易进入植物体内，加剧了对植物细胞的伤害，从而表现出协同作用。 g o g o l e v 等【5 4 j 发现重金属铜、锌、镉与荧葱对黑钙土中的细菌产生协同作用也是