（环境工程专业论文）对硫磷降解菌的分离筛选及提高其降解作用研究.pdf

liji ， 毒 -l ad i s s e r t a t i o ni ne n v i r o n m e n t a le n g i n e e r i n g s t u d y o n i s o l a t i o n ，s c r e e n i n go f p a r a t h i o nd e r r a d i n rb a c t e r i a ls t r a i nt n d p a r a t h i o n - a e g r a d m g a c t e r i a ! s t r a t aa n t l 。 。t h ed e g r a d a t i o ne “c t s l m p r o v l n rt h ee l l e c t s b ys h iy a n f a n g s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rj i a n gb i n h u i n o r t h e a s t e r nu n i v e r s i t y j a n u a r y2 0 0 8 山 ， ， 独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是在导师的指导下完成的。论文中取得 的研究成果除加以标注和致谢的地方外，不包含其他人己经发表或撰写过 的研究成果，也不包括本人为获得其他学位而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢 二l 思0 学位论文作者签名：立换螗 日 期： 如口g f 侈 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者和指导教师完全了解东北大学有关保留、使用学位论 文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人同意东北大学可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索、交流。 ( 如作者和导师不同意网上交流，请在下方签名；否则视为同意。) 学位论文作者签名： 签字日期： 导师签名： 签字日期： - ， - 一 东北大学硕士学位论文 摘要 对硫磷降解菌的分离筛选及提高其降解作用研究 摘要 对硫磷是农业生产中普遍使用的广谱杀虫剂，化学名称为o ，0 - - - 7 , 基一o - ( 对硝基 苯基) 硫代磷酸酯，属于高毒、内渗性有机磷农药，在自然界的残留时间为3 周，使用 不当或长期连续使用对人体和环境会造成较大的危害。因此，研究对硫磷的微生物降解 作用具有较大的实际意义。 本研究从受对硫磷污染土壤中筛选分离到l 株能以对硫磷为唯一c 源的菌株d 5 2 ， 通过形态特征及基本生理生化实验研究，初步确定该菌株属于不动杆菌属微生物 ( a c i n e t o b a c t e r s p 上采用分光光度比浊法研究其最佳生长条件，结果表明：d 5 2 最 佳生长温度为2 8 ( 2 ，最佳初始p h 值5 8 ，最佳c 、n 源分别为柠檬酸钠、酵母粉，在 15 0 m l 的培养瓶中培养基体积为5 0 m l 时生长最好，n a c l 最大可耐受浓度为6 。 d 5 2 在浓度为8 0 0 m g l 对硫磷的培养液中生长良好，但对该农药的降解率仅为 2 5 。为了提高降解作用，对菌株进行诱变复壮实验，结果显示：紫外诱变后降解率为 4 9 1 ，盐酸羟胺化学诱变后降解率为6 9 6 ，土壤浸出液复壮后降解率为5 3 9 。确 定在各种诱变方法中的最佳条件为：紫外灯垂直距离3 0 c m 辐照l o s ；0 8 盐酸羟胺溶 液振荡反应3 0 r a i n ；6 0 土壤浸出液振荡培养4 8 h 。在最佳条件下进行复合诱变，对硫 磷的降解率得到大幅提高，可以达到8 2 8 。 进一步研究该菌株对模拟对硫磷农药污染土壤的降解效果，结果表明：在对硫磷浓 度为l o o m g k g 的土壤中，该菌株对对硫磷农药7 d 的降解率达到了6 6 7 ，显示出其较 好的应用前景。 另外，本研究摸索出一种紫外分光光度法检测有机磷农药降解作用的方法，与文献 报道的紫外检测方法相比，检测结果更为简便、精确，与气相色谱法检测结果拟合较好， 具有一定的实际应用价值。 关键词：对硫磷；生物降解；诱变；复壮；土壤修复 li，一 i a 、 东北大学硕士学位论文a b s t r a c t s t u d yo ni s o l a t i o n ，s c r e e n i n go fp a r a t h i o n d e g r a d i n gb a c t e r i a l s t r a i na n di m p r o v i n gt h ed e g r a d a t i o ne f f e c t s a b s t r a c t p a r a t h i o nw a gu s e dt oc o n t r o lo fp l a n td i s e a s e sa n di n s e c tp e s t si na g r i c u l t u r ew i d e l y b u t i ta l s od e s t r o y e dt h ee n v i r o n m e n ts e r i o u s l ya n dw a so fg r e a tr e s i d u a lt o x i c i t yt oh u m a nh e a t h b i o d e g r a d a t i o n , e s p e c i a lt h ed e g r a d a t i o nb ym i c r o o r g a n i s m ，c o u l de l i m i n a t et h i sk i n d d a m a g e as t r a i nd 5 2o f p a r a t h i o n - d e g r a d i n gw a so b t a i n e db ys e l e c t i v ee n r i c h m e n tc u l t u r ef r o m p e s t i c i d e s c o n t a m i n a t e ds o i l p a r a t h i o nc o u l db eu s e db yd 5 - 2a st h es o l es o u r c eo fc a r b o n t h ec h a r a c t e ra n a l y s i so fm o r p h o l o g i c a la n dp h y s i o c h e m i c a ls h o w e dt h a ts t r a i nd 5 - 2 b e l o n g e dt oa c i n e t o b a c t e rs p t h eo p t i m u mg r o w t hc o n d i t i o nw e r ed e t e r m i n e df o rd 5 2 、析t l l t e m p e r a t u r e2 8 c ，p h5 - 8 ，a n dt h eo p t i m u mc a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c ew a ss o d i u mc i t r a t e a n dy e a s tr e s p e c t i v e l y o x y g e nc o u l dm a k et h es t r a i ng r o wb e t t e r i tw a ss t r o n g l yi n h i b i t e d b yl l i 曲c o n c e n t r a t i o nn a c ii nt h em e d i u m d 5 - 2c o u l dg r o wi np a r a t h i o ns a l tm e d i u m ( 8 0 0 m g l ，p a r a t h i o n ) ，h o w e v e r , t h e d e g r a d a t i o nb yt h es t r a i nw a sl o w ( t h ed e g r a d a t i o nr a t ew a so n l y2 5 ) i no r d e rt oi m p r o v e i t sd e g r a d a t i o n , t h em u t a t i o na n dr e f r e s h i n gw e r eu s e d a f t e rr e a c t i n g 谢mu v ，0 8 n i t r o u s a c i da n d6 0 s o i le x t r a c tl i q u i d ，t h ed e g r a d a t i o nr a t er e a c h e d4 9 1 ，6 9 6 ，a n d5 3 9 r e s p e c t i v e l y f i n a l l y ，t h ed e g r a d a t i o n r a t er e a c h e d8 2 8 a f t e rt r e a t e d 诵t l lm u l t i p l e x m u t a t i o n s t h eb i o d e g r a d a t i o no fp a r a t h i o n - c o n t a m i n a t e ds i m u l a t i o ns a m p l e 、析t l ls t e r i l i z e ds o i l sb y d 5 2w a ss t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed e g r a d a t i o nr a t ew a s6 6 7 嘶t l llo o m g k g p a r a t h i o nc o n c e n t r a t i o na f t e r7d a y s i tw a so fv e r yi m p o r t a n ta n dl a r g ev a l u ef o rd 5 2t o a p p l yp r a c t i c a l l yi np a r a t h i o nc o n c e n t r a t i o ns o i l f u r t h e r m o r e ，am o r ee x a c tm e a s u r e 埘t l lu l t r a v i o l e ts p e c t r o p h o t o m e t e rw a sf o u n dt o e x a m i n et h eb i o d e g r a d a t i o no fp a r a t h i o n c o m p a r e dw i t hg a sc h r o m a t o g r a p h ym e a s u r e s ，i t s h o w e db e t t e rf i t t i n gt oa n a l y s i sr e s u l t s k a yw o r d ：p a r a t h i o n ；b i o d e g r a d a t i o n ；m u t a t i o n ；r e f r e s h i o n ；s o i lr e m e d i a t i o n 东北大学硕士学位论文 目录 目录 声明i 摘要i i a bs t r a c t i i i 第一章绪论l 1 1 有机磷农药生产使用现状和引发的问题1 1 1 1 有机磷农药生产使用现状1 1 1 2 农药使用引发的问题2 1 2 有机磷农药在土壤中的降解5 1 2 1 有机磷农药的化学降解5 1 2 2 有机磷农药的光解6 1 2 3 有机磷农药的微生物降解。7 1 3 有机磷农药微生物降解的研究进展7 1 3 1 有机磷农药降解菌株的筛选7 1 3 2 有机磷农药微生物修复的应用研究9 1 4 对硫磷的理化性质及其危害。9 1 4 1 对硫磷的理化性质9 1 4 2 对硫磷的毒性l0 1 4 3 对硫磷的危害1 0 1 5 论文研究的目的、理论意义及主要研究内容1 1 1 5 1 论文研究的目的、理论意义1 1 1 5 2 论文的主要研究内容1 1 第二章实验材料与方法1 2 2 1 实验仪器、设备和试剂1 2 2 1 1 实验仪器、设备1 2 2 1 2 实验试剂l3 东北大学硕士学位论文 目录 2 2 土样来源一1 4 2 3 试剂的配制1 4 2 3 1 菌株鉴定所用试剂1 4 2 3 2 菌株诱变所用试剂1 5 2 3 3 培养基配制15 2 4 实验方法16 2 4 1 菌株分离纯化16 2 4 2 菌株的初步鉴定1 7 2 4 3 菌株生长条件的测定。1 9 2 4 4 对硫磷残留检测方法2 0 2 4 5 菌株对对硫磷降解作用研究2 1 2 4 6 菌株的诱变复壮21 2 4 7 模拟土壤的微生物修复实验2 2 第三章对硫磷农药降解菌的筛选与最佳生长条件的确定2 4 3 1 对硫磷降解菌的筛选与驯化2 4 3 2 对硫磷降解菌的分类鉴定2 4 3 2 1 形态特征观察2 4 3 2 2 生理生化基本鉴定2 5 3 3 菌株最适生长条件2 7 3 3 1 生长曲线2 7 3 3 2 最佳生长温度一2 8 3 3 3 培养基最佳初始p h 值2 8 3 3 4 最佳c 源测定结果2 9 3 3 5 最佳n 源测定结果一2 9 3 3 6 最佳溶解氧含量测定结果3 0 3 3 7 最佳n a c i 盐浓度测定结果。3 l 3 4 小结3 2 第四章提高d 5 2 降解性能及对污染土壤的微生物修复实验3 3 4 1 紫外分光光度计法对硫磷最大吸收波长的确定和标准曲线3 3 东北大学硕士学位论文 目录 4 2 提高0 5 - 2 降解性能实验结果与讨论3 4 4 2 1 紫外诱变。3 4 4 2 2 盐酸羟胺诱变3 6 4 2 3 土壤浸出液还原复壮。3 7 4 2 4 加热复壮3 8 4 2 5 最佳条件下的复合诱变复壮实验结果3 9 4 3 紫外分光光度计与气相色谱仪检测结果对比4 0 4 4 模拟污染土壤的微生物修复实验研究4 2 4 4 1 添加回收率实验4 2 4 4 2 模拟污染土壤的微生物修复实验4 3 4 5d 、结4 3 第五章结论、建议4 5 5 1 结j 沦4 5 5 2 建议4 5 参考文献4 7 致谢5 0 东北大学硕士学位论文第一章绪论 第一章绪论 自农药问世以来，由于它见效快、防治效果好、防治面广，保证了农作物丰产增收， 减轻了劳动强度，降低了人工费用。因此在全球范围内迅速得到推广使用，范围日益扩大， 其产量和品种不断增加。农药的使用虽保证了农作物的稳产高产，然而低效率或不合理 的使用却使农产品中农药残留严重超标，并且对环境造成严重污染【l 】。近年来，随着绿 色生产和可持续发展的呼声越来越高，市场上也相继推出了一些低毒、低残留的农药品 种，但是相对于低毒、低残留的农药而言，高毒农药具有价格低、用量少、防治效果好 等优点，易被使用者接受。目前，我国农药市场上的杀虫剂7 5 以上为有机磷类，而此 类农药一半以上为高毒品种。我国农药使用中高毒农药仍占相当比例，以乐果、甲胺磷、 1 6 0 5 、甲基一1 6 0 5 、敌敌畏等毒性较高的有机磷类农药使用最多【2 l 。 农药市场的不规范和使用者环保意识薄弱，使得高毒、高残留农药的使用率居高不 下，而对环境乃至人体造成的危害也越来越严重。2 0 0 3 年北京市召开的食用农产品污染 防治会议上公布，北京市近郊的蔬菜农药残留超标率为1 8 ，水果为1 6 ，外地进京蔬 菜的农药残留超标率为3 9 1 3 1 。据环保部门监测，黄河三角洲地区果园和蔬菜保护地栽 培连续五年以上的地块，土壤中有机磷农药检出率高达8 0 以上【4 j 。研究表明2 0 0 5 年 厦门附近海区中马銮内湾有机磷农药浓度达到了1 6 5 7 7 - 4 5 3 4 2 n g l 1 5 1 。上述调查结果显 示，由于有机磷农药大量的不规范的使用，已经给农产品、土壤乃至海域都造成了严重的 污染，有机磷农药污染治理迫在眉睫【6 锕。 一直以来研究较多的治理农药污染的方法是生物修复，也是公认的清洁不容易产生 二次污染的方法。生物修复主要是指微生物修复，微生物具有种类多、变异快和易于操 纵的特点，是生物修复的重要生物资源【9 1 0 1 。自上世纪7 0 年代开始，人们就发现有些土 壤微生物对有机磷农药具有降解作用。到目前为止已发现的有机磷农药降解微生物包括 细菌、真菌、放线菌和藻类。目前，国内外对有机磷降解菌在生物修复中的应用也已经 展开了广泛的研究。m u l b r y 等从蝇毒磷污染的土壤中分离的菌株制成生物过滤柱，在 7 d 1 0 d 内可将污水中1 5 0 0 m e ： l 的蝇毒磷降低到0 1 m g l 。 1 1 有机磷农药生产使用现状和引发的问题 1 1 1 有机磷农药生产使用现状 东北大学硕士学位论文第一章绪论 世界上常用的有机磷农药有1 0 0 多种，我国常用的也有3 0 余种。最近的几十年， 由于农业的快速发展也给农药产业带来了很大的发展。目前国内农药年生产能力万吨以 上的品种主要有：乐果、氧化乐果、甲基对硫磷、对硫磷、甲胺磷、辛硫磷、水胺硫磷、 克百威、杀虫双等，大部分都是有机磷农药。我国自1 9 8 2 年“六六六一、“d d t 相继 停产、限用、禁用后，有机磷农药的比重就更突出。农药界人士常用三个7 0 来形象地 说明这种现象，即杀虫剂占农药生产总量的7 0 ；在杀虫剂中有机磷类的占7 0 ；在有 机磷杀虫剂中，高毒性品种占7 0 。有机磷农药的地位和作用略见一斑。 最早的有机磷品种是3 0 年代末到4 0 年代由德国科学家合成的特普、八甲磷和至 今仍在广泛使用的对硫磷，以后又有高效、低毒的倍硫磷、敌百虫、苯硫磷、杀螟松等 研究成功，后来又进一步开发了内吸性有机磷如乐果、氧化乐果等。已经历了七十余年 的历史。有机磷农药以其品种多、药效高；防治对象多，应用范围广；作用方式多，药 害轻：在环境中降解快、残毒低等特点在杀虫剂中占据了相当重要的地位【1 1 1 。1 9 9 7 年， 按化工部统计农业用农药的总产值为3 5 7 万吨，其中有机磷农药为2 0 万吨左右，约占 整个农药的5 7 。而有机磷杀虫剂约为1 7 万吨，约占整个农药的5 0 左右，占杀虫剂 的7 0 以上。其中六个高毒品种( 甲胺磷、敌敌畏、甲基对硫磷、氧化乐果、久效磷) 产量高达1 3 1 6 万吨，占6 8 5 ，其它大吨位的有机磷杀虫剂还有乐果、辛硫磷等。近 年来虽然开发了不少高效的新农药，但由于价格、使用习惯等因素，新产品还远远不能 取代有机磷农药。有人认为我国在今后几十年内，有机磷杀虫剂仍会有相当的市场，要 彻底取代有机磷杀虫剂并非易事1 1 2 1 。 从全国各地农药使用情况来看，农药使用量较大的是山东、江苏、广东、浙江、湖 南、河北等地，其中山东达2 万多吨每年。在农药施用水平上，上海和浙江用药水平最 高，分别达l o 8 0 和1 0 4 1 k g h m 2 ；其他如福建、广东、湖南、江苏、山东等地也较高， 从4 0 3 7 8 5k g h m z 不等；全国平均水平为2 3 4 k g h m 2 。 1 1 2 农药使用引发的问题 农药的使用引发的问题主要由其毒性和残留引起的。戈峰【1 3 1 把农药杀虫剂的危害大 致归结为4 个方面： ( 1 ) 有益生物被杀伤，控制作用减弱。( 2 ) 害虫抗药性增加，防治成本提高，对环境 污染加重。( 3 ) 农副产品中农药残留量增加，危害人体健康。( 4 ) 污染土壤、大气和水 源，严重破坏了我们的生存环境。农药残留引起的农药在环境中大量累积和通过生物链 迁移造成对人畜的危害最终也是由农药的毒性表达的。所以，农药的毒性是其能否危害 东北大学硕士学位论文 第一章绪论 环境及人畜安全的重要指标。 1 1 2 1 农药的毒性 目前我国常用的农药中，甲胺磷、久效磷、1 6 0 5 、甲基1 6 0 5 、甲拌磷、氧化乐果、 水胺硫磷等均属高毒农药。这些有机磷农药都是胆碱酯酶抑制剂，对人和哺乳动物及其 它一些有益生物具有较高的毒性，虽然这些农药在用量上较有机氯农药降低了一个数量 级，但其毒性却比有机氯高出1 0 倍甚至百倍【1 4 1 。我国近十多年来发生的农药中毒事故大 多集中于这些高毒农药。 农药的毒性除受农药自身性质影响外，农药制剂中的某些毒性杂质，代谢过程中的 中间体及降解产物也会使农药的毒性增大。如除莠剂2 ，4 ，5 t 的禁用就是因为制剂中含 有微量二口恶因杂质对动物有致畸、致癌作用。另外有些农药，其降解或转化产物的毒 性依然很高，甚至比母体毒性更大。如涕灭威的l d s o 为0 9 m g k g ，其代谢产物涕灭威亚 砜与砜的l d s o 分别为0 9 m g k g 和2 5 m g k g ，与母体几乎同样高：对硫磷属高毒化学农药， 在光照条件下易发生光氧化反应，生成毒性更大的对氧磷，在短期内使对硫磷的毒性大 大增加。还有些农药的某些降解产物具有潜在的三致毒性。如敌敌畏水解生成的二氯乙 醛可能诱发突变。西维因在土壤中的降解产物卜萘基一羧基一甲基氨基甲酸酯也有致癌或 致突变的作用。 有些农药虽然急性毒性较低，但却有较高的慢性或三致毒性，在环境中施用后造成 更为严重的潜在危害。因此，农药的潜在毒性对人体健康造成的危害往往更大，更具有不 可逆性。值得注意的是，具有潜在毒性的农药，其急性毒性往往并不高，或者农药本身并 不直接具有三致毒性，而是由其代谢产物或制剂中含有的杂质所致，因而其危害性往往 在使用多年后才为人们认识【1 5 l 。如除草醚，按我国毒性分级标准属低毒除草剂，但近年来 因三致毒性已被限制和禁止使用。 1 1 2 2 农药生产管理不善和使用过程中产生的直接危害 我国目前由农药生产、使用引起的较为突出的环境问题主要是农药三废的点源污染 与高毒农药使用造成的危害问题。一般来说，在农药生产较为密集的地区，易发生农药 生产企业因三废不达标排放引起的污染。我国农药生产厂家规模小、数量多、技术力量 薄弱加上资金短缺，致使三废不达标现象十分严重，污染事故时有发生，如1 9 9 7 年吉 林四平一家生产阿特拉津的工厂污水排入河道后流入辽宁境内，农民用河水灌溉稻田后 造成2 6 0 0 多h m 2 水稻受害的特大污染事故【1 6 1 。除农药产地的三废污染外，在农药使用 量较大的地区，由于使用不科学及管理不善，常发生高毒农药引起的中毒事故。我国目 前农药使用中高毒农药仍占相当比例，又以甲胺磷、乐果、1 6 0 5 、甲基1 6 0 5 、敌敌畏等 东北大学硕士学位论文第一章绪论 毒性较高的品种使用最多。尤其在一些经济较为发达的地区，农药用量大多集中于这些 高毒品种。据统计，1 9 9 2 1 9 9 6 年间我国共发生农药中毒2 4 7 3 4 9 例( 不包括食用被农药 污染蔬菜造成的中毒) ，死亡2 4 6 1 2 人。中毒品种主要是甲胺磷、对硫磷、氧化乐果等 高毒有机磷杀虫剂。 1 1 2 3 农药喷施后对生态环境的污染 农药的残留对环境造成的污染主要集中在对水体、土壤、大气、和各环境中生物的 影响四个方面。由于使用不当和条件的制约，造成农药大量飘移流失，喷撒出去的农药 只有极少部分能达到要防治的靶标上。m e t c a l f ( 1 9 8 0 ) 估算，从施药器械喷撒出去的农药 只有2 5 5 0 能沉积在作物叶片上，不足l 的药剂能沉积在靶标害虫上，仅有不足 0 0 3 的药剂能起到杀虫作用旧。其余大部分的农药则进入土壤、水体、大气中，通过 各种途径危害环境生物和人类。 ( 1 ) 农药对水环境的污染 水体中农药主要有以下几个来源途径：大气漂移和大气降水、农田农药流失、水面 直接喷施农药等。一般来说，在非航空施药时，农药飘移量和影响范围都是较小的，所 以大气漂移和大气降水不会导致农药对水体的严重污染。水体直接施药是水中农药的重 要来源【1 8 1 。如为防治蚊子幼虫施敌敌畏、敌百虫和其他杀虫剂于水面。 农药污染对水环境的危害主要表现在影响地表水和地下水的质量、不利于水生生物 的生存，甚至破坏水生态系统的平衡【1 9 1 。7 0 午代我国对地表水中的有机氯农药和有机 磷农药残留量作过较详细的调查，在长江农药厂江段检测到较高浓度的六六六和有机磷 农药。从1 9 7 9 年起美国环境保护局就对地下水中的农药残留进行了检测发现有7 4 种 农药在地下水水中被检测到，而其中4 6 种是由农业使用引起的，另有3 2 种是由农药厂 点污染源和其他原因引起的。大部分样品中的农药浓度没有超过美国推荐的残留量容许 标准，但有1 7 种农药的部分样品超标，且分布在1 7 个州中，超标农药中有甲草胺、西 玛律、阿特拉津、涕灭威、异丙甲草胺和嗪草酮等。在农药对水生生物的影响中人们最 关心的是农药对鱼类的危害。按我国毒性分级标准属于对鱼类高毒的有机磷农药有毒虫 畏、毒死蜱、乙硫磷、倍硫磷、地虫硫磷、马拉硫磷、甲拌磷、伏杀硫磷、辛硫磷、溴 氯磷、线硫磷、氯唑磷等。 ( 2 ) 农药对土壤的污染 农药进入土壤的途径主要有三种。第一种是农药直接进入土壤，包括土壤施用的一 些除草剂、防治地下害虫的杀虫剂和拌种剂。第二种是为防治病虫草害喷洒于农田的各 类农药，它们的直接目标是虫、草和保护作物，但是有相当部分农药落入土壤表面，或 东北大学硕士学位论文第一章绪论 落入稻田水面而间接进入土壤。第三种是随大气沉降、灌溉水和动植物残体而进入土壤， 除大气沉降起一定作用外，对于短残留农药因灌溉水和动植物残体而进入土壤的农药量 是微不足道的 2 0 - 2 2 1 。 进入土壤的农药主要对农产品和土壤生物产生影响。农药对农产品的污染主要指农 作物从土壤中吸收农药而降低农产品质量。从农药种类看，水溶性的农药植物容易吸收， 而脂溶性的，被土壤强烈吸附的农药植物不易吸收。而不同的作物对农药的吸收能力也 是有差异的，据很多学者的研究，胡萝卜吸收农药的能力相当强，可以作为植物吸收土 壤农药的实验作物，而萝卜、烟草、莴苣、菠菜、青菜等都具有较强的吸收能力。蔬菜 从土壤中吸收农药的一般顺序是根菜 叶菜 果菜。蚯蚓对保持土壤的良好结构和提高 土壤肥力具有重要意义，所以农药对蚯蚓的危害是农药对土壤生物的危害的一个重要的 指标。一些资料表明，在推荐用量下能杀死蚯蚓的有机磷农药有毒虫畏、对硫磷、丰索 磷、地虫磷等，主要是高毒农药。如对硫磷和多菌灵在培养1 4 d 的条件下，引起蚯蚓5 0 死亡的浓度分别是7 4 5 2 m g k g 和4 2 7 m g k 9 1 2 3 1 ，而对土壤微生物影响较大的是杀菌剂， 它们不仅杀灭或抑制了病原微生物，同时也危害了一些有益微生物，如硝化细菌和氨化 细菌。 ( 3 ) 农药对大气的污染 大气的农药污染主要是由航空喷药和大型喷雾器造成的，一般都是局部污染，停留 时间也不会太长。但是在混种地区，粮、棉、油作物上使用的高毒农药会通过大气飘移 而污染蔬菜、茶叶、其他经济作物和出口农产品。农药对大气中生物的影响主要是对鸟 类的影响。 ( 4 ) 农药在环境中的残留对环境生物和人类产生的影响和危害 众所周知，农药可直接杀伤天敌引起害虫的再猖獗；也可通过杀伤中性昆虫而影响 天敌的作用；一些农药还具有刺激害虫( 如褐飞虱) 生殖的效应；滥用农药还会使害虫 抗药性不断增强，防治效果下降。吴进才等研究发现，农药的施用还会改变水稻植株生 理生化物质的含量，从而导致水稻抗虫性下降【2 4 彩】。可见，农药对环境生物的影响是多 方面的。 1 2 有机磷农药在土壤中的降解 1 2 1 有机磷农药的化学降解 农药的化学降解可分为催化反应和非催化反应。非催化反应包括水解、氧化、异构 东北大学硕士学位论文第一章绪论 化、离子化等作用，其中水解和氧化反应最重要f 2 6 】。而有机磷农药主要是水解反应。 有机磷农药水解形式主要包括酸催化、碱催化，但有机磷农药碱催化水解要比酸催 化水解容易的多，有机磷农药在碱性条件下水解速率比在酸性条件下有很大的提高，因 为有机磷农药的水解主要是发生在磷原子与有机基团连接的单键结构上( 这个有机基团 是取代羟基或羟基上氢原子的) ，而o h 取代有机磷农药的有机基团要比盯取代有机磷 农药的有机基团要容易得多，这与农药本身结构以及o h 的氧化能力强有关1 2 7 。当发生 碱性水解时，有机基团被水中的o h 所取代，当发生酸性水解时，有机磷农药中的有机 基团被矿取代。 有机磷酯杀虫剂在土壤中发生的水解反应式如下： o r 0 - - pm 0 r f o r 0 0 + h 2 0 一鼢一f 一0 h + r o h o r 有机磷农药在土壤中的水解速率与在纯水中的水解速率是不一致的，有机磷农药在 无土体系中的水解要比有土体系中的水解缓慢的多，如丁烯磷在3 8 、p h 为9 1 的条 件下，水解5 0 需3 5 h ，而它在普通土壤中水解8 7 也只需2 4 h ( 麦尔尼科夫h h e t a l ， 1 9 8 5 ) 。因为有机磷农药进入土壤以后，能被土壤中的有机质和矿物质所吸附，使有机 磷农药发生吸附催化水解反应。土壤中则存在着更多的氧化物( 0 3 、h e 0 2 、氮氧化物以 及有机质等) ，从而在体系中产生更多的o h ，使有机磷农药快速彻底的水解。土壤中 有机磷农药的水解还可能包含另一种机制，即与金属离子发生络合作用催化水解反应。 m o r t l a n da n dr a m a l l ( 19 7 4 ) 证实c u 2 + 可与地亚农发生络合反应，催化它的水解反应。 他们的研究结果还证明，金属离子催化有机磷农药水解的倾向与有机磷和金属离子形成 络合物或螯合物的能力有关。 1 2 2 有机磷农药的光解 有机磷农药对光的敏感程度比其他种类的农药要大的多，有机磷农药分子能在太阳 光的作用下，形成激发态分子，导致有机磷农药分子中建的断裂。如辛硫磷在2 5 3 7 r i m 的紫外光下照射3 0 h ，可产生中间产物一硫代特普，但照射8 0 h 以后，中间产物逐渐消 失( 戴树桂，1 9 9 7 ) 。除了上述由光直接作用而降解有机磷农药以外，有机磷农药还可 以在土壤中各种各样的催化剂和氧化剂( 如t i 0 2 、f e o 、f e 2 + 等) 的作用下发生光催化 东北大学硕士学位论文第一章绪论 降解。由于土壤中农药的光解多在表层进行，所以光解在农药降解中的贡献较小。但光 解作用使某些农药降解变成易被微生物降解的中间体，从而加快农药的降解。 1 2 3 有机磷农药的微生物降解 由于有机磷农药的水解和光解过程相对缓慢且不能彻底降解为小分子，因此只能作 为一种辅助手段加以利用。随着生物技术的不断发展，对有机磷农药的降解进行了探索， 充分肯定了微生物在降解中的重要作用。微生物主要包括细菌、真菌、放线菌、藻类等， 其中细菌由于生化上的多种适应能力以及易诱发突变菌株，在降解农药的微生物中占重 要地位【2 8 引l 。微生物具有种类多，变异快和易于操纵的特点，至今已分离了许多有机磷 农药的降解菌，其中一些微生物的有机磷降解酶的生化性质已得到鉴定，少数有机磷农 药降解基因已得到分离、鉴定、改造。用微生物或无细胞酶制品来消减农药污染的生物 修复技术显出广阔的应用前景。如郑天凌等【3 2 1 从沿岸海域分离了3 8 株有机磷农药的耐 药菌，用分批培养法进行富集培养，得到有机磷农药地降解菌，并着重研究了其中两株 菌对甲胺磷农药地降解情况，结果表明，在l o d 内，降解菌株1 比降解菌株2 的降解率 高6 ，在各自的甲胺磷培养液中，降解菌株l 的数量也多于2 ，在降解过程中降解菌株 l 的毒性要比2 下降幅度大。 有机磷农药的微生物降解主要存在以下过程，一种是微生物本身含有可降解该农药 的酶系基因，当有机磷农药进入土壤后，微生物马上能产生降解有机磷农药的降解酶， 在这种情况下，降解菌的选育较为容易，另一种是微生物本身并无可降解该有机磷农药 的酶系，当农药进入环境以后，由于微生物生存的需要，微生物的基因发生重组或改变， 产生新的降解酶系。微生物分泌的降解酶系有胞外酶和胞内酶，胞外酶可直接与有机磷 农药产生作用，其实质就是酶促反应【3 3 l ，而y o n e z a w w ay ( 1 9 7 9 ) 等认为当微生物对 有机化合物的降解作用是由其细胞内的酶引起时，微生物降解的整个过程可以分为三个 步骤，首先是化合物在微生物细胞膜表明的吸附，这是一个动态平衡；其次是吸附在细 胞膜表面的化合物进入细胞膜内，在生物量一定时，化合物对细胞膜的穿透率决定了化 合物穿透细胞膜的量；最后是化合物进入微生物细胞膜内与降解酶结合发生酶促反应， 这是一个快速的过程【3 4 1 。 1 3 有机磷农药微生物降解的研究进展 1 3 1 有机磷农药降解菌株的筛选 东北大学硕士学位论文 第一章绪论 目前，可降解有机磷农药微生物的获得途径主要有： ( 1 ) 从受污染的土壤、农药厂污水处理曝汽池中的污泥等受污染的环境介质中富 集、驯化、筛选分离高效降解菌，这是目前采用最多的一种方法。 ( 2 ) 定向培育优良菌种近年来也备受关注，其方法是在土壤中通过人为多次施药， 培育可降解该农药的微生物，当再次施药时，经降解速率的测定，如发现农药在该土壤 中的降解速度快于未施药土壤，则可确定降解该农药的微生物种群已培育起来，而后可 从中分离出高效降解菌株，如r o n a l d 等连续向土壤中施用乙烯菌核利，诱发筛选出该 农药的降解菌假单胞杆菌【3 5 1 ，a l l a n w 等通过向土壤中施加萘丙酸草胺诱发该农药降解 菌的产生并分离t 3 6 j 。 ( 3 ) 在上述两种方法的基础上进行诱变育种，王永杰通过紫外诱变育种获得高效 菌株【3 7 l 。刘玉焕等用n t g 诱变曲霉属乐果降解菌，经测定该诱变菌株对乐果的降解率明 显提高【翊。 目前已筛选出的对有机磷农药有降解作用的菌株见表1 1 。 表i i 部分有机磷农药降解微生物分类一览表 t a b l e l 1l i s to f p a r t so f o r g a n o p h o s p h o r u s - d e g r a d i n gm i c r o b i a l s 东北大学硕士学位论文 第一章绪论 1 3 2 有机磷农药微生物修复的应用研究 有机磷农药降解菌的应用于生物修复目前大部分技术仍处于试验和小规模的应用 阶段。因为土壤污染并不仅仅是单一污染物造成，而是逐渐呈现多种污染物( 重金属、 化学肥料、农药、农膜等) 的复合污染趋势。尤其呈现出土壤、生物、水体、大气的立 体污染【3 9 】。李顺鹏等将从活性污泥中分离到的兼厌气性降解菌属产碱菌属的一个种 ( a l c a l i g e n e ss p ) 应用于盆栽试验、小区试验和田间试验均取得了很好的对甲基对硫磷 的降解效果。盆栽试验中，处理的各叶片变黄程度比对照均要轻，统计差异显著；小区 试验中，稻米与稻壳中甲基对硫磷处理比对照下降了8 2 8 - 1 0 0 ，效果显著；田间试 验中，农药+ 菌，农药+ 有机肥+ 菌的处理，其稻米中均检测不到甲基对硫磷残留，而对 照稻米中的甲基对硫磷残留量为o 0 6 5 m g k g ，超过国家标准( 0 0 5 m g k g ) 。方玲将分离 到的微生物制成混合降解菌剂应用于盆栽和田间试验，所得到的降解效果类似于纯培养 试验，降解效果显著。程国峰的小区试验也表明，降解菌剂对普通白菜中残留的甲胺磷 和乐果有明显的去除作用，各处理的平均降解达到8 0 以上。以上说明利用农药降解菌 剂解决蔬菜、作物等的农药残留问题是可行的，其应用前景是乐观的。目前，国内已有 “农药残留降解菌剂 产品问世，并获得了专利。 1 4 对硫磷的理化性质及其危害 1 4 1 对硫磷的理化性质 对硫磷，化学名称为o ，o - - 乙基一伊( 对硝基苯基) 硫代磷酸酯，分子式为 c l o h l 4 n 0 5 p s ，俗称1 6 0 5 或乙基一1 6 0 5 。结构式如下： 锄明2 0 u 一。一。 c h 3 c h 2 0 纯品外观为几乎无色、无嗅的液体或白色针状晶体，工业品为棕色并有蒜臭的液体。 相对密度1 2 6 ( t g = 1 ) 。熔点6 ，沸点1 5 7 ( o 8 k p a ) ，闪点1 2 5 c ( 不含易燃杂质) 。 饱和蒸气压0 3 x l o 5 k p a ( 3 0 c ) 。几乎不溶于水，易溶于除石油类以外的有机溶剂，如丙 酮、苯、二甲苯等，与浓硫酸能完全混合。稳定性：对紫外光与空气都不稳定，在中性 或微酸性溶液中较为稳定；在碱性溶液中易分解失效。危险性：遇明火、高热可燃；受 热分解，放出磷、硫的氧化物等毒性气体。 东北大学硕士学位论文第一章绪论 1 4 2 对硫磷的毒性 对硫磷为农业用光谱杀虫剂，属高毒类，对温血动物毒性强烈。急性毒性，大鼠经 1 ：3 l d s o 为6 - 1 5 m g k g ，经皮为4 0 一5 0m g k g ，腹腔注射为4 7m g k g 。大鼠一次吸入4 小 时l c s o 为3 1 5 m g m 3 。人经口致死量估计成人为1 0 - 3 0 m g ，儿童为数毫克。 对硫磷的毒理作用与一般有机磷化合物一样，对c h e 的体外抑制作用比较微弱， 当对硫磷进入机体，在体内氧化成为对氧磷后，才具有强烈的c h e 抑制作用。对硫磷 急性与非急性中毒的临床表现同一般有机磷农药一样，严重的对硫磷急性中毒在脱离昏 迷状态以后，可出现精神症状，包括兴奋、定向力丧失、语无伦次、手足乱动、幻听、 幻视等。除此之外，还可出现白细胞增多、中度蛋白尿、