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堆肥中木质索降解复合菌的筛选及其生理特性研究 摘要 木质素的有效降解是秸秆等农业废物减量化及资源化利用的难点。在自然界中， 木质素的完全降解是真菌、细菌及相应微生物群落共同作用的结果。因此，木质素降 解复合菌的开发对于木质素的降解有着重要的意义。 。 本文采用连续驯化培养的方法，从农业废物堆肥过程升温、降温和腐熟3 个阶段 的微生物菌群中分别筛选驯化出3 组具有木质素降解能力的复合菌m c l 、m c 2 和m c 3 。 通过初筛和复筛实验，筛选出一组性能稳定并具有高效木质素降解能力的复合菌，并 对其继代培养的稳定性进行了验证；然后对所筛选出的具有最强木质素降解能力的复 合菌m c l 进行营养调控研究，优化提高其木质素降解能力；最后对复合菌m c l 对天 然木质素的降解能力进行了研究。 初筛和复筛实验结果表明，从堆肥升温阶段筛选出的复合菌m c l 的木质素降解能 力最强。在3 7 静置条件下液态发酵培养1 4d ，d6 时复合菌m c l 各酶活值均达到 最大，其中木质素过氧化物酶酶活为2 5 8 3 7ul - 1 ，锰过氧化物酶酶活4 8 6 3 9ul - 1 ， 漆酶酶活4 9 2 5 ul - 1 ；d1 4 时木质素降解率达到3 6 2 5 。继代培养实验结果表明复合 菌m c l 具有较好的稳定性。 复合菌m c l 的营养调控正交试验研究表明，该复合菌的最佳培养条件是：摇床转 速为1 2 0r p m ，第一碳源为蔗糖，氮源为蛋白胨，添加诱导剂a b t s 、藜芦醇和吐温 8 0 ，添加微量元素c u 2 + 和m n 2 + ，且第二碳源碱木质素的加入时间为培养的第2d 。在 此最佳综合培养条件下，复合茵m c l 培养6d 后的i j p 酶活为5 7 9 9 1ul 1 ，m n p 酶 活为8 8 2 4 9ul 1 ，l a c 酶活为8 0 9 4ul - 1 ，培养1 0d 后的木质素降解率为4 6 7 5 。 复合m c l 对天然木质素降解实验结果表明，该复合菌对天然木质素具有很强的降 解能力，在固态发酵培养3 0d 后，木质素降解率为4 8 7 5 ，降解稻草中的木质素结 构被严重破坏，难降解的大分子长键烃被切断成易降解的小分子短键烃。 关键词：堆肥；木质素降解；复合菌；筛选；营养调控 硕l ：学位论文 a b s t r a c t t h e l i 口i no fa g r i c u l t u m lw a s t e si sd i f f i c u l tt 0b ee f f e c t i v e l yd e 伊a d e da n dr e d u c e d ，a i l d a l s oc o n s e e d 雒r e s o u r c e s ，f o r t h es t n l c t u r eo fl i 弘i ni se x t r e m e l yc o m p l e x h ln a t u r e ，t h e c o m p l e t ed e g r a d a t i o no fl i g n i ni st h er e s u l t so ff u n g a l ，b a c t e r i a la n dm i c r o b i a lc o m m u n i t y 、o 埘n gt o g e t h e r t h e r e f o r c ，t h ed e v e l o p m e n to f t h ec o m p o s i t em i c r 0 惋a lo f l i 印i i l d e g r a d i n gh a ss i g n i f i c a n tm e a n i n g n i se x p e 血l e n tw 弱d o n ea i m i n gt oi m p r 0 v ee f f e c t i v ed e 黟a d a t i o n0 fl i 口i n n r c e c o m p o s i t em i a o o r g 觚i s m s ( m c l ，m c 2 狮dm c 3 ) a b l e t 0d e 伊a d el i 印i nw e r es c f e e n e d 矗f o m t l l r e es t a g e so fa 鲥c u l t u r a lw 硒t ec o m p o s t i n gb yas e r i e so fd o m e s t i c a t e dc i l l t i v a t i o n ，锄d t h et h r e es t a g e sw e r cw 锄i i l gs t a g e ，c o o l i n gs t a g ea n df a i l i n gs t a g e ，r e s p e c t i v e l y t h e c o m p o s i t em i c r 0 0 r g a n i s m sw i t ht h em o s te f f i c i e n tl i g n i n - d e 伊a d i n ga b i l i t yw a ss e l e c t e d t h r o u g hi n i t i a la n df i l n h e rs c r e e n i n g s ，觚dt h e i rs t a b i l i t yw 勰s t u d i e dt h e n ，i t so p t i m u m i i l t e 伊a t i v ec t l l t u f cc 0 n d i t i o n sa r e 嬲f o l l o w st 0i m p r o v et h el i 印i n - d e g r a d a t i n ga b i l i t yo f m c l ，m c ld e 舯d a t i n gt h en a t u r a l l i 伊i nw a s r e s e r a c h e da tt h el 弱t “ t h er e s u l t so fi i l i t i a l 觚df i i n h e rs c r e e 丑i n 笋s h o w e dt h a tc o m p o s i t em i c r 0 0 r g 柚i s m m c ls c r c e n e df r o mt h ew a m i n gs t a g eh a dt h es t r o n g e s ta b i l i t yt od e g r a d el i 印i n 砧l t h c v a i u e so ft h ea c t i v i t i e so fl i 印i l lp e r o x i d a s e ，m a n g a n e s ep e r o x i d a s e 孤dl a c c a s er e a c h e dt h e m a x i m u mv a l u e sa f t e r6d a y sa t3 7 u n d e rt h es t a t i cc u l t u r eo fs u b m e r g e df e 册e n t a t i o n ， w h i c hw e r e2 5 8 3 7ul 1 ，4 8 6 3 9ul 1 觚d4 9 2 5u l 1 ，r e s p e c t i v e l y ，觚dt h el i 弘i n d e 黟a d a t i o nr a t ew a s3 6 2 5 a f t e r1 4d a y s t h es u b c u l t u r eo fc o m p o s i t em i c r o o r 皆m i s m m c l s h o w e dt h a ti tw 觞v e 巧s t a b l e o r t h 0 9 0 n a le x p e r i m e n ti sa d o p t e dt 0s t u d ym c l s 肌t r i t i o n a lr e g u l a t i o n t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h ec o m p o s i t em i c r o o r g a n i s mm c ls c r c e n e df 如mt h ew 锄i n gs t a g ch 弱t h e b e s ta b i l i t yt 0d e 舯d el i 印i n ；r o t a t es p e e di s1 2 0 叩m ；t h ef i r s tc a r b o ns o u r c ei ss u c r o s e ， n i t r o g e ns o u r c ei sp e p t o n e ；鼬限s ，v e r a t r ) r la l c o h o l ，t i e e n 8 0 ，c u 2 + 锄dm n 2 + s h o u l db e a d d e d ，t h es e c o n dc a r b o ns o u i ei sa d d e da f t e r2d a y s u n d e r i n gt h eo p t i m u mi n t e 伊a t i v e c i l l t u r ec o n d i t i o n s ，t h ee n z y m ea c t i v i t yo fl i p ，m n pa l l dl 丑ca f t e r6d a y sa r e5 7 9 9 1ul - 1 ， 8 8 2 4 9ul - 1a n d8 0 9 4u l 1 ，r e s p e c t i v e l y t h el i g n i nd e 铲a d a t i o nr a t ei s4 6 7 5 a f t e r1 0 d a y s m c l sd e 伊a d a t i o no fn a t u r a ll i 印i ne x p e r i n l e n t a lr e s u l ts h o w e dt h a tt h ec o m p o s i t c m i o r g 锄i s m s0 nt h en a t u r a ld e 孕a d a t i o no fl i g n i nh 碣as t r o n g ，s o l i d - s t a t ef 色皿e n t a t i o na t 3 0d ，t h el i 弘i l ld e 酉a d a t i o nr a t ew 猫4 8 7 5 ，l i 印i nd e g r a d a t i o no fr i c cs t f a wi nt h e i h 堆肥中木质素降解复合菌的筛选及其生理特性研究 s t n l c t u r cw a ss e r i o u s l yd e s t n l c t i o no fr e 矗a c t o r ym a c r o m o l e c u l e sl o n gb o n dw 弱c u ti n t o e a s i l yd e g r a d a b l eh y d r o c a r b o n so fs m a nh y d r o c a r b o nm o l e c u l e sw i t hs h o r tk e y s k e yw o r d s ：c o m p o s t i n g ；l i 印i n d e 伊a d a t i n g ；c o m p o s i t em i c r o o r g a n i s m ；s c r e e n i n g ； n u t r i t i o n a lr e g u l a t i o n 堆肥中术质素降解复合菌的筛选及j e 生理特件研究 插图索引 图1 1 苯丙烷单元基本结构5 图2 1 碱木质素紫外光谱扫描图2 5 图2 2 标准曲线2 5 图2 3l i p 酶活的变化曲线2 6 图2 4m n p 酶活的变化曲线2 7 图2 5l a c 酶活的变化曲线2 7 图2 6 木质素降解率的变化曲线2 8 图3 13 因素4 水平正交实验各因子作用趋势( 酶活性) 3 7 图3 26 因素2 水平正交实验各因子作用趋势( 酶活性) 。3 7 图3 33 因素4 水平正交实验各因子作用趋势( 木质素降解率) 3 8 图3 46 因素2 水平正交实验各因子作用趋势( 木质素降解率) 3 8 图4 1 复合菌m c l 对天然木质素稻草的降解4 4 图4 2 总木质素降解菌变化曲线：j 4 4 图4 3 固态发酵前后稻草的紫外光谱图一4 5 图4 4 固态发酵前后稻草的红外光谱图4 6 v m 硕f j 学位论文 附表索引 表2 1 漆酶和过氧化物酶平板检测2 4 表3 1 因素水平的确定3 2 表3 2l 1 6 ( 4 3 2 6 ) 正交实验分配及结果0 3 3 表3 3 正交实验l i p 酶活各因子水平平均指数。3 4 表3 4 正交实验m n p 酶活各因子水平平均指数。3 5 表3 5 正交实验l a c 酶活各因子水平平均指数3 5 表3 6 正交实验木质素降解率各因子水平平均指数3 6 表3 7 综合培养条件下m c l 的产酶能力和木质素降解率。4 0 硕 j 学位论文 1 1 堆肥原理 第1 章绪论 堆肥化就是依靠自然界广泛分布的细菌、放线菌和真菌等微生物，在- = 定的 人工条件下，有控制地促进可被生物降解的有机物向稳定的腐殖质转化的生物化 学过程，因此固体废物好氧堆肥过程实际上也是基质的微生物发酵过程【1 1 。在这 种堆肥化过程中，有机物由不稳定状态转化为稳定的腐殖质物质，对环境尤其是 土壤环境不构成危害，而把堆肥化的产品称为堆肥。 在堆肥化过程中，伴随着有机物分解和腐殖质形成的过程，堆肥材料的体积 和重量随着有机物分解和腐殖质的形成也发生着明显的变化。通常由于碳素等挥 发性成分分解转化，重量和体积均会减少一半左右。堆肥化过程是地球表面生态 过程中的一部分，并在不断地发挥着重要的作用，如地表面残留的枯枝落叶、杂 草、树皮和其它半固体的有机物分解后再进一步参与到物质和能量的循环中。 原始的堆肥过程主要是农民们将有机材料堆成垛，然后在自然条件下分解至 达到一种相对的可以被土壤接受的稳定的程度，这样制作土壤有机肥料的方法。 这个过程中没有人为的控制，其产品可以为土壤提供大量腐殖质物质和以有机状 态存在的营养物质( 如氮、磷和钾等) 。 现代堆肥过程也是通过上述原始的方法发展而来的，大量的运用于处理城市 甚或垃圾和污泥，逐渐取代了填埋和焚烧这些会造成严重二次污染的处理工艺。 1 1 1 堆肥的原理 有机固体废物是堆肥微生物赖以生存、繁殖的物质条件，由于微生物生活时 有的需要氧气、有的不需要氧气，因此，根据堆肥过程中起作用的微生物对氧气 的不同要求，可以把有机固体废物堆肥处理分为好氧堆肥和厌氧堆肥i 羽。 在好氧堆肥中，主要是靠好氧微生物的相关作用进行生物降解的。在这个过 程中，堆肥原料中的溶解性有机物质透过微生物的细胞壁和细胞膜被微生物吸收。 固体和胶体有机物质先附着在微生物体外，由生物所分泌的胞外酶分解为溶解性 物质，再渗入细胞。微生物通过自身的生命活动一一氧化、还原和合成等过程， 把一部分被吸收的有机物氧化成简单的无机物，并放出生物生长活动所需要的能 量；另一部分有机物转化为生物体所必需的营养物质，合成新的细胞物质，用于 微生物的生长繁殖，产生更多的微生物【2 l 。 一个完整的堆肥过程由升温、高温、降温和腐熟四个阶段组成。每个阶段拥 有不同的细菌、放线菌、真菌和原生动物。在每个阶段，微生物利用有机废物和 堆肥中木质紊降解复合菌的筛选及】t 生理特性研究 阶段产物作为食物和能量的来源，这个过程一直进行到稳定的腐殖物质形成为止。 有机物的厌氧消化过程主要包括产酸和产甲烷两个阶段【3 】，而对于不溶性有 机物( 有机垃圾) ，一般可认为在上述两个阶段之前还有一个液化阶段1 4 j ： ( 1 ) 液化阶段：在胞外酶的作用下，固体有机物被水解成分子量较小、可直 接被微生物利用的可溶性物质，经过水解作用后，多糖分解为可溶性单糖，蛋白 质分解为肽或氨基酸，脂肪分解为甘油和脂肪酸。此阶段起作用的细菌包括纤维 素分解菌、脂肪分解菌和蛋白质水解菌； 。 ( 2 ) 产酸阶段：进入细胞的各种可溶性物质在各种胞外酶的作用下，进一步 被分解代谢，生成各种脂肪酸，其中主要是乙酸，同时也有氢、二氧化碳和少量 其它产物。此阶段起作用的细菌是醋酸分解菌和产氢菌； ( 3 ) 产甲烷阶段：甲烷菌利用h 2 c 0 2 、乙酸和甲醇等c 1 类化合物为基质， 将其转化成甲烷，其中，h 2 c 0 2 和乙酸是主要基质。 有机垃圾厌氧发酵的三个阶段互相衔接、互相保持动态平衡。长期以来，有 关微生物作用的机理一直缺乏深入的认识，而微生物的作用在固体废物的堆肥化 和卫生填埋处理中起着主导作用。 1 1 2 堆肥的影响因素 有机废物的堆肥是多种微生物在适宜的条件下对复杂的堆肥原料中有机物进 行生物降解的复杂的动力学和生物学过程。影响堆肥生物降解过程( 特别是主发 酵过程) 的因素很多，归纳起来主要有以下几方面【5 j ： 1 、供氧量 通风是影响好氧堆肥过程和堆肥产品质量的重要因素【6 1 。堆肥过程中，氧气 供应充足可以加速有机质分解，缩短堆肥时间，加速堆肥初期温度的上升速率， 减少恶臭气体的产生。氧气的消耗率可以作为判断堆肥稳定的依据。一般认为堆 肥中的空气氧的体积含量保持在5 。1 5 之间比较适宜，低于5 会导致厌氧发酵； 高于1 5 则会使堆体冷却，导致病菌的大量存活。因此，堆肥时必须保证充分供 氧。 2 、含水率 水分为微生物生长所必需，微生物需要从周围环境中不断吸收水分以维持其 生长代谢活动，微生物体内水及流动状态水是进行生化反应的介质，固体废物中 的有机营养成份也只有溶解于水中才能被微生物摄取吸收。所以水分是否适量直 接影响堆肥的发酵速度和腐熟程度。在堆肥过程中，5 0 6 0 的含水率最有利于微 生物分解；含水率超过7 0 ，温度难以上升，分解速度明显降低；含水率低于4 0 ， 不能满足微生物生长需要，限制微生物的运行及代谢，使堆料中心部位达不到适 宜的高温，有机物难以分解，从而降低反应速率；含水率低于3 0 ，微生物在水 2 硕 ：学位论文 中摄取营养质的能力降低，微生物繁殖慢，有机物分解过程进展相当缓慢；当含 水率低于1 2 时，微生物的繁殖就会停止。 3 、有机质含量 有机物含量也是堆肥过程中的个影响因素，因为有机物是微生物赖以生存 和繁殖的重要因素。大量的研究工作表明，在高温好氧堆肥中，堆料最适合的有 机物含量为2 0 8 0 【5 1 。当有机物含量过低( 低于2 0 ) 时，堆肥过程产生的热量 不足以提高堆体的温度从而无法达到堆肥的无害化，产生的堆肥产品由于肥效低 而影响其使用价值。但如果有机质含量过高( 高于8 0 ) ，由于高浓度的有机物 堆肥过程中对氧气的需求很大，而实际供气量难以达到要求，则堆体有可能进入 厌氧状态而产生恶臭，同样不能使好氧堆肥顺利进行。 4 、碳氮比( c n ) 碳源是微生物利用的能源，氮源是微生物的营养物质。在堆肥过程中，碳源 被消耗，转化成二氧化碳和腐殖质物质，而氮则以氨气的形式散失，或变为硝酸 盐和亚硝酸盐，或是由生物体同化吸收。故就微生物对营养的需要而言，碳氮比 是一个重要因素【7 1 。微生物自身的碳氮比约4 3 0 ，用作其营养的有机物碳氮比最 好也在此数值范围内。当碳氮比为1 0 2 5 时，有机物被微生物分解的速度最大。 5 、p h 值 “ 在堆肥过程中，p h 值随着时间和温度的变化而变化，因而p h 值也是提示堆 肥分解过程的标志。p h 值并不影响堆肥化过程中有机质的降解，但是p h 值的大 小对微生物的生长有重要影响。适宜的p h 值可使微生物有效地发挥作用，而p h 值太高或太低都会影响堆肥的效率。一般来讲，p h 值在3 o 一1 2 o 之间都可以进 行堆肥。一般认为，堆制垃圾时p h 值在8 0 左右可获得最大堆肥速率，此范围内 可显著提高堆肥初期的反应速度，缩短堆肥达到高温所要求的时间，亦可避免由 于堆肥反应延缓所造成的臭味问题【引。有研究发现，堆肥初期堆制的p h 值会降 低，过低的p h 值会严重地抑制堆肥反应的进行。在堆腐垃圾时，p h 值控制在8 0 左右可以显著提高堆肥初期的反应速度，可以极大地缩短堆肥达到高温所要求的 时间，还可以避免由于堆肥反应延缓所造成的臭味问题。但当p h 值控制在5 o 时，葡萄糖和蛋白质的降解停止。污泥堆肥的p h 值范围一般应在6 o 一9 0 之间最 为合适。 6 、温度 温度是影响堆肥过程的一个重要因素，同时也是显示堆肥中微生物活性的重 要指标。温度的作用主要是影响微生物的生长繁殖，堆肥中微生物分解有机物而 释放热量，使堆肥温度上升。在堆肥过程中，堆肥温度应控制在4 5 6 5 之间。 温度超过6 5 就会对微生物的生长产生抑制作用1 7 】。堆肥过程是一个放热过程， 若不采用通风的办法进行控制，温度常可以达到7 5 8 0 ，温度过高就会过度消 3 堆肥中术质素降解复合菌的筛选及其生理特性研究 耗有机物，并降低产品质量。过低的堆温将大大延长堆肥达到腐熟的时间。 1 2 木质素生物降解研究 1 8 3 8 年，法国农学家p p a y e n 从木材中分离出了纤维素，同时还发现一种含碳量更 高的化合物，他称之为“l a m a t i e r el i 四e u s ev e r i t a b l e 。后来，e s c h u l z e 仔细分离出了这 种化合物，并称之为“l i 印i n ，是从木材的拉丁文“l i 印u m 衍生而来，中文译为“木 质素 。木质素是针叶树类、阔叶树类和草类植物的基本化学组成之一，还存在于所有 的维管植物之中( 桫椤除外) 。木质素是植物细胞中一类复杂的芳香聚合物，它是纤维 素的粘合剂，以增加植物体的机械强度1 8 】。 木质素与纤维素( c e l l u l o s e ) 和半纤维素( h e m i c e l l u l o s e ) 是构成植物骨架的主要 成分，就总量而言，地球上木质素的数量仅次于纤维素，估计每年全世界由植物生长可 产生1 5 0 0 亿吨木质素。我国森林资源不是很丰富，但农作物秸秆每年有5 6 亿吨。一 般说来，木质素在植物结构中的分布是有一定的规律的，胞间层的木质素浓度最高，细 胞内部浓度则减小，次生壁内层又增高。如用紫外显微分光法测定花旗松的胞间层木质 素为6 0 一9 0 ，细胞腔附近为1 0 2 0 。胞间层的木质素浓度虽高，但宽度窄而容积 小，因而胞间层的木质素对全部木质素的比例，春材为2 8 ，秋材为1 8 。 木质素在自然界存在的数量很大，而且总是与纤维素伴生。人类利用纤维素已有几 千年历史，而木质素真正开始研究是1 9 3 0 年以后的事，而且至今没有很好的利用，大 自然提供给人类的大宗资源，每年白白浪费掉了。 木质素作为木材水解工业和造纸工业的副产物，由于得不到充分利用，变成了环境 污染，严重地污染了环境。如在淮河流域星罗棋布的大大小小的造纸厂排出的大量造纸 黑液，其中除了碱以外，主要是无法利用的木质素，严重地污染了地表水和地下水，造 成该流域许多城镇居民生活用水困难，健康水平下降，农业生产滑坡。 1 2 1 木质素的结构 木质素是芳香族化合物通过取代基形成的不定形三维大分子聚合物，构成木质素的 结构单元是苯丙烷，同时确认了在苯环上具有甲氧基存在。木质素的元素组成随着植物 品种和分离方法不同而不同。由于甲氧基是木质素结构中的特征官能团之一，并且比较 稳定，在表示木质素元素组成时往往也将它列出【9 1 。它不同于蛋白质、多糖和核酸等天 然高分子，后者有规律的结构可用化学式来表示，而木质素只能用结构模型来表达，这 种结构模型所描述的也只是木质素大分子被切出的可代表平均分子的一部分，或只是按 测定结果平均出来的一种假定结构，所以出于不同的文献，同种木质素的元素组成也有 很大的出入。 目前一般认为木质素是以苯丙烷为结构主体，通过醚键和碳碳键连接而成的聚 酚类三维网状高分子芳香族化合物。其中，结构主体苯丙烷共有三种基本结构( 非 4 硕i ：学位论文 缩合型结构) ，即愈创木基结构、紫丁香基结构和对羟苯基结构，如图1 1 所示。 对羟苯基结构 愈刨木基结构紫丁香基结构 图1 1 苯丙烷单元基本结构 木质素的种类很多，分类方法也很多。不同的木质素一般所具有的官能团的种类和 数量也不同，因此其化学活性和类型也不同。 从生物合成过程来看，这三种基本结构单元首先都是由葡萄糖发生芳环化反 应形成莽草酸( s h i k i m i ca c i d ) ，然后由莽草酸合成上述三种木素的基本结构。最 后再由这三种基本结构聚合形成植物体内分子量更大的一些基本成分。这些基本 成分再通过任意组合、共聚化后，形成了具有不均匀的，无旋光性的、交差键和 与高度分散结构的聚合物一一木质素。木质素包围着纤维素和半纤维素一起填充 于微原纤维之间，与细胞壁成分紧密结合，构成一体，防止过多水分和有害物质 渗入植物的细胞壁，对植物起支持和保护作用。但从另一方面来说，由于木质素 与细胞壁紧密结合使其结构非常稳定，不易降解。 。 由于木质素的分子结构中存在着芳香基、酚羟基、醇羟基、羰基、甲氧基、羧基和 共扼双键等活性基团，因此可以进行氧化、还原、水解、醇解、酸解、光解、酞化、磺 化、烷基化、卤化、硝化、缩聚或接枝共聚等许多化学反应。其中，又以氧化、酞化、 磺化、缩聚和接枝共聚等反应性能在研究木质素的应用中显示着尤为重要的作用，同时 也是扩大其应用的重要途径【引。 1 2 2 木质素的物理、化学性质 木质素的物理性质，不但与植物的种类、构造、部位有关，而且还会因为分离、提 取的方法不同而有差异。原本木质素是白色或接近无色的物质，但由于在分离、制备的 过程中采用的方法不同，因此会呈现深浅不同的颜色，例如由重氯甲烷甲基化后得到的 木质素颜色呈白色，而酸木质素、铜氨木质素、过碘酸盐木质素的颜色较深，呈浅黄褐 色或深褐色等。原本木质素的相对分子量一般为几十万，而分离木质素因为在分离过程 中会产生降解、缩合和变性等变化，因此它的相对分子量就要低的多，般能达到几千 到几万。木质素的相对密度大约在1 3 5 1 5 0 之间，测定结果会因为使用的液体不同， 得到的数值也会略有差异。木质素的光学特性是目前研究木质素结构较常用、较为有效 的物理学方法，大量的研究表明【1 0 】，在红外光谱上有明确的特征峰，波峰集中在 1 6 1 0 一1 6 0 0 锄d 和1 5 2 0 。1 5 0 0 锄，属芳香环骨架结构；在紫外光谱上有明显的芳香环、 共轭烯键等吸收带；另外，核磁共振法在研究木质素的结构方面也显示了巨大的威力， 5 堆肥中木质素降解复合菌的筛选及其生理特性研究 可以对木质素上各种基团进行准确的定性和定量分析，是一种有巨大潜力的研究方法。 木质素的化学性质较为复杂，其分子结构中存在有芳香基、酚羟基、醇羟基、羰基、 甲氧基、羧基、共轭双键等活性基团，可以进行氧化、还原、水解、卤化、硝化、磺化、 酸解、醇解、烷基化、酰化、缩合或接枝共聚等化学反应，这些化学反应均为有效利用 木质素提供了良好的指导作用；科技人员充分利用这些化学性质进行工业生产，取得了 可喜的成果，同时也为对废弃的木质纤维素产品的资源化提供了一个很好的处置及处理 平台。随着近年来生物化学的迅猛发展，利用微生物制剂及酶制剂来处理木质素的方法 也不断涌现，使得人们对木质素的利用与处理更加趋向于环境友好化。 1 2 3 木质素的降解机理 由于木质素的组成和结构非常复杂，直接用木质素作为反应基质研究木质素的裂解 和液化机理非常困难，要受到多种因素影响，例如：木质素的不均一性，其它杂质等的 干扰和分析手段的制约。但是其降解的主要机理是相同的，由于木质素分子间键多为醚 键或c c 键，非常稳定，其连结单元不易水解，所以木质素的降解过程与一般生物多聚 物酶催化的水解反应明显不同，是一系列酶催化和非酶催化的非特异性的氧化还原过 程。 ( 1 ) 木质素模型化合物的c a c b 断裂现已基本确定，通过单电子转移机制，l i p 催化氧化b 1 非酚型木质素模型化合物为其芳香正离子自由基，经c a c b 断裂形成3 ，4 二甲氧基苯乙醇自由基和质子化形式的藜芦醛。有氧存在时，前者加氧后再释放超氧离 子形式羰基，或形成醇，无氧存在时则溶剂水参与而形成醇。付时雨等【8 】利用色质联用 技术分析了稻草木质素经白腐菌p 口刀淞c d ，l 幽口姗生物作用后木质素降解产物中低分子 酸性组分的主要变化及其结构，通过质谱对其主要1 1 种化合物结构进行分析，证实木 质素生物降解过程发生木质素侧链c a c b 链氧化断裂。 ( 2 ) c a 氧化机制l i p 催化b o 4 木质素模型化合物的主要反应是c a c b 断裂形成 的藜芦醛和2 甲氧基苯酚，后者在反应条件下易于聚合，同时还有相当一部分形成c a 氧化产物。这种氧化产物是正离子自由基中间体失去质子或直接失去氢形成的。在活性 氧存在时，后者更容易发生。 ( 3 ) 芳环取代机制在催化反应中形成的芳香正离子自由基与溶剂水或其他亲和试 剂作用，随底物的不同而发生不同类型的反应，例如，当苯环上的取代基是甲氧基时， 就发生脱甲氧基反应，氧化形成相应的醌。 ( 4 ) 氧的活化在木质素模型化合物氧化中一种普遍现象是分子氧与羟基取代的苯 自由基间的反应中能引起氧的活化，氧被还原成超氧离子，又与氢质子反应生成h 2 0 2 与0 2 ，这个过程是发生在分子氧与苯基中间体之间的纯化学过程。这个反应也出现在 木质素过氧化物酶的催化循环中，其结果是0 2 成为最终的电子受体。 ( 5 ) 藜芦醇及其衍生物的氧化藜芦醇是黄孢原毛平革菌的一个次级代谢产物，又 6 硕f ：学位论文 被木质素过氧化物酶所分解，分解产物主要是藜芦醛，其次是开环产物和醌，产物的分 布受p h 值控制。 ( 6 ) 芳香环开裂利用标记底物和反应物的方法对许多模型化合物进行芳香环的开 裂反应研究表明，藜芦醇开环反应的机制也适用于木质素单体、二聚体和低聚体模型化 合物，在大多数请况下都得到了多种产物的混合物。 ( 7 ) 单甲氧基芳香物的氧化对于3 ，4 二甲氧基芳香环，非但可被，魄口咒e ，d 幽口e 绍 砌邯唧d 厂f h 历代谢，而且可被l i p 氧化，单甲氧基芳香环虽然可被砌口以e ，d 幽口e 地 砌垆。印d ，咖代谢，却不被u p 氧化，然而加入少量的藜芦醇或其他的二甲氧基芳香物， 则能大大提高单甲氧基芳香物的反应速度。 ( 8 ) 醌氢醌的形成漆酶是一种含铜的酚氧化酶，它能催化酚型二聚体模型物b 1 和8 o 4 结构经过c a 芳烃断裂，产生甲氧基取代的醌氢醌。辣根过氧化物酶( h r p ) 也能得到类似的结果。单体木质素模型物如香草酸、香草醛、香草醇等也能被氧化成甲 氧基取代的醌氢醌。付时雨等【8 】用定量1 3 c n m r 技术研究了稻草经白腐菌p 口n 淞 c d 咒咖口觚降解后木质素的高分子部分的结构特征变化，发现发酵稻草木质素的”c n m r 图谱出现新的吸收峰以及某些吸收峰的强度有明显变化，这些变化证实了在生物作用过 程中木质素大分子中形成了醌类。 ( 9 ) 漆酶催化木质素氧化的机制漆酶以0 2 作电子受体催化多酚化物经四次单电。 子传递形成醌及自由基的含铜的酚氧化酶，而且不需要h 2 0 2 参与，对于木质素而言， 其反应包括脱甲氧基、脱羟基和c c 键断裂过程等。 1 2 4 木质素降解微生物 在自然界中，木质素的完全降解是真菌、细菌及相应微生物群落共同作用的 结果，其中真菌起着主导作用。根据木材腐朽类型，降解木质素的真菌一一木腐 菌可分为白腐菌、褐腐菌和软腐菌3 类【9 1 。细菌中的厌氧梭菌、假单孢菌、不动 杆菌和芽孢杆菌等原核生物对于在土壤中木质素的转化和降解具有重要作用，但 土壤中木质素的降解是土壤微生物区系多种类型微生物协同进行的结果，其进程 缓慢，且这类原核生物的多酚氧化酶是胞内酶，这也决定了其在木质素降解菌的 研究中处于一个相对从属的地位。 另外，细菌在木质素降解过程中主要起着间接的作用，即细菌与软腐真菌协 作使木质素易于受到真菌的攻击，且可去除对腐朽真菌有毒性的物质【1 0 】。而真菌 在木质素降解中起主要作用。真菌通过菌丝作用进入到木质材料中，同时菌丝分 泌出特殊的胞外酶攻击植物细胞壁中的木质纤维素，导致木质素与纤维素的解聚 和溶解i l 。 l 、降解木质素的真菌 根据真菌对木质纤维素中不同组分的腐朽类型可分为白腐菌、褐腐菌和软腐 7 堆肥中术质素降解复合菌的筛选及】e 生理特性研究 菌。前两者都属于担子菌纲( 肋s 棚) ，c d 砌口) ，软腐菌属于囊菌纲( 彳s 肌) ，c e f 酷) 或半知菌类( 凡删加p e c 厂e c 打) 。 可按木腐败真菌降解木材多聚物的不同分为三个不同的类群： ( 1 ) 软腐菌降解多聚糖的作用优于降解木质素的作用，它一般只能分解纤维 素，木质素则被完整地保留下来。大多数软腐菌还可以从细胞腔向复合胞间层产 生腐蚀。但它对木质素的降解能力极弱。这类真菌主要属担子菌纲和半知菌纲的几个 属； 。 ( 2 ) 褐腐菌主要分解纤维素和半纤维素，而对木质素的影响却极小，致使最终的 降解产物含有褐色的木质素成分。这类真菌主要属担子菌纲，主要有拟管革裥菌等 1 8 种； ( 3 ) 白腐菌是一种丝状真菌，白腐菌能大量降解木质素，不产生色素，也能降解 纤维素和半纤维素，是少数能将木质素完全降解的微生物。能在木质材料中形成 白色腐朽【9 】。目前，研究得较多的白腐菌有：黄孢原毛平革菌( 黝口厅e r d 幽e 纪 曲珊即r f “所) 、彩绒革盖菌( c d ，协m j 圪r s f c d 如，) 、变色栓菌( 劢口朋e 泐y e 糟记d f d ，) 、 糙皮侧耳( 盹“r d 加d s 抛口姗) 、烟管菌( 历e 砌，l 如，口口批细) 等【1 1 _ 1 5 1 。白腐真菌绝 大多数为担子菌，少数为子囊菌，它能把木材中的木质素和纤维素彻底降解为二氧 化碳和水。 白腐菌能够分泌胞外氧化酶降解木质素，因此被认为是最主要的木质素降解 微生物。 2 、降解木质素的细菌 关于细菌降解木质素的机理，存在较多的争议，目前的研究主要局限于一系 列木质素类模型化合物的降解，以此来推测木质素降解可能的机理，而且很多研 究工作不具有重复性。目前已知细菌对木质素结构的作用主要包括丙烷支链c a 位上基团氧化形成羰基、低分子木质素降解产物的环内裂解和环修饰、c a c b 键 断裂以及脱甲基。另外，研究表明，细菌降解木质素发生在初级代谢阶段，木质 素降解酶的合成时间是在细菌生长的对数期和稳定期。 3 、降解木质素的放线菌 放线菌对木质素主要作用是在降解过程中增加木质素的水溶性促进它们的降 解。由于放线菌能穿透木质纤维素等不溶基质，在中性、微碱性土壤或堆肥中， 放线菌参与有机质的初始降解和腐殖化。其中链霉属的丝状菌降解木质素最高可 达2 0 ，非丝状菌在一定程度上也能引起木质素的降解，但对它们少有人注意。 通常非丝状菌木质素降解率小于1 0 ，只能降解木质素低分子量部分和木质素的 降解产物。但其在降解过程中能够增加木质素的水溶性，有研究表明在堆肥后期， 放线菌对木质素降解起着主要作用。 8 硕 j 学位论文 1 2 5 木质素的降解酶系 木质素结构复杂，其降解酶类的合成需由水解碳水化合物提供能量，木质素的包被 作用又阻碍着纤维素的降解。所以木质素降解构成自然界碳素循环的限速步骤。白腐菌 是自然晃中木素最有效降解者。7 0 年代确定了白腐菌在实验室条件下降解木素营养需 求；8 0 年代发现了菌的两种重要酶系，木素过氧化物酶系( l i p ) 和锰过氧化物酶系 ( m n p ) ；9 0 年代展开了对以上酶系催化特征、分子生物学的研究，同时在生物制浆、 生物漂白以及制浆废水的白腐菌处理等领域也蓬勃开展起来。 白腐菌降解木素产物所含碳、甲氧基、氢比相应原木素少，而含较多氧、羰基，芳 香性降低【1 6 】。a 、b 不饱和链烃增加，但分子量近似于原木素。在木质素生物降解过程 中会产生很多酶系，到目前为止研究得最多并且认为最有效得木质素降解酶有3 种，即 木质素过氧化物酶( i j 朗i np e r o x i d a s e l i p ) ，锰依赖过氧化物酶( m a n g a n e s e p e i d a s e s m i l p ) 和漆酶( l a c c a s e ) 。 1 、木质素过氧化物酶 木质素过氧化物酶( l i p ) 是一系列含有一个f e ( s ) 叶琳环( i x ) 血红素辅基 的同功酶，分子量3 7 0 0 0 4 7 0 0 0 。l i p 主要是氧化苯酚使之成为苯氧残基【1 。7 1 。木 质素过氧化物酶在温度大于3 5 时开始失活，p h 值为4 5 时很稳定，在p h 值 3 o 以下极不稳定，加入藜芦醇可极大地增加酶的稳定性。而如e d t a ，叠氮化物、 氰化物和3 一氨基1 ，2 ，4 三吡咯都能抑制它的活性，但氯离子不会抑制。无其它还 原性底物时，h 2 0 2 会引起酶的部分不可逆失活。l i p 的催化机理：高铁酶首先被 h 2 0 2 氧化生成二价氧化产物一一复合物i ( c o m p o u n di ) ，然后复合物l 获得一个 电子而被还原，得到一价酶中间产物一一复合物i i ( c o m p o u n di i ) 和一个自由基 产物，复合物i i 能够作用于木质素或其它基质，这个催化反应因为一个电子的还 原反应而不断进行下去，在有过氧化物存在时，可以继续氧化为复合物i i i ( c o m p o u n di i i ) ，但这不是催化反应的部分。 2 、锰过氧化物酶 锰过氧化物酶( m n p ) 是一种糖蛋白，分子量约为4 6 0 0 0 ，由一个铁血红素 基和一个m n 2 + 构成了活性中心，另外还有两个起稳定结构作用的c a “，其分子中 有1 0 条长的蛋白质单链，一条短的单链，它是唯一的一个中间过氧化物酶，因为它的 主要底物为有机酸。m n p 主要是从m n 2 + 和h 2 0 2 的氧化中得到m n 3 + ，然后m n 3 + 氧化苯 酚使之成为苯氧残基。而每种酶在木质素降解中的具体作用还不甚清楚。锰过氧化物酶 的活性不仅依赖于h 2 0 2 ，还依赖于m n 2 + 的存在。在温度大于4 0 时开始失活，它的最 佳稳定p h 值是4 8 ，加入“惰性 蛋白质( 如牛血清蛋白) 和m n 2 + 可提高酶的稳定性。 另外，m n 2 + 、蛋白质( 如凝胶、牛血清蛋白、蛋清蛋白) 和a 经基酸( 如苹果酸、柠 檬酸) 都能促进酶活性的提高。锰过氧化物酶催化反应机理是：h 2 0 2 的两个电子将高铁 9 堆肥中术质素降解复合菌的筛选及其生理特性研究 酶氧化，形成中间产物复合物i ( c o m p o u n d1 ) ，复合物i 将m n 2 + 氧化为m n 3 + ，酶 被还原为一价中间产物复合物i l ( c o m p o u n di i ) ，复合物i i 是锰过氧化物酶非常重 要的中间物质。在过量的过氧化物存在时，酶被氧化为复合物i i i ( c o m p o u n di i i ) ，但 同样这不是催化反应的部分。 3 、漆酶 漆酶( l a c c a s e ) 是一种含铜的多酚氧化酶，主要来源于生漆和真菌，分子量 为6 0 0 0 0 8 0 0 0 0 ，含有1 5 。2 0 的碳水化合物、5 2 0 5 5 0 个氨基酸残留物。由于含 糖量高，难得到x 一衍射分析用的漆酶单晶，虽然它的三维空间结构尚不清楚， 但已经证实，漆酶中的铜离子在催化氧化反应中起决定作用1 1 7 l 。很多白腐真菌产 生的漆酶，它的确切作用机制尚不清楚。但其主要作用是催化氧化还原反应，在 植物体内，它催化木质素的聚合过程，使木质素沉积，而真菌产生的漆酶则进行 相反的过程，使木质素发生降解。作为一种多酚氧化酶，它可催化氧化酚类或芳 胺类等多种底物。氧化酚或芳胺先失去一个电子生成自由基，后者发生一系列非 酶反应，氧化成醌，在有0 2 存在时，还原态漆酶被氧化，0 2 还原成水。底物自 由基不稳定，可进一步发生键的断裂或生成，导致裂解或聚合反应。因此，底物 分子可进一步聚合生成复杂的产物，也可催化芳香环支链c c 键断裂。漆酶的作 用因不同菌合成的类型不同而不同。漆酶作为一种多酚氧化酶，它可催化氧化酚 类或芳胺类等多种底物，同时分子氧被还原为水。在这一过程中，漆酶从底物分 子中提取一个