（环境工程专业论文）多环芳烃及含油废水胁迫下鱼的生物标志物效应研究.pdf

摘要 多环芳烃( p a h s ) 主要来源于石油化工、煤焦油化工以及木材等燃烧，属 于持久性有机污染物，这些物质进入水体直接威胁着生态系统的安全乃至人类的 健康。本文以鲫鱼( 国m 船沁彳“朋觚) 为受试生物，研究p a h s 暴露下鱼肝、 鳃乙氧基异酚嗯唑酮( e r o d ) 和谷胱甘肽硫转移酶( g s t ) 活性效应。 研究发现，荧葸、芴、苯并( b ) 荧葸、苯并( g l l i ) 茈、茚并( 1 ，2 ，3 一c d ) 芘等对 鲫鱼肝脏、鳃e r o d 、g s t 活性都有明显的诱导效应。诱导效应顺序依次为荧葸 ( 芴( 苯并( b ) 荧葸( 苯并( 9 1 1 i ) 花( 茚并( 1 ，2 ，3 - c d ) 芘。不同的鱼体组织也体现 了不同的酶活力，p a h s 作用下鲫鱼鳃g s t 活性小于肝g s t 活性，e r o d 活性 并没有明显的差异。对于注射暴污方式而言，肝脏组织用于生物标志物研究可能 更具灵敏性。 所有受试化合物在一定浓度范围内e r o d 、g s t 活性与注射剂量之间体现了 良好的剂量效应关系，表明鱼体肝脏、鳃的e r o d 和g s t 活性可以作为评价 p a h s 污染程度的有效生物标志物。 构效关系研究发现脚m s 的生物效应与污染物的辛水分配系数的对数( 1 0 9 p ) 存在良好的相关性。这是由于p a h s 属于疏水性混合物，l o 妒值越大，疏水性越 强，化合物越易于进入生物体的靶位，从而影响生物氧化酶的活性。 通过对扬子石化、金陵石化污水处理厂尾水对鲫鱼的生物标志物研究发现这 两个炼油厂的排水对鱼肝、鳃的e r o d 、g s t 酶活性都有明显的诱导效应，显示 出明显的亚致死毒性，表明尾水对水生态系统健康存在风险。e r o d 、g s t 活性 可以作为评价p a h s 污染水体灵敏、有效的生物标志物。 关键词：e r o d ；g s t ；生物标志物；鲫鱼；p a h s a b s t a c t p 0 1 y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ( p a h s ) ，w l l i c hm a i n l yc o m e 仔o mm ep r 0 c e s s o fp e t r o c h e i l l i c a l ，m ec o a lt a rc h 锄i c a la n dm ei n c 0 m p l e t ec o m b u s t i o no fw o o d ，a r e b e l o n gt op e r s i s t e n to r g a m cp o l l u t a n t s ( p o p s ) i a h sc o n t 锄i n a t i o ni nw a t e r sp o s 锱a p 枷c u l 砌yl l i g hr i s kb e c a l l s eo fi t si n l p a c to nt l l e 目? e a td i v e r s i t yo fa q u a t i cl i f e f r e s h w a t e rf i s hq 朋船f 淞口“阳f 螂w e r ec h o s e i l 嬲e x p 甜m e n t a la 1 1 i m a l s ，n l e h e p a t i ca n d 百l lb i o c _ h e m i c a lr e s p o n s e st om e d i u 】f i l - t e n ne x p o s u r eo ff i v ep a h sw e r e m e 硒u r e d 嬲e m o x y r e s o m f i n o - d e e m y l 嬲e( e r o d ) a c t i v i 锣a i l dg l u t a “o n e s 一乜a i l s f 打a s e ( g s t ) a c t i v i t yt o 鹪s e s ss u b l e m a le 虢c t s t h er e 蛐l t ss h o w e dt h a tm e a c t i v i t i e so fe r o da i l dg s tw e r ei n d u c e do b v i o u s l yb ym ef i v ec h 伽= l i c a l s t h e i n d u c t i o no r d e ri si n d e i l o ( 1 ，2 ，3 - c d ) p ) r r e n e ，b e n z o 【g l l i 】p e r y l e i l e ，b e n z o 【b 】f l u o r a n m 吼e ， f l u o r e n ea i l df l u o r 锄t 1 1 e n e t h ea c t i v i t yo fg s t i n 百l lw 嬲s m a l l e rt h a nt h a ti nl i v e r a i l dt h e r ew 嬲n oo b v i o u sd i 琢e n tb e t w e e l lf o re r o d f o rt h ec o n t a c tw a yo f e c t i o ne x p o s u r e ，矗s hl i v e rc a i lb es e l e c t e da ss u i t a b l et i s s u ef o r b i o m a r k e rr e s e a r c h e r o da n dg s t a c t i t yi n 国朋船f 淞彳“朋n 锯c 觚b es e l e c ta su s e 筋b i o m 砌【e r s o fe x p o s u r et ob o t hp a ha r l dp a h - l i k ec o m p o u n d sd u et og o o dd o s e r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p sw i m i nac e r t a i nd o s er 习m g e t h e r ea r es i g n i f i c a n tp o s i t i v ec o r r e l a t i o n s b e t w e e ne i l z y i n a t i ci n m l c t i o n 觚dl o g pm r o u g hs 仉l c t u r e a c t i t yr e l a t i o n s l l i p 栅y l o g p i sah y d r o p h o b i c i t yp a r 锄e t l el l i 曲e rn l e l o g 只m es t r o n g e r n l e h y d r o p h o b i c i t ya i l dm ee 嬲i e rm ec o m p o u n d sw e r eb i o c o n c e n 昀t e di nt a r g e ts i t eo f 趾 o r g a i l l s m f i i l a l l y ，i tw 觞f 0 眦dm a tm ea c t i v i t i 懿o fb o me r o d 锄dg s ti nl i v 盯a i l d 舀uw e i i l d u c t e d 、) l ，h e nf i s hw e r ee x p o s e dt ot l l ew a s t e w a t e rt r e a n i l e n tp l 锄t se m u 饥t s 丘o my h 群弱 p e n o c h 锄i c a lc o i n p a i l y 锄dj i n l i i l gp e t r o c h 锄i c a lc o m p 锄y 锄da p 供：撕do b 、，i o 璐s u b - c i 0 n i c t o x i c i t ) ，e 行t i tw a s8 h o w nt h a tm ew 舔t e w a t e r 仃i ：锄e i l tp 1 觚t se m u 饥t s 丘0 mp e 缸0 c h e m i c a l c o r n p 觚i 豁h a dr i s k t 0e c o l o 西c a ls y s t 锄h e a l 1 e r o d 锄dg s ta c t i 访t i 岱c 锄b es e l e c t 硒 s 饥s i t i v e 锄de f f i e c t i v eb i o m a r k e r sf o r 弱s e s s i n gp a h sp o l l u t i o nw a t e 璐 k e y w o r d s ：e r o d ，g s t b i o m a d 【e r s ，c a m s ，纰，么“，口舭，p a h s i l 学位论文独创性声明： 本人所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同事对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。如不实，本人负全部责任 论文作者( 签名) ： 丝 学位论文使用授权说明 河海大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊( 光盘 版) 电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件或电子文档，可以采用 影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容 相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅。论文全部或部 分内容的公布( 包括刊登) 授权河海大学研究生院办理。 论文作者( 签名) ： 扭如眺年量6 月户日 河海大学硕士学位论文多环芳烃及含油废水胁迫下鱼的生物标志物效应研究 第一章绪论 工农业生产发展产生了大量的工业废水和生活污水，这些污水最终都是排放 到江河湖泊内，尽管很多污水都经过了处理，但是大量的污染物特别是多环芳烃 ( p a h s ) 、多氯联苯( p c b s ) 、二嗯英( d i o x i n s ) 以及杀虫剂等难降解有机污染 物仍然存在。即使水体内这些污染物的含量不高，由于它们具有较强的致癌、致 畸形、致突变的效应【l 】，这些污染物的联合作用可能具有意想不到的毒性，威胁 着水生生物乃至人类的健康。p a h s 类污染物就是这些难降解污染物中的一类典 型。 1 1 环境中p a h s 污染 p a h s 是指分子有2 个或2 个以上的苯环连接在一起的化合物。根据苯环的 连接方式不同，这类化合物又可分为三类【2 】：苯环和苯环之问各通过一个碳原子 相连，如联苯、联三苯等；多苯代脂芳烃；稠环芳烃，即苯环和苯环之间共用两 个碳原子相连，如芘、萘、葱等。目前所说的p a h s 通常是指稠环芳烃类化合物。 p a h s 在水体中有三种状态：吸附于悬浮物和沉积物中，溶解于水，呈乳化状态。 由于p a h s 疏水性强，在水中的溶解度小一因此在水中的浓度相对较低，但它易 于在生物体内积累和富集，并且不易被降解。 1 1 1p a h s 的来源及其三致作用 p a h s 主要来源于石油化工、煤焦油化工以及木材等燃烧。在缺氧、高温条 件下有机质不完全燃烧及在还原性气体中的分解产生大量的p a h s ，一般认为在 8 0 0 1 2 0 0 供氧不足的燃烧中产生最多，同时在汽油柴油的内燃机中燃烧以及食 品熏烤、烟草燃烧中都会产生一定量的p a h s 。 目前对2 0 0 0 多种物质的致癌试验发现【3 1 ，有5 0 0 余种致癌物质，其中2 0 0 多 种是芳烃族化合物。p a h s 类污染物具有分布广、数量多、致癌性强、与人类关 系密切等特征。p a h s 已经被认为是比较重要的一类致癌物质，引起了科学界的 广泛关注和研究。美国环保局公布的1 2 9 种优先控制污染物中有1 6 种属于队h s 河海大学硕士学位论文 多环芳烃及含油废水胁迫下鱼的生物标志物效应研究 化合物。一般来说水体中的p a h s 易于在生物体内富集，同时具有强致癌性，除 此之外p a h s 还具有对机体的免疫抑制反应【4 1 、致畸作用和致突变作用。 1 1 2p a h s 致癌过程及其机理 p a h s 一般是间接致癌物质，可以经过吸收和代谢活化最终呈现致癌作用。 p a h s 在体内首先经过混合功能氧化酶催化形成p a h s 环氧化物，然后再经过环 氧水化酶催化形成p a h s 二氢二醇衍生物，后者可以形成具有亲电子性的正碳离 子，可与d n a 分子鸟嘌呤的n 2 结合，使d n a 烷基化，以致d n a 的碱基三联 体变化，使遗传密码改变，引起突变，导致癌变。在以上的代谢过程中还有一部 分p a h s 经过生物转化排出体外。排泄的方式主要是大部分中间代谢物与谷光甘 肽、葡萄糖醛酸或硫酸发生结合反应，结合物排出体外。 以苯并( a ) 芘的代谢过程为例【2 】： 广一 混合功能氧化酶广1 环氧水化酶 l 苯并( a ) 芘i i 苯并( a ) 芘环氧化酶i i _ ji _ j ( 近致癌物) 厂三互磊磊碉塑丛避厂三夏雨磊再习 i - j i 一 ( 终致癌物) 目前，对p a h s 的致癌作用机理的研究主要集中在k 区理论和弯区理论。研 究表明k 区电子密度大，有明显的双键性质，可催化核酸或蛋白质的酮烯醇互 变异构，因此导致大量分子的不可逆转改变，从而具有致癌性。还有一类化合物 以饱和的苯环作为一侧，并以与饱和苯环相对的另一苯环为另一侧就构成了形如 海湾的区域称作弯区。具有弯区的环氧化物具有比较稳定的l o 位联苯酰位，当 环断裂时，1 0 位上较易形成正炭离子。这个正炭离子与d n a 发生反应，与鸟嘌 呤环c 一2 上的n 共价键结合，引起d n a 突变。所以说弯区对于p a h s 致癌具有 重要作用。 由于p a h s 类污染物是典型的“三致”物质，并且分布广泛，且与人类以及生 物关系密切，因此对p a h s 类污染物的生态毒理学研究具有重要的意义。 2 河海大学硕士学位论文多环芳烃及含油废水胁迫下鱼的生物标志物效应研究 1 2 污染物的生态毒理学研究方法 早期的生态毒理学研究主要关注对象是污染物，包括污染物在环境中的物 理、化学变化，如污染物的组成、浓度、分布、迁移、转化、降解和归宿等。由 于生物体具有吸收、累积、转运、代谢转化和排泄污染物的能力，研究人员对污 染物在生物体内的富集、变化也进行了大量的研究，包括：急性毒性实验、慢性 毒性实验等。这些在个体或系统水平上的研究可以较好地反映污染物对生物体或 生态系统整体水平上的影响，比较接近自然状况，对污染物的评价和筛选起到了 重要作用。 然而在现实的水环境监测中，仅靠化学和物理监测是不能全面地评定污染物 对生态系统的影响的，在这一点上国内外专家们己经取得共识。这是由于在水环 境中，多数化学物质的相互作用以及错综复杂的基质的毒性效应都是不能直接测 知的，不同的生物物种对于相同的有毒物也具有不同的反应，即便是一种生物在 全部的生活史的不同生命阶段，其反应也并不始终一致【5 1 。常规的物理和化学检 测只能测定污染的浓度，但不能测定污染物对生物机体的影响，例如污染物毒性 的强弱。污染物的生物效应监测不仅能弥补物理和化学监测的不足，还可以提供 物理和化学监测无法得到的数据。 同时传统的毒性研究方法耗时长、影响因子多、花费大；并且生物死亡、生 长受阻或繁殖受影响以至最终导致生态系统破坏己是污染物对生物体造成的晚 期结果，很难就污染物对生物的影响进行早期预警作用。 毒理学研究者认为：污染物对生态系统的影响，无论最终的后果多复杂、多 严重，其最早期的作用必然是对生物个体内分子水平上开始的，然后逐步在细胞、 组织、器官、个体、种群、群落、生态系统各个水平上反映出来【6 】。 随着分子生物学技术的发展，越来越多的研究集中在对污染物及其代谢产物 与细胞内大分子，包括蛋白质、核酸、酶的相互作用方面。采用现代分子生物学 方法和技术研究来揭示污染物剂量与生物体效应之间的关系，能够解释污染物剂 量多高，暴露时间多长会对生物体产生危害，会产生什么样的危害，当环境中的 污染物减少以至消失后，曾经暴露于污染物的生物体能否恢复等问题，能够作为 水体污染状况的早期预警。因此对生态毒理学学的分子水平研究成为一个重要的 研究方法。 3 河海大学硕士学位论文 多环芳烃及含油废水胁迫下鱼的生物标志物效应研究 生物标志物的研究方法就是在这种情况下应运而生的。污染物在分子水平上 的作用能通过生物标志物指标加以检测，能够及时、准确地监测污染的发生和发 展过程以及变化趋势状况，评估可能产生的生化和分子生态毒理学的效应。污染 物诱导生物体组织酶活性的变化就是在分子水平上与机体靶器官相互作用而引 起的，其活性的大小与污染物的剂量及其毒害作用密切相关【7 1 。 生物标志物系统是生物体暴露于亚致死剂量下的有毒化合物而发生异常变 化的信号指标，这种指标不仅可为环境质量退化提供早期警报，而且可以特异性 地检测到环境中致癌、致畸、致突变化合物的生物可利用性。生物标志物检测能 提供有毒化学污染物环境生物效应的信息，对生态毒理学研究和环境危险评价 具有重要意义。 水生毒理学研究主要集中于鱼类，这是由于鱼类在水生生态系统中属于次级 消费者，在食物链的营养级中居于第二和第三营养级，本身又是许多水鸟及其它 食鱼动物的食物来源，在生态系统的物质循环和能量循环中起着重要作用。多种 鱼类具有很大的经济、食用价值，而且具有分布广泛、易得、易养和遗传稳定的 特征，是理想的实验材料。早期就有研究表明鱼类可以通过吸收、吸附和摄食等 途径，从周围环境中积累、浓缩化学物。这些环境污染物通过鱼鳃从水中吸收积 累，也可通过食物链的生物放大作用在鱼体中蓄积。难以降解的污染物通过食物 链的进一步转移，可以使处于高位营养级的生物受到毒害，威胁到人类健康。正 是基于鱼类对水环境发生的物理、化学和生物性的各种变化反应十分灵敏的特 点，以及鱼类在水生生境中的重要地位，以鱼类作为研究对象，对水环境进行生 物检测已普遍应用，这一实践性应用不仅有利于渔业资源的保护，同时在生态风 险评价中具有重要价值【引。 1 3 生物标志物 1 3 1 生物标志物定义 早在1 9 8 7 年，美国全国科学理事会( n r c ) 将生物标志物( b i o m a r k e r ) 描述为反 映生物系统或样本中发生的事件的指标，并将其视为研究接触外源化学物与健康 损害之间关系的工具。1 9 9 3 年i n t e n l a t i o n a lp r 0 乒a i i l l n eo nc h e i i l i c a ls a f e t y 出版的 4 河海大学硕士学位论文多环芳烃及含油废水胁迫下鱼的生物标志物效应研究 环境卫生基准中提出生物标志物的广义定义为：反映生物系统与外源化学、物理 和生物因素之间相互作用的任何测定指标。1 9 9 5 年d 印l e d g em h 等【9 】对生物标志 物的定义为：通过测定体液、组织或整个生物体，能够表征对一种或多种化学污 染物的暴露和其效应的生化、细胞、生理、行为以及能量上的变化。即：生物标 志物是衡量环境污染物的暴露及效应的生物反应。这种定义一直延续到现在，一 般认为是比较准确、科学的。 生物标志物具有三个特点【l o 】：特异性，分子水平的生物标志物能够直接以生 物体内靶细胞或靶分子为反应终点，特异性强，反应灵敏，如有机磷类农药对乙 酞胆碱醋酶活性有特异性抑制作用；预警性，污染物与生物体之间所有的相互作 用都始于分子水平，生物标志物的产生是对污染物暴露的早期反应，因此这类标 志物成了污染物暴露和毒性效应早期警报的指示物；广泛性，从微观分子到宏观 生态系统，生物标志物在各个不同层次的生物组织上体现着污染物和生物效应之 间的因果关系，一般来说生物体之间的共性在分子水平上最大，所以许多分子生 物标志物，如d n a 加合物，可广泛应用于各类生物。与其它方法相比，生物标 志物的最大区别在于可以确定污染物与生物体之间已发生的相互作用，测定的是 污染物的亚致死效应，生物标志物的主要优势为：可反映污染物暴露的时空变化 和历史情况；可联系微观和宏观效应；直接联系污染物浓度与效应：可确定各种 暴露途径之间的差异。综合了多种污染物的相互作用；判定污染物引起的效应对 生物个体或生态一的意义；可对长期生态效应进行短期预测。生物标志物的种类 很多，目前为止，已研究的可用于监测环境污染的生物标志物有不少，包括抗氧 化系统、混合功能氧化酶( m f o ) 系统、d n a 加合物、d n a 断链等【i i 】 1 3 2 生物标志物的分类 从功能上看，生物标志物一般可以分为接触性标志物、效应性标志物和易感 性标志物三大类【1 0 1 。接触标志物反映机体生物材料中外源性化学物或其代谢物或 外源性化学物与某些靶细胞或靶分子相互作用产物的含量。接触生物标志物可以 分为反映内剂量和生物效应剂量二类标志物。这些接触性生物标志物指示生物如 与外剂量相关或毒作用相关，可以评价接触水平或建立生物阈限值。效应标志物 指机体中可测出的生化、生理、行为或其它改变的指标，可进一步分为生物早期 5 河海大学硕士学位论文多环芳烃及含油废水胁迫下鱼的生物标志物效应研究 效应、结构或功能改变、疾病等种类。指示污染物对生物体的生物健康状况的损 害效应，如指示d n a 损伤的d n a 加合物( d n a a d d u c t s ) ，它可能是生物机体 中某一内源性成分或测定机体功能容量，产生疾病或障碍的改变等。易感性生物 标志物是指由于基因的多样性，机体对有毒污染物产生的效应的差异，即反映机 体先天具有或后天获得的对接触外源性物质产生反应能力的指标。其既可与遗传 有关，又可由环境因素诱发。机体从接触外源物质到产生疾病是一个连续的过程 如图1 1 【1 2 】。 接触 剂量 内剂 量 接触性生物标志 生物学有 效剂量 1 3 3 生物标志物的选择 易感性生物标志 早期生物 学效应 图1 1 生物标志物分类图 结构功 能改变 效应性生物标志 毒性或 疾病 所选择的生物标志物必须具有一定的特异性，必须具有足够的灵敏度，即所 选标志物的水平与外接触水平要有剂量效应关系，在无害效应接触水平下仍能维 持这种关系还要有足够的稳定性，便于样品的运送、保存、分析。 大量的生物标志物研究都是对微粒体酶进行分析，所谓的微粒体并非独立的 细胞器，它只是内质网在细胞匀浆过程中形成的碎片，这种碎片存在于细胞匀浆 经超速离心去除线粒体后的上清液。 目前研究较多的被诱导酶有：污染物在生物体内进行生物转化过程中的i 相 和i i 相酶，如混合功能氧化酶系( m f o ) 、谷胱甘肽硫转移酶( g s t ) 和尿二磷酸葡萄 糖普转移酶( u d p g t ) 等等；抗氧化防衡系统的酶系，如过氧化物歧化酶( s o d ) 、 过氧化物酶等等，以及动物血清中的酶类【l l 】。 有机毒物在机体内进行两个阶段的生物转化。第一阶段是在细胞色素p 4 5 0 依赖的混合功能氧化酶( m i x e d f i m c t i o n o x i d a s e ，m f o ) 作用下引进一个氧分子，使 底物活化代谢形成各种中间产物，如环氧化物、酚、二醇等。这些中间代谢物具 有很高的生物活性，容易对机体产生毒性。如7 ，8 一二氢二醇一9 ，1 0 一环氧化 6 河海大学硕士学位论文多环芳烃及含油废水胁迫下鱼的生物标志物效应研究 物( d e ) 可与d n a 结合造成d i n a 的各种损伤d n a 的单链断裂、甲基化、交联、 加合物的形成等。混合功能氧化酶【1 3 - 1 4 】是污染物在体内进行生物转化相i 过程中 的关键酶系。第二阶段，内源性分子如g s t 、葡萄糖醛酸、硫酸盐等与被氧化的 非生物物质结合，形成低毒而且易于排出的产物。其中g s t 为i i 相反应中较为重 要的酶，可催化外来化合物的中间代谢产物与谷胱甘肽( 酉u t a l i o n e ，g s h ) 结 合，g s h 的结合物常常使毒性降低且易于排出体外，因此g s t 在细胞解毒和代谢 中起到重要的作用。体内致癌物一般先由i 相代谢酶氧化、还原、水解等作用， 改变毒物功能基团，使其降解；i i 相代谢酶则催化毒物或i 相代谢产物与其极性 基团结合，增加其水溶性，利于排出体外，或被活化为亲电子致突变或致癌剂。 这是代谢非生物物质的一般方式【1 5 。1 6 】。其迁移、转化具体过程如图l 一2 【1 7 】： 图1 2 毒物i 相、i i 相代谢过程 生物体内解毒系统一个重要的特征是参与许多关键性的解毒反应的酶是可 以通过暴露而诱导的，而许多环境污染物都是诱导物，因此，通过检测混合功能 氧化酶和g s t 活性并用作指标来反映污染物暴露对生物的影响就成了分子生态 毒理学研究的一个重要方面。 7 河海大学硕士学位论文多环芳烃及含油废水胁迫下鱼的生物标志物效应研究 1 3 4 混合功能氧化酶 混合功能氧化酶( m f o ) 是氧化酶系中重要的酶系，按照成分及作用特点 可以分为细胞色素p 4 5 0 系或单加氧酶。许多研究表明鱼类m f o 具有以下特点： ( 1 ) 鱼类m f o 在有机污染水体中的诱导反应非常灵敏。不同毒物( 包括污染 物) 对m f o 具有不同的选择作用，而m f o 的不同酶组分对特定毒物的敏感性也 不同。 ( 2 ) m f o 的诱导作用具有很好的剂量一效应关系，可以通过测定生物体内 的m f o 的含量及其活性对毒物的反应规律，从而提供毒物对生物体效应的监测 指标，这是作为监测指标的重要条件。 ( 3 ) 与哺乳动物比较，鱼的肝外组织的m f o 活性有更明显的诱导作用。不同 组织问酶的诱导作用存在一定的差别。由此可判断毒物作用的主要靶器官或毒物 进入体内的方式【1 8 】。但必须注意到，一般情况下，有机物轻度污染时，鱼类肝 c y t p 一4 5 0 明显被诱导，其酶活性明显提高，并随着污染浓度升高，诱导程度也 相应加强，酶活性进一步提高。但是当有机物严重污染时，c v t p 4 5 0 的酶活性 通常被抑制 1 9 】，此时如果仅仅使用酶活监测技术是不够的。因此，在这种情况下， 更需要多种监测技术的同时使用，才能够准确和全面地监测和评价污染状况。 相对于国外而言，国内鱼类c y t p 4 5 0 的研究起步晚、报道较少，将鱼类肝细 胞c v t p 4 5 0 酶活性作为指标以监测海洋污染的研究也处于刚刚起步的阶段。 1 3 5 细胞色素p 4 5 0 p 4 5 0 的化学结构是一种含有一个铁原子的卟啉蛋白，其参与氧化代谢的总反 应的具体过程为：外来物( 底物) 与氧化型p 4 5 0 一起形成一种复合物，此种复合物在 p 4 5 0 还原酶作用下由还原型辅酶i i ( n a d p h ) 供给电子，使其还原成还原型p 4 5 0 和外来物的复合物；再与分子氧化作用，形成含氧复合物，这种复合物再进一步 接受电子而活化脱水，这时复合物成为氧化的外来物和氧化型的p 4 5 0 复合物；最 后，释放出其中的氧化产物而完成整个氧化过程。总反应式如下【2 0 】： p 4 5 0 r h + 0 2 + n a d p h + h 十r o h + h 2 0 + n a d p + 细胞色素p 4 5 0 作为生物标志物已经广泛的应用于毒理学研究中。其中肝细胞 河海大学硕士学位论文多环芳烃及含油废水胁迫下鱼的生物标志物效应研究 色素p 4 5 0 酶系的诱导较为普遍的研究。细胞色素p 4 5 0 的测量方法很多，归类如下 f 2 l 】： 乙氧基异酚嗯唑酮( e r o d ) 反应是通过测定7 乙氧基3 异酚嗯唑酮在 p 4 5 0 中的7 乙氧基3 异酚噫唑酮脱乙氧基酶和还原性辅酶n 俏a d p h ) 的催化下 的反应产物异酚嗯唑的荧光强度，来指示p 4 5 0 酶活性变化。 w e s t e n l 印记用于蛋白分子的体外定性定量检测。 酶联免疫分析( e l i s a ) 通过测定产物和二级抗体的复合物的荧光强度间 接测定与一级抗体结合的p 4 5 0 的量，用于c y t p 4 5 0 的半定量检测【2 2 1 。 e l i s a 直接免疫荧光反应以p 4 5 0 作为抗原，通过用荧光燃料标记抗体来确 定抗原和抗体的结合位点、结合量。 单克隆抗体技术使用高特异性的抗体，对p 4 5 0 进行纯化和定性定量测定及 免疫化学定位【2 3 】。 1 3 6 生物标志物e r o d 鱼体内的m f o 诱导具有显著的生态毒理学意义，是一项有重要意义的生物 指标。有科学家预期，随着今后多种检测手段的进一步完善及检测方法灵敏度的 提高，将显示出广阔的应用前景。有的学者己经就作为指标如何提高方法的灵敏 度展开了研究。e r o d 是m f o 中的一种评价有机污染生物毒性的敏感酶学指标， 属于m f o 中细胞色素p 4 5 0 的第一阶段生物代谢酶，是暴露于污染环境的生物 体的真实反应参数。许多潜在致毒、致突变、致癌化合物一p a h s 、p c b s 、t c d d 等都能够诱导e r o d 的活性。在环境监测领域，鱼体内的m f o 及以c y p 认l 为媒 介的e r o d 无疑是研究的重点。 鱼类m f o 诱导作为指示p a h s ，p c b s 等难降解有机物污染物的生物标志物， 在环境监测领域研究非常广泛。e r o d 是一种特异的细胞色素p 4 5 0 依赖的单加氧 酶，因其与p 4 5 0 l a l 结合在一起而成为指示特定有机污染物的有效手段【2 4 】。在 i c e s 提出的可用于生物监测技术中，将e r o d 或p 4 5 0 l a 的诱导作用列入其中， 由于其可检测受试鱼体内平均有机污染物( 如p a h s ，p c b s ，t c d d ) 对其酶的诱 导作用而成为一种重要的生物标志物。 由于e r o d 活性与细胞色素p 一4 5 0 1 a 1 密切相关，与海洋鱼体内的m o 一样， 9 河海大学硕士学位论文多环芳烃及含油废水胁迫下鱼的生物标志物效应研究 在通常环境下，鱼体e r o d 活性是相对较低的，p c b s 和p a h s 的存在使e r o d 的活 性增加，e r o d 对底物作用时，需要微粒体中的重要组成成份一电子传递链参与， 因此，酶促反应体系需要n a d p h 的存在从而催化底物发生反应。 1 3 7 生物标志物g s t 谷胱甘肽硫转移酶( 西u t h i o n es t r a i l s 断a s e ，g s t ) 广泛存在各种生物组织中，是 一种小分子的水溶性蛋白，主要存在于各组织的胞液中。芳香烃化合物包括 p a h s 都能与这种酶结合反应。芳基或烷基卤代物在转移酶的作用下经谷胱甘肽 结合形成对应的s 烷基或芳基谷胱甘肽。g s t 存在与胞浆中肝和肾活性较高，其 它组织活性较低。这种酶广泛存在于动物和植物。 g s t 作为i i 相解毒代谢酶，主要功能是催化某些内源性或外来有害物质的亲 电子基团与还原型谷胱甘肽的硫基结合，增加其疏水性使其易于排出体外，从而 达到解毒的目的。另外还可促使体内各种具有潜在毒性的化学物质以非酶的方 式排出体外。某些g s t 还具有谷胱甘肽过氧化酶活性，可抑制脂质过氧化作用， 是抗氧化系统的组成之一。g s t 是由两个相同或不同的蛋白亚基组成的二聚体， 不同的亚基可以结合、催化不同的底物。g s t 是一个多基因家族，根据蛋白序列、 等电点和底物特异性可以将g s t 分为a 、队兀、0 和g 5 种 2 5 1 。随着g s t 研究的 深入不断有新的g s t 同工酶被发现，h a y e s 等( 2 0 0 4 ) 在综述了相关研究成果后认 为哺乳类g s t 同工酶至少有8 种，包括a 、k 、队、兀、6 、0 和毛【2 6 】。 以g s t “类为例【2 7 1 ，它是体内对致癌物质代谢解毒酶之一，等位基因g s t 纯合子确实，产生大量的无活性酶导致机体解毒可能下降，目前发现有5 个等位基 因点：g s t m l 、m 2 、m 3 、m 4 、m 5 ，它们分别在不同组织中表达。g s t m l 主要 在肝脏中表达。其它分别在肌肉、脑组织、主动脉和心脏中表达。由于它们是同 一基因家族，基因组之间核苷酸序列存在很大同源性。目前研究最多的是g s t - “ 中的m 1 和g s t 0 中的g s t t l 基因多态性。g s t m l 位于1 号染色体，g s t t l 位于2 2 号染色体，位点纯合子缺失为基因缺陷型，使用p c r 和杂交发都可以鉴别g s t t l 的多态性。 g s t 具有i i 相代谢酶和抗氧化酶双重功能，其在生物体解毒过程的重要作用 引起广泛关注，已发现人类许多疾病如癌症与g s t 密切相关。对其他物种g s t 性 l o 河海大学硕士学位论文多环芳烃及含油废水胁迫下鱼的生物标志物效应研究 质和功能的研究也进行了大量研究。 水生动物g s t 的研究主要集中在鱼类。和哺乳类动物类似，g s t 也是广泛在 鱼类各组织中，如s e i l 和鼬m 【b a k 肌发现野生黑海鲻化如礁s 口以明s ) 肝、肾、睾丸、 前肠和鳃中g s t 活性都很高( 以1 氯2 ，4 二硝基苯( c d n b ) 和利尿酸( e a ) 为底 物) 【2 8 1 。但不同组织之间g s t 活性也有差异，通常是肝脏g s t 活性最高。当外来 化合物与动物的g s t 结合反应时，肝脏内的谷胱甘肽水平下降导致动物对某些化 合物的毒性反应强烈。 1 4e i d 、g s t 研究进展 生物标志物作为污染物暴露的早期生物学效应已经在多方面得到发展和应 用。首先，通过生物标志物的研究可以阐明各种污染物的作用机理，确定各种污 染物与生物体之间已发生的相互作用，并与生态学效应相联系，从而来研究特定 环境问题如种群水平的下降等。其次，生物标志物检测是有毒污染物的监督和管 理、环境质量的监测和评价的有效工具。应用生物标志物进行检测可以在最早期 阶段发现污染物的危害，揭示环境的污染情况。多指标体系生物标志物检测的应 用可以准确地确定污染物种类及污染程度，为环境风险评价以及有毒污染物的监 督和管理提供可靠的资料【2 9 】。 风险评价的很多过程都与生物标志物有关，尤其是化学物质的危害评价。危 害评价是生物毒性评价概念的拓展，它要研究污染物的作用与受体响应之间的关 系。而生物标志物在一般情况下均可以提供化学物质对靶位置的生物有效剂量， 并给出定量的评价结果。在环境健康风险评价中，这些结果往往要比毒性活体实 验中得到的分子剂量结果外推到人体的分子剂量要精确得多，如毒物代谢酶的评 价以及大分子加合物的检测。对于新的化学物质的风险评价，由于缺乏各种资料， 生物标志物检测的应用则显得尤为重要。 就污染物的生物标志物监测技术而言，研究受试生物体内酶活性其最终目的 是要建立生物体内酶活性与环境中特定污染物浓度的定量响应关系。剂量一反应 关系评价是危险度评价的核心部分，其目的是阐明不同剂量水平的待测物质与接 触群体中出现的最敏感的关键的有害效应发生率之间的定量关系，建立合适的剂 量一反应曲线1 0 1 。 河海大学硕士学位论文多环芳烃及含油废水胁迫下鱼的生物标志物效应研究 徐镜波等通过9 种硝基苯对鲤鱼肝脏微粒体的体外直接染毒的方法，建立 e r o d 与浓度的剂量效应方程r 2 值在0 8 8 8 一o 9 9 2 之间，相关性较好。并通过 q s a r 分析发现酶活的大小是与卤素相连的苯环碳的静电荷值( q c ) 顺序一致，对 硝基氯苯对e r o d 的诱导值最大，其次为邻硝基氯苯、间硝基氯苯【3 0 】。 张民等【3 l 】通过对鲫鱼肝脏酶液的e r o d 、g s t 活性测定发现在15 d 的暴露下， 低浓度五氯酚对鲫鱼肝脏代谢关键酶( e r o d 、g s t ) 具有明显的诱导能力，诱 导能力的大小不仅与暴露浓度有关，而且与暴露时间有关。孙竹筠等【3 2 】通过对鲫 鱼( 国m ，f 螂口甜厂口纰，) 腹腔注射后9 6 h 后发现l o 和1 0 0m g k g1 处理组肝脏e r o d 活性被明显诱导，分别为对照组的2 3 和3 1 倍。肝脏e r o d 活性随着时间延长继续 升高，至注射后1 4 d ，1 m g k g1 处理组鲫鱼肝脏e r o d 活性为对照的3 0 倍，而1 0 0 m g k g1 处理组则高达5 8 倍。b a p 对鲫鱼的最低效应浓度为lm g k g1 ( 鱼体重) 。 国内外已经开展了大量的污染物剂量效应研究，以应用于污染物的风险评 估。e g g s 在研究红鲻鱼犯砌口甩如砌z 口以幽) 体内的e r o d 活性后发现，鱼肝内 p c b s c b 2 8 的浓度与e r o d 活性存在着良好的正相关关系( r = 0 9 9 1 ) 【3 3 】；j 锄e s r o l s o n 通过对2 ，3 ，7 ，8 t c d d 暴露肝单加氧酶系统诱导的剂量效应关系的检验发 现e r o d 的诱导与2 ，3 ，7 ，8 t c d d 的剂量成正相关【3 4 】。对p a h s 的研究主要关注的是 致癌性p a h s 尤其是苯并芘的影响。如注射6 3 2 肛g 菲后莫桑比克罗非鱼肝g s t 活性增加【3 5 1 。f l a m m 撕o n 等【3 6 】通过测定白鲑( c e “c 如c 淞c 印砌如岱) 肝中e r o d 活性 发现下游鱼，e r o d 酶活性比上游鱼类高出l o 倍，可作为评价m o s s e l er i v e r ( 法国) 水质的生物标志物。大量的研究指出e r o d 、g s t 的表达水平是决定细胞对化学 物敏感性至关重要的因素。 新技术新方法迅速应用如g c m s ( 气相色谱一质谱仪) 、m n r 、h p l c m s ( 高效液相色谱一质谱仪) 、p c r ( 聚合酶链反应) 技术、单细胞凝胶电泳技 术、荧光原位杂交、免疫组织化学等技术推动了生物标志物研究的发展。 西方海洋工作者就e r o d 活性己经开展了大量的研究工作，特别是对可诱导 e r o d 活性的污染物的性质及自然条件下的e r o d 活性的变化和生物体的现场响 应的研究进行得较为深入。生物技术对e r o d 的研究贡献很多，与e r o d 活性相 关的细胞色素p 4 5 0 1 a l 特效抗体的研慰3 7 】；细胞色素p 4 5 0 1 a 1 中量化信使r n a 表达的核探针研究【3 8 】；通过改进经典的酶测定技术，大大地缩短了测定时间。由 1 2 河海大学硕士学位论文多环芳烃及含油废水胁迫下鱼的生物标志物效应研究 于缺少无脊椎动物代谢异源物质的资料，生物标志物的研究仅局限于对鱼的研 究。对于无脊椎动物来说，可能细胞色素p 4 5 0 的某个特定的形式参与污染物的 代谢过程，但是，如果该形式确实存在，对其他代谢途径而言，很可能只是一种 补充形式。 e r o d 、g s t 的诱导是生物对化学胁迫适应性反应【3 9 1 。国外已经把e r o d 等作为一种能反应环境物理和化学变化的生物标志物，并且应用于原油污染、纸 厂废液、工厂废水和城市污水的环境监测中，而国内的相关报道相对较少。然而， 由于生物标志物受到很多因素的影响，加上实验条件的差异、以及受试生物性别、 个体大小以等差异都会对实验结果产生干扰，从而使实验结果的可比性差。 有机污染对酶活性效应的现场研究，结论也不太一致，有的显示诱导，有的 显示没有变化，有的显示抑制【4 0 _ 4 1 1 。高浓度的毒物可能对酶活性存在抑制作用， 孙嫒嫒等【4 2 。4 3 】报道暴露于o 0 5 m l 菲的金鱼肝脏g s t 活性被显著抑制。b a p 暴露 剂量分别为5 m g k g 和lom g l ( g 对非洲鲶、鲽肝脏g s t 活性都没有显著影响【“_ 4 5 1 。 e g g e l l s 【3 3 】对北海南部欧蝶p 彪“m 刀g c 厶酪p 肠f i 嘟口) 和川蝶( p 肠f 纪砌的心z 晒淞) 野生研究发现，对川蝶和欧蝶的数据进行多元回归分析没有发现鱼的e r o d 活性 与污染物的浓度成显著相关性。缺乏相关性的一个可能解释是受额外( 生物学、 物理学、化学) 因素的影响，掩饰了p c b s 、p a h s 对e r o d 的诱导。e r o d 活 性没有明显的变化，该水体不能用e r o d 作为北海南部p c b 、p a h 监测的生物 标志物。b r 锄m e l l 【4 6 】对肯塔基洲西南b r a i l c h 河和m u d 江的不同种类鱼的e r o d 研究发现由于遗传适应性，导致e r o d 活性的明显缺失。p a h s 、p a h s 的长期存 在使这些鱼对污染物的敏感性降低。这些研究表明由于很多环境或未知因素的影 响，单一的生物标志物可能不能正确的指示污染状况。如果我们仅对鱼体的某一 特定的酶活进行研究，酶活未达到诱导或抑制并不能说明水体