（环境工程专业论文）复合型微生物絮凝剂制备及絮凝性能的研究.pdf

摘要 摘要 微生物絮凝齐l j ( m i c r o b i a lf l o c c u l a n t s ，简称m b f ) 是由微生物产生的可使液体 中不易沉降的固体悬浮颗粒、菌体细胞及胶体颗粒等凝聚沉淀的特殊高分子物 质，具有高效、无毒、可生物降解等特点，近年来受到了广泛的关注。 针对m b f 的研究，一直以来主要集中在絮凝剂产生菌筛选和菌株培养液处 理废水的实验室小试阶段，且大多是针对单一菌群的，研究中存在菌株筛选困难、 培养成本高、絮凝过程机理不清等问题。近年来，为了提高微生物絮凝剂产生 菌活性，降低培养成本，复合型微生物絮凝剂开始受到研究者的关注。 本论文首先从土壤和活性污泥中筛选和分离出微生物絮凝剂产生菌单一菌， 并根据有效微生物原理，构建比单一菌株产生的微生物絮凝剂更高效的复合型微 生物絮凝剂，然后选取絮凝性能最佳的复合型微生物絮凝剂产生菌群，进行培养 条件优化及絮凝特性研究，最后将复合型微生物絮凝剂应用于废水处理进行实际 应用研究。 本研究通过菌株的分离纯化共从土壤和活性污泥中筛选分离出3 7 株菌种， 其中细菌1 2 株、霉菌1 l 株、真菌7 株、放线菌7 株。3 7 株菌株中具有絮凝活 性的菌株有2 0 株( e 2 ( ) o ，e 2 ( ) 表征以通用发酵培养基为对照实验计算出的 絮凝率) 。根据有效微生物原理，选取e 2 ( ) 2 0 的1 5 株菌株按等比例两两混 合培养，得到的由复合菌群产生的复合微生物絮凝剂的絮凝效果比单一菌株有着 明显提高，有3 种复合菌群发酵液的絮凝率e 2 ( ) 在8 0 以上，他们分别是 x j l 2 + z j 6 ，z j 6 + m j 9 和z j 7 + m j l 0 ，絮凝率分别为8 6 6 、8 4 9 和8 5 7 。由絮 凝效果最佳的复合菌群x j l 2 + z j 6 产生的复合型微生物絮凝剂x z 最佳培养条件 为：培养时间4 8 5 6 h ，培养温度3 0 ，通用发酵培养基初始p h 值7 5 ，摇床转 速1 6 0 r p m 。 采用有机溶剂提取法，得到粗制的固态复合型微生物絮凝剂x z 0 9 9 9 ，可以 计算出其产量约为3 9 6 9 l 。复合型微生物絮凝剂x z 絮凝活性物质主要分布在 上清液中，含有蛋白质和多糖成分。对该复合型微生物絮凝剂进行了相关特性 研究，研究结果表明该复合型微生物絮凝剂具有良好的热稳定性和p h 值稳定性， 其最佳絮凝条件为：p h 值7 0 ，复合型微生物絮凝剂x z 投加量相对于4 0 9 l 的 高岭土悬浊液为2 o m l 1 0 0 m l ，1 c a c l 2 最佳投加量为2 0 0m g l 。 广东i ：业大学一f ：学硕十学位论文 将复合型微生物絮凝剂x z 应用于生活污水处理，研究结果表明复合型微生 物絮凝剂x z 对生活污水中s s 和色度有一定的去除率。将复合型微生物絮凝剂 x z 应用于对污泥的絮凝作用研究，研究结果表明复合型微生物絮凝剂x z 可以 加快污泥沉降速度，改善污泥的沉降性能，降低污泥沉降比，降低污泥的容积指 数。 关键词：复合型微生物絮凝剂；培养条件；絮凝特性；实际应用 i i a b s t r a c t a b s t r a c t m i c r o b i a lf l o c c u l a n t s ( m b f ) a r eak i n do fs p e c i a ls u b s t a n c e sw i t hh i g h m o l e c u l a ra m o u n tt h a ta r ep r o d u c e db ym i c r o o r g a n i s m s t h e yc a nf l o c c u l a t e s u s p e n d e ds o l i d s ，c e l l s ，a n dc o l l o i d a ls o l i d s w i t ht h ea d v a n t a g e so fh i g he f f i c i e n c y , i n n o c u i t ya n db i o d e g r a d a b i l i t y , m o r ea n dm o r ea t t e n t i o nh a sb e e np a i dt o m b f r e c e n t l y s of a r , t h er e s e a r c ho nt h em b fh a sm a i n l yf o c u s e do nt h es m a l ls c a l e e x p e r i m e n tp h a s ei nt h el a bo fs c r e e n i n gs t r a i n sw h i c hc a np r o d u c ef l o c c u l a n ta n d s e w a g et r e a t m e n tb yt h ef e r m e n t a t i o nb r o t h ，b u tm o s t l yr e f e r r e dt ot h es i n g l e s t r a i n a n dw i t ht h ep r o b l e mo fd i f f i c u l t yi ns c r e e n i n gt h es t r a i n s ，t h eh i g hc u l t i v a t i n gc o s t a n dt h eu n c l a r i t yo f t h ef l o c c u l a t i o np r o c e s s r e c e n t l y , i no r d e rt oi m p r o v et h ea c t i v i t y o ft h ef l o c c u l a n ta n dc u td o w nt h ec u l t i v a t i n gc o s t ，c o m p l e xb i o f l o c c u l a n th a sb e e n p a i dm o r ea n dm o r ea t t e n t i o nt o t h es t u d yf i r s t l ys c r e e n e das i n g l es t r a i nw h i c hc a np r o d u c em b f ，a n di nt e r m o ft h em e c h a n i s mo fe f f e c t i v em i r c o o r g a n i s m s ，t h ec o m p l e xb i o f l o c c u l a n tw i t h h i g h e rf l o c c u l a t i o na c t i v i t yt h a nm b fp r o d u c e db yas i n g l es t r a i nw e r ec o n s t r u c t e d t h e nt h eo p t i m i z a t i o no fi t sc u l t u r a lc o n d i t i o n sa n dt h ef l o c c u l a t i o nc h a r a c t e r i s t i c so f t h ec o m p l e xb i o f l o c c u l a n tw i t hb e s tf l o c c u l a t i o na c t i v i t yw e r es t u d i e d i nt h ee n d ，t h e a p p l i c a t i o no f t h ec o m p l e xb i o f l o c c u l a n ti nw a s t e w a t e rt r e a t m e n tw a se x a m i n e di nt h e p a p e r t h i r t y s e v e ns t r a i n sw e r es c r e e n e da n di s o l a t e df r o ms o i lf r o mc a m p u sa n d a c t i v es l u d g e ，i n c l u d i n gt w e l v eb a c t e r i as t a i n s ，e l e v e nm i l d e ws t r a i n s ，s e v e ne p i p h y t e s t a i n s ，a n ds e v e na c t i n o m y c e ss t a i n s t h e r ea r e2 0s t r a i n sw i t hf l o c c u l a t i o na c t i v i t y w h o s ef l o c c u l a t i n gr a t ei sa b o v ez e r o ( e 2 ( ) o ) i nt h e s et h i r t y - s e v e ns t r a i n s i nt e r m o ft h em e c h a n i s mo fe f f e c t i v em i r c o o r g a n i s m s ，t h ef i f t e e ns t r a i n sw i t h ( e 2 ( ) 2 0 w e r em i x e do n eb yo n ew i t ht h es a m ep r o p o r t i o na n dt h e nw e r ec u l t u r e di nc e r t a i n c o n d i t i o n t h ef l o c c u l a t i o na c t i v i t yo ft h ec o m p l e xb i o f l o c c u l a n tt h a tw ec o n s t r u c t e d i sm u c hh i g h e rt h a nm b f p r o d u c e db yas i n g l es t r a i n t h ec o m p l e xb i o f l o c c u l a n tw i t h h i g hf l o c c u l a t i n gr a t ea b o v e8 0 a r ep r o d u c e db ym i x e ds t r a i n sx j 12a n dz j 6 ，z j 6 a n dm j 9a n dz j 7a n dm j i o ，w h o s ef o c c u l a t i n gr a t ea r e8 6 6 ，8 4 9 a n d8 5 7 r e s p e c t i v e l y t h eo p t i m i z a t i o nc u l t r u r a lc o n d i t i o n so ft h ec o m p l e xb i of l o c c u l t a n tx z p r o d u c e db yx j1 2a n dz j6a r et h ec u l t u r a lt i m e4 8 - 5 6 h o u r s ，t h ec u l t r u a lt e m p e r a t u r e i i ! 广东i ：业大学一f ：学硕十学位论文 3 0 。c ，t h ei n i t i a lc u l t u r a lm e d i u mp h7 5a n dt h er o t a t i o ns p e e d16 0 r p m t h es o l i dc o m p l e xb i o f l o c c u l t a n to b t a i n e di sa b o u t0 9 9 9b y o r g a n i cs o l v e n t e x t r a c t i o n ，a n dt h ep r o d u c t i o no fc o m p l e xb i o f l o c c u l t a n tc a nb e3 9 6 9 l t h e f l o c c u l a t i n ga c t i v a t e ds u b s t a n c e sd i s t r i b u t e dm a i n l yi ns u p e r n a t a n t ，w h i c hc o n t a i n s p r o t e i na n da m y l o s e t h ec h a r a c t e r i s t i c so ft h ec o m p l e xb i o f l o c c u l t a n tx zw e r e s t u d i e di nt h ep a p e r , i ti n d i c a t e dt h a tt h e c o m p l e xb i o f l o c c u l t a n tx zh a st h e c h a r a c t e r i s t i c so fh i g ht h e r m o - s t a b i l i t ya n dp hs t a b i l i t y t h eb e s t f l o c c u l a t i n g c o n d i t i o ni sp h7 0 ，t h ed o s a g eo fc o m p l e xb i o f l o c c u l t a n tx zt o 4 0 9 lk a o l i n s u s p e n s i o n2 0 m l l0 0m l ，t h eo p t i m i z a t i o nd o s a g eo fl c a c h2 0 0 m g l t h ec o m p l e xb i o f l o c c u l a n tx z a p p l i c a t i o nr e s u l ti n d i c a t e dt h a ti th a sac e r t a i n r e m o v a lo ft h es sa n dc h r o m ai nt h ed o m e s t i cs e w a g ea n di ta l s oc a nf l o c c u l a t et h e s h d g e ，i tc a na c c e l e r a t et h es p e e do fs l u d g es e d i m e n t a t i o n ，i m p r o v et h ec h a r a c t e r i s t i c o fs h d g es e d i m e n t a t i o na n dr e d u c et h es va n ds v io fa c t i v a t e ds l u d g e k e yw o r d s ：c o m p l e xb i o f l o c c u l a n t ；c u l t u r a lc o n d i t i o n ；f l o c c u l a t i o nc h a r a c t e r i s t i c s ； a p p l i c a t i o n 独创性，打明 独创性声明 秉承学校严谨的学风和优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在 导师的指导下进行的研究以及所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注 和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表的或撰写过的研究成果，不包含 本人或其它用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明，并表示谢意。 本学位论文成果是本人在广东工业大学读书期间在导师的指导下所取得的， 论文成果归广东工业大学所有。 申请学位与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任，特此声明。 4 5 指导教师签字： 论文作者签字： 2 0 0 8 年5 月岁。日 第章绪论 第一章绪论 1 1 本研究课题的来源、目的及意义 絮凝剂又称沉降剂，是一类可使溶液中不易沉降的固体悬浮颗粒凝集、沉淀 的物质。目前絮凝沉降技术已被广泛应用于给水、废水处理和污泥脱水等领域， 絮凝效果主要取决于絮凝剂种类。絮凝剂分为无机絮凝剂和有机絮凝剂两类，无 机絮凝剂有硫酸亚铁、氯化亚铁、硫酸铝、碱式氯化铝和明矾等；有机絮凝剂主 要是高分子聚合物，包括合成有机高分子( 如聚丙烯酰胺、聚丙烯酸钠、聚苯乙 磺酸盐、聚氧化乙烯等) 和天然高分子絮凝剂( 如多聚糖类、壳聚糖等) 。无 机絮凝剂主要是对水中具有相反的电荷的胶体起中和、压缩双电层作用，从而使 胶体脱稳凝聚，实现固液分离，但投加量大，效果不佳恤3 1 。有机高分子絮凝剂主 要是对已脱稳的凝聚颗粒起吸附架桥作用，从而使其快速形成大的絮体，易于分 离，但悬浮物的回收率低，滤饼含水率高”。，。而且，部分传统的无机及人工合成 的有机高分子絮凝剂易引发老年痴呆症”1 和具有“三致”效应n l ，对人体和环境带来 了很大的危害。因此，开发新型的无污染的绿色坏保的絮凝剂迫在眉睫。 微生物絮凝齐1 ( m i c r o b i a lf l o c c u l a n t s ，简称m b f ) 是由微生物产生，可使水体 中的悬浮颗粒、菌体细胞及胶体粒子凝聚、沉淀的一类次生代调 产物，主要含有 糖蛋白、多糖、蛋白质、纤维素和d n a 等物质【8 】。它就是利用生物技术，从微生 物或其分泌物提取、纯化而获得的一种安全、高效、且能自然降解的新型水处理 剂。微生物絮凝剂因其高效、无毒、可生物降解等特点，因而受到了广泛关注徊”1 。 从化学本质上看，微生物絮凝剂主要是微生物代谢过程中产生的各种多聚糖 类。这类多聚糖有些由单糖单体组成，有些是由多糖单体构成的杂多聚糖，有些 生物絮凝剂是蛋白质( 或多肽) ，或者是含有蛋白质( 或多肽) 。另外，一些絮凝 剂中还含有无机金属离子，如c a 2 + 、m 9 2 + 、a 1 3 + 和f e 3 + 等m 一。它与传统无机和有机 絮凝剂相比，就有独特的优势“引： 1 易被微生物降解，无毒无害，安全性高； 2 无二次污染； 3 使用范围广，效果好； ， 4 微生物絮凝剂的生产和使用成本低； 广东i ：业大学i ：学硕十学位论文 5 具有除浊和脱色性能； 6 有的还具有受p h 值影响小，热稳定性好，用量小等特点。 目前针对m b f 的研究一直以来主要集中在絮凝剂产生菌筛选和菌株培养液 处理废水的实验室小试阶段，且大多是针对单一菌群的，存在菌株筛选困难、培 养成本高、絮凝过程不清等问题“”。近年来，为了提高微生物絮凝剂产生菌活 性，降低培养成本，复合型微生物絮凝剂开始受到研究者的关注。复合型微生物 絮凝剂是采用廉价的原料纤维素作为底物将多种菌株混合发酵后制得微生物絮 凝剂，获得了比单一菌株更高的絮凝效果他“。 从所查阅文献来看，到目前为止，微生物絮凝剂的研究主要针对单一菌种的 研究，关于复合型微生物絮凝剂的研究还比较少，本课题主要通过实验寻求比单 一菌株产生的微生物絮凝剂更高效的复合型微生物絮凝剂，并将其应用于污泥和 生活污水处理，对其絮凝性能进行研究，应用于污泥处理旨在改善污泥沉降性能， 应用于生活污水处理旨在降低废水的s s 和色度，为进一步产业化和工业化提供 理论依据，具有一定的理论和现实意义。 本课题旨在从活性污泥和土壤中筛选出微生物絮凝剂产生菌，根据有效微生 物技术原理构建高效的复合型微生物絮凝剂产生菌群，通过优化培养条件，培养 制备复合型微生物絮凝剂，将其应用于污泥和废水处理进行絮凝性能的研究。本 课题属于应用基础研究，实验室研究结果为工业应用提供试验数据。 1 2 国内外研究动态 目前已报道微生物絮凝剂产生菌很多，包括细菌、放线菌、真菌等。至今发 现的已报道的具有絮凝性的微生物已达到8 6 个种，其中细菌4 1 种，放线菌8 种， 真菌2 3 种，藻类4 种恤，。目前国内研究的微生物絮凝剂多以单一菌种为主，关于 复合微生物絮凝剂的研究较少。 文献报道中，最早发现的具有分泌絮凝剂能力的微生物，即絮凝剂产生菌， 是1 9 3 5 年b u t t e r f i e l d t 圳从活性污泥中筛选得到的。 1 9 7 1 年，z a j i c $ 1 k n e n t t i n g 似”从煤油中分离出了一株棒状杆菌，该菌分泌的 多聚物对污水具有絮凝作用。 1 9 7 5 年，n a k a m u r a 等纠从霉菌等2 1 4 种菌株中，筛选出1 9 种具有絮凝能力的 第章绪论 微生物，其中霉菌8 种，细菌5 种，酵母菌1 种，以酱油曲霉a j 7 0 0 2 产生的絮凝剂 最好。 1 9 8 5 年，t a k a g ih 等n 副人研究出了p f l 0 1 生物絮凝剂，相对分子质量约为 3 0 万，主要成分是半乳糖胺，它对枯草杆菌、大肠杆菌、啤酒酵母等均有良好 的絮凝效果。 1 9 8 6 年，r y u i c h i r ok u r a n e 等似人采用从自然界分离出的红球菌属微生物 r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i ss 1 菌株，用特定培养基及培养条件制成絮凝剂n o c 1 ， 并且把它用于畜产废水处理、膨胀污泥处理、砖场生产废水处理以及废水的脱色 处理，都取得了很好的处理效果，被认为是目前发现的最好的生物絮凝剂。 19 9 4 年，k u r a n e 和m a t s u y a m a 等报道了厄氏菌属、不动杆菌属、土壤杆菌 属和肠杆菌属在产生絮凝剂过程中的协同作用。 我国对微生物絮凝剂的研究起步比较晚，刚丌始都进行单一菌株的微生物絮 凝剂的相关研究。自从2 0 0 3 年马放驯提出了复合型微生物絮凝剂的概念以后， 复合型微生物絮凝剂成为研究的热点。 马放等旧- 从活性污泥和土壤中分离筛选出的4 株絮凝率较高的菌株，经鉴定 均为芽孢杆菌属。把其中任意两株混合培养之后，发现f 2 和f 6 发酵液的絮凝率较 原来的单菌株均有提高。 游映玖m 从含大量微生物菌群的土壤中筛选出了具有产絮效果的y 5 菌液。比 较不同培养条件下y 5 菌液的絮凝率得出：菌液絮凝性能是其中3 种复合菌株共同 作用的结果；培养基初始p h 值在5 0 9 0 的范围内时，y 5 菌液的生长量及其上清 液的絮凝率都较高。在培养时间到4 0 h 后，y 5 菌液生长量达到最大值；培养时间 达至1 6 5 h 时，菌液絮凝率最高。 马放等口订通过实验测定复合型微生物絮凝剂的絮凝效果。以松花江源水和强 酸性废水为对象，测定出了絮凝剂的最佳投加量、最佳p h 值范围和助凝剂c a c l 2 的投加量。实验表明，对于不同的水质，絮凝剂投加量不同，松花江源水的最佳 投加量在1 4m l l 左右；对于酸性废水，投加量要高一些，最佳d h 值在7 5 左右。 复合型微生物絮凝剂需要投加助凝剂才能起到絮凝效果，投加1 0 氯化钙 1 5 m l l 就可以达到最佳絮凝效果。温度对絮凝率的影响极小，并且沉降曲线表 明，在i o 。c 时，沉降所需时间最短。 张志强等恤，从筛选到的絮凝剂产生菌中构建出能比单一菌群产生更高絮凝 广东i ：业大学i ：学硕十学位论文 活性的复合菌群复合菌群i ( b a f r t 4 + c y g s l ) 。为降低复合菌群1 的培养成 本，尝试用啤酒废水替代葡萄糖作为培养基中的碳源和能源并获得成功。在优化 培养条件下，复合菌群1 所产m b f 的絮凝活性达9 6 8 。复合菌群1 所产m b f 对靛 蓝印染废水有良好的处理效果，最大c o d c ，去除率和脱色率分别达7 9 2 * 1 1 8 7 6 。 靳慧霞等n 川通过实验考察tf 2 f 6 复合型微生物絮凝剂分别与无机絮凝剂氯 化铝、无机高分子絮凝剂聚合氯化铝、有机絮凝剂聚丙烯酰胺复配使用处理泥浆 废水絮凝条件和絮凝效果，并对水源水和工业废水中的处理效果进行了测定。实 验表明：f 2 f 6 微生物絮凝剂与化学絮凝剂配合使用不仅获得更好的净化效果， 而且可以大大降低絮凝剂的总投加量。 关毅等协“进行了e m 复合菌群产絮凝剂的絮凝特性的研究，研究结果表明， e m 复合菌群产絮凝剂对高岭土悬浮液絮凝率可达9 0 。通过添加适当助剂可将 絮凝率提高至9 8 ，而且p h 值2 1 2 范围内，絮凝率均可达到9 2 以上，而且 具备良好的热稳定性。对多种实际污废水的絮凝率达8 5 9 6 ，进一步证明该 絮凝剂有较宽的适用性。并经初步鉴别为酸性多糖物质。 张志强等m 一以啤酒废水为培养基，利用其中的碳源和能源，对复合菌群进行 发酵培养，制得微生物絮凝剂。将此絮凝剂处理靛蓝印染废水，最大c o d c ，去除 率和脱色率分别达7 9 2 和8 7 6 。系统研究y p h 、微生物絮凝剂用量和助凝剂 ( 1 c a c l 2 溶液) 用量对处理效果的影响，得出了微生物絮凝剂去除c o d c r 和脱色 的最佳工艺条件，并对该絮凝剂的絮凝机理进行了初步探讨。 李琳等m ，进行了复合微生物絮凝处理红薯淀粉废水的研究。利用胶质芽孢杆 菌和酿酒酵母能利用水溶性淀粉和蛋白质的特性，直接用红薯淀粉废水培养，并 用它们产生的絮凝作用处理红薯淀粉废水。结果表明，在适量氯化钙助絮凝作用 下，仅以2 5 的絮凝菌液，在p h 值9 5 的条件下，絮凝率高达9 7 ，红薯淀粉废 水的c o d 去除率达到6 5 ，p h 值8 0 左右。经复合微生物絮凝剂处理得到的沉淀 物是富含蛋白质的营养物质，干燥后可以制备成高级饲料。 马会强等7 1 考察了复合型微生物絮凝剂产生菌在4 0 1 6 0 m p a 高压处理前后的 形态、生理生化性质及代谢产物的絮凝活性变化。结果表明，高压对复合菌的形 态有明显的影响，对菌的生理生化性质影响较小。絮凝活性实验表明，高压作用 下，2 号组成菌代谢产物的絮凝活性有明显的压力阈值，在7 0 m p a 时，其絮凝率 4 第- 章绪论 为6 0 9 ，而复合菌代谢产物的絮凝活性无明显变化，几种压力下絮凝率皆在9 5 以上。 杜宝山等引研究复合型微生物絮凝剂产生菌的生长曲线变化在不同时期的 值、基质、葡萄糖、硫酸铵含量、絮凝活性、产量变化、细胞絮凝效果变化等。 结果表明，在整个生长周期中，p h 值基本不变；碳氮源变化显著，并存在相关 性；进入稳定期后，6 0 h 时，絮凝活性达到最大值9 7 3 5 ，此后，絮凝活性数值 下降，但不明显，絮凝剂产量最大值为3 0 2 9 l ；细胞絮凝效果与细胞生长呈f 相关性。鉴定结果表明，3 种单菌分别为b r e v i b a c t e r i u mm c g r e l l n e r i ，b u r k h o l d e r i a g l u m a e ，c r y p t o c o c c u sa l b i d u sv a r a e r i u s 。 张志强等r 圳进行了复合菌群的构建及其所产微生物絮凝剂的动力学研究，用 2 株产低效絮凝剂产生菌构建出产高效絮凝剂的复合菌群复合1 。实验表明， 复合l 能在啤酒废水培养基中生长良好，并产生絮凝活性为9 6 8 的m b f 。该m b f 中含多糖和蛋白质等有机高分子物质。它能有效去除靛蓝印染废水中的c o d 和色 度，两者的最大去除率分别为7 9 2 和8 7 6 。考察了该m b f 在优化工艺条件下 对靛蓝印染废水的絮凝过程，并得出了其去除c o d $ 口脱色的经验动力学方程。 1 3 本课题的主要研究内容和技术路线 本课题旨在从活性污泥和土壤中筛选出微生物絮凝剂产生菌，根据有效微生 物技术原理构建出比单一菌群产生更高絮凝活性的复合型微生物絮凝剂产生菌 群，通过培养条件优化确定最佳培养条件。初步确定复合型微生物絮凝剂的成分 及絮凝活性分布。将复合型微生物絮凝剂实际应用于废水处理对其絮凝性能进行 相关研究。应用于污泥处理旨在改善污泥的沉降性能；应用于生活污水处理旨在 降低生活污水的s s 和色度。 本课题主要研究内容如下： 1 从不同的微生物源中分离筛选出微生物絮凝剂产生菌； 2 根据有效微生物技术原理构建复合型微生物絮凝剂产生菌群； 3 将絮凝效果最佳的微生物絮凝剂产生菌群进行培养条件优化； 4 复合型微生物絮凝剂的成分及絮凝活性分析； 5 复合型微生物絮凝剂絮凝特性研究； 广东i ：业大学j ：学硕十学位论文 6 将复合型微生物絮凝剂应用于废水处理进行实际应用研究。 本课题研究的技术路线如下： 采样预处理- - - - - o 选择性富集培养( 可重复多次) 一菌株分离、纯化( 稀 释平板和平板划线_ 筛选絮凝剂产生菌单一菌种_ 复合型微生物絮凝剂 产生菌群的构建一培养条件优化一制备复合型微生物絮凝剂应用 于污泥通过测其沉降i 生能参数( 沉降比、沉降速率) 沉降试验研究、应用于废水 处理测定上清液的色度和s s 进行实际应用研究。 6 第二章试验材料、仪器和方法 第二章试验材料、仪器和方法 2 1 试验材料及仪器设备 2 1 1 试验材料 菌种来源：广州沥活污水处理厂活性污泥和校园工学3 号馆花坛肥沃土壤 生活污水：广州沥滔污水处理厂 污泥：广州沥滔污水处理厂生化池和二沉池 2 1 2 试验仪器设备 表2 1 主要试验仪器设备 ( t a b 2 1t h em a i ni n s t r u m e n t s ) 仪器设备生产单位 7 2 1 型分光光度计 s h a c 数显恒温水浴振荡器 p h s 2 5 酸度计 生化培养箱 芬兰可调式移液器 手提式压力蒸汽消毒器 j j l 0 0 数显电子天平 7 4 b 4 0 0 0 电动离心沉淀器 h c p 2 型干燥装置 超净操作台 定时恒温磁力搅拌器 b c d 一1 7 8 w 冰箱 h j 6 a 多头恒温磁力加热搅拌器 k q 2 2 0 0 d a 型超声波清洗器 上海精密科学仪器有限公司 金坛市富华仪器有限公司 上海雷驰仪器仪表有限公司 上海新苗医疗器械有限公司 上海大龙医疗设备有限公司 上海生银医疗仪器仪表厂 常熟市双杰测试仪器厂 江苏盐城龙冈医疗机械厂 日本日立 梅州纪元应用研究所 金坛市富华仪器有限公司 广州华凌冰箱厂 金坛市富华仪器有限公司 昆山市超声波仪器厂 广东l ：业大学1 ：学硕十学位论文 2 1 3 培养基 牛肉膏蛋白胨固体培养基( 培养细菌) ：牛肉膏5 9 ，蛋自胨1 0 9 ，n a c i5 9 ， 琼脂1 5 2 0 9 ，h 2 01 l ，p h = 7 2 7 4 ，0 1 0 5 m p a ，1 2 1 ，高压蒸气灭菌2 0 m i n 。 查氏固体培养基( 培养霉菌) ：蔗糖3 0 9 ，n a n 0 32 9 ，k 2 h p 0 4l g ，k c l0 5 9 ， m g s 0 4o 5 9 ，f e s 0 40 0 1 9 ，琼脂1 5 2 0 9 ，h 2 01 l ，p h = 7 0 7 2 或( 自然) ，o 0 7 2 m p a ，1 1 5 ，高压蒸气灭菌2 0 m i n 。 淀粉琼脂培养基( 高氏l 号固体培养基培养放线菌) ：可溶性淀粉2 0 9 ，k n 0 3 l g ，k 2 h p 0 4o 5 9 ，m g s 0 4o 5 9 ，f e s 0 40 0 ig ，n a c l0 5 9 ，琼脂15 2 0 9 ，h 2 0 1 l ， p h = 7 2 - 7 4 ，0 1 0 5 m p a ，1 2 1 ，高压蒸气灭菌2 0 m i n 。 马铃薯培养基( 培养真菌) ：马铃薯( 去皮) 2 0 0 9 ，蔗糖2 0 9 ，琼脂1 5 2 0 9 ， h 2 01 l ，p h 自然，0 1 0 5 m p a ，1 2 1 ，高压蒸气灭菌2 0 r a i n 。( 将马铃薯去皮， 切成小块，于锅中加水1 l 煮沸半个小时，用双层纱布过滤，取滤液加糖，并加 水补足1 l 。) 以上4 种固体培养基不加琼脂为相应液体培养基。 通用发酵培养基：葡萄糖2 0 9 ，尿素0 5 9 ，酵母膏o 5 9 ，k 2 h p 0 45 9 ，k t t 2 p 0 4 2 9 ，n a c l0 1 9 ，( n h 4 ) e s 0 40 2 9 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 2 9 ，h e 0 1 l ，p h = 7 5 ，0 0 7 2m p a ， 1 1 5 ，高压蒸气灭菌3 0 m i n 。 2 2 试验方法及试验步骤 2 2 1 微生物絮凝剂产生菌的分离筛选 2 2 1 1 取样及预处理 对于土壤样品，取表层以下5 一1 0 c m 处的土样，装入灭过菌的带塞容器中备 用或放在冰箱中4 。c 下保存。土壤样品预处理主要是除去样品中细小的固体物 质，不处理会影响到后续步骤中的絮凝活性的测定。先将2 0 0 9 固体样品放入装 有1 0 0 0 m l 去离子水的烧杯中，再将烧杯放在磁力搅拌器上快速搅拌1 0 m i n ，使 附在固体颗粒上的微生物相进入水相，停止搅拌后静置3 0 m i n ，再1 0 0 0r p m 下 进行离心分离，收集上清夜，然后用滤纸过滤，收集滤液。 对于活性污泥样品，将样品放在磁力搅拌器上快速搅拌1 0 m i n ，然后静置一 8 第二章试验材料、仪器和办法 段时间，再用滤纸过滤取滤液。 2 2 1 2 富集培养 将滤液以体积比l ：5 0 的量接种到相应四种特定液体培养基中，摇床中( 3 0 c ， 1 6 0 r p m ) 培养7 2 小时。以同样的接种量，同等条件下再重复富集培养2 次得最 终富集液。 2 2 1 3 菌株分离纯化 采用稀释平板法对最终富集液中的微生物进行分离。在无菌操作条件下，将 最终富集液稀释成1 0 4 ，1 0 一，1 0 击，1 0 ，1 0 罐等5 个稀释度。先吸取o 5 m l 菌 液于相应编号的培养皿内，当培养基冷却至4 5 左右，将琼脂培养基倒入培养 皿中，将培养皿平放在操作台上，顺时针或逆时针地来回转动，使培养基和菌液 充分混匀，冷凝后即成平板，将平板倒置于生化培养箱中，在3 0 下培养。 采用平板划线法对菌株进行纯化。根据菌落特征的不同，从上述平板中挑取 单菌落，在相对应类型的无菌平板培养基上划线。将平板倒置于生化培养箱中， 在3 0 下培养。经多次平板划线获得纯菌株，然后将纯化后的菌种编号。 将纯化的菌株转至相对应类型的斜面培养基中，在生化培养箱中3 0 下培 养2 4h ，然后将其放入冰箱中4 。c 下保存，以备使用。以后每月将菌株转种至相 对应类型的新鲜斜面培养基中1 次。( 细菌培养1 2 天，放线菌培养5 7 天，真 菌、霉菌培养3 5 天。观察菌落的特征，以便于进一步纯化分离) 。 2 214 纯菌株发酵培养 将斜面培养基上的菌株接种至1 5 0 m l 锥形瓶装的5 0 m l 通用发酵培养基中， 在摇床培养箱q 了( 3 0 。c ，1 6 0 r p m ) 培养7 2h 后，将发酵液在离心机q b 4 0 0 0 r p m 下离 一t l , 2 0 m i n ，絮凝活性较高的离心上清液即为液态m b f 。 2 215 微生物絮凝剂产生菌筛选 在2 5 0 m l 烧杯中加入4 9 l 高岭土悬浊液1 0 0 m l ，调节p h 值至8 - 9 ，加入1 的c a c l 2 水溶液2m l 、发酵液2 m l ，在六联式搅拌机上以2 0 0r p m 快搅2 m i n ， 以5 0 r p m 慢搅3 m i n ，然后将混合液倒入1 0 0 m l 比色管中，静止2 0 m i n ，用芬兰 可调式移液器在上清液下2 c m 处取样。用7 2 1 分光光度计在5 5 0 n m 的波长下测 定其吸光度。通过查阅大量相关文献资料发现目前大多数研究采用最大波长为 9 广东l ：q l , 大学1 ：学硕十学位论文 5 5 0 n m ，故本试验也采用最大波长在5 5 0 n m 。同时，以2 m l 蒸馏水为和2 m l 不 加菌的发酵培养基代替发酵液作对照实验。 目前，大多数国内外学者都采用絮凝率e ( ) 来表征絮凝活性，计算公式： 刚) = 半1 0 0 a 对照上清液吸光度 b 样品上清液吸光度 2 2 2 复合型微生物絮凝剂产生菌群构建 将筛选到的微生物絮凝剂产生菌接种至通用发酵培养基，在摇床培养箱中 ( 3 0 。c ，1 6 0r p m ) 培养7 2h ，发酵液作为种子液，放入冰箱内4 。c 保存，以备构建 复合菌群用。将微生物絮凝剂产生菌配组进行复合培养，把复合培养菌株的种子 液各0 5 m l ( 按1 ：1 的比例) 接种至装有5 0 m l 发酵培养基的1 5 0 m l 锥形瓶，在摇 床培养箱d p ( 3 0 。c ，1 6 0r l ：) m ) 培养7 2h 后，测定发酵液离心上清液的絮凝活性，找 出能比单一菌群产生更高絮凝活。 生m b f 的复合菌群。 2 2 3 絮凝效果最佳的复合型微生物絮凝剂产生菌群培养条件优化 复合型微生物絮凝剂最佳培养条件研究采用单因素实验，研究了培养时间、 通用发酵培养基初始p h 、培养温度和摇床转速等条件对复合型微生物絮凝剂的 絮凝率的影响，最终确定最佳培养条件。 2 2 4 复合型微生物絮凝剂的制备 将筛选出的复合型微生物絮凝剂产生菌菌株接种至发酵培养基，在摇床中 ( 3 0 ，1 6 0r p m ) 培养7 2 小时后，将发酵液在4 0 0 0r p m 下离心3 0 m i n ，有絮凝 活性的上清液即为液态复合型微生物絮凝剂。固念复合型微生物絮凝剂的制备采 用有机溶剂提取法。 2 2 5 复合型微生物絮凝剂成分的初步确定 茚三酮显色反应：在试管c g j j z l 絮凝剂提取物的蒸馏水溶液i m l ，i j r l a o 1 的茚三酮酒精溶液l m l ，在火焰上加热片刻，观察颜色变化。氨基酸及含有游离 l o 第二章试验材料、仪器和办法 氨基的肽或蛋白质能与茚三酮发生显色反应，是定性鉴定蛋白质和氨基酸的重要 反应，除脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮显黄色外，其它仅氨基酸与茚三酮根据浓度 显红色到蓝紫色。 双缩脲反应：双缩脲在碱性环境中能与c u 2 + 结合生成紫红色化合物，此反应 称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。 为确定蛋白质成分，进行双缩脲试验。将l m l 絮凝剂和1 0 n a o h 溶液2 m l 混合 后，摇匀，再加入i c u s 0 4 溶液两滴，发现紫红色化合物生成，表明絮凝剂成分 中含有蛋白质。 m o l i s h 显色反应：在试管中加入絮凝剂提取物的蒸馏水溶液l m l ，然后加入5 滴萘酚溶液，混匀，沿管壁慢慢加入浓硫酸约l m l ，小心地竖起试管，使硫酸与 待测液分为两层，观察两液面问的颜色。在试管中的硫酸与待测液的中间层面上， 出现紫色环，表明絮凝剂成分中含有糖类化合物。 蒽酮试验：葸酮与各种类型的糖反应产生绿色物质，这个反应是糖类所特有 的。在小试管中加入含有1 5 m g 样品的水溶液0 5 m l ，倾斜此试管，沿壁在9 5 浓硫酸中的溶液滴加0 2 葸酮l m l ，l m i n 后出现绿色环，表明絮凝剂成分中含有 多糖成分。 2 2 6 培养液中絮凝活性物质分布测定 取1 0 m l 的发酵液两管于4 0 0 0r p m 离心机上离心3 0 m i n ，其中一个备用；另 一个在1 2 1 下灭菌3 0 m i n 后备用。把离心管底部的菌体细胞分别进行处理，其 中一管用无菌水洗涤两次后，定容至1 0 m l ；另一管定容至1 0 m l 后用超声波清 洗机将菌体破碎后于4 0 0 0r p m 离心机上离心3 0 m i n ，取破碎细胞离心后的上清 液定容至1 0 m l 备用。然后按照絮凝活性的测定方法分别测定发酵原液( 含菌体 细胞) ，去菌体上清液，菌体细胞悬浊液，破碎细胞后上清液及灭菌后的去菌体 上清液的絮凝活性。 2 2 7 复合型微生物絮凝剂絮凝特性研究 2 2 7 1 复合型微生物絮凝剂的热稳定性研究 将培养得到的复合型微生物絮凝剂加热到不同温度( 2 0 ，4 0 ，6 0 ，8 0 ，1 0 0 ) 广东一i ：业大学i ：学硕士学位论文 下，之后取样测定其絮凝率。 2 2 7 2 复合型微生物絮凝剂p h 值稳定性研究 将4 9 l 的高岭土悬浊液，调节至不同的p h 值( 3 ，5 ，7 ，9 ，1 1 ，1 3 ) ， 加入1 c a c l 2 水溶液2m l 、发酵液2 m l ，六联式搅拌机上以2 0 0r p m 快搅2 m i n ， 以5 0 r p m 慢搅3 m i n ，然后将混合液倒入1 0 0 m l 比色管中，静止2 0 m i n ，取样， 测定絮凝率。 2 2 7 3 复合型微生物絮凝剂不同投加量对絮凝效果的影响 在2 5 0 m l 烧杯中加入4 9 l 的高岭土悬浊液1 0 0 m l ，调节p h 值至7 ，分别加 入i c a c l 2 水溶液2m l 和不同量( o 5 ，1