（环境工程专业论文）多环芳烃、多氯联苯优良降解菌的分离鉴定及降解特性研究.pdf

山东大学博十学伉论文 中文摘要 作为持久性有机污染物( p e r s i s t e n to r g a n i cp o l l u t a n t s ，p o p s ) 的典型代表， 多环芳烃( p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ，p a h s ) 和多氯联苯( p o l y c h l o r i n a t e d b i p h e n y l s ，p c b s ) 的分析方法、环境影响及其污染修复技术是目前国内外热点 研究领域，生物降解特别是微生物降解被认为是去除环境中p a h s 、p c b s 的主 要途径。本文在全面综述国内外相关研究的基础上，通过调查和监测选择并确 定了p a h s 、p c b s 污染的土壤样品，筛选得到的一株可以高效降解p a h s 、p c b s 的菌株，基于形态学特征、生理生化试验、细胞化学成分鉴定及1 6 sr d n a 序 列比对分析等手段，鉴定该菌株属于两面神菌属( j a n i b a c t e rs p ) ，命名为j y l l 。 以此为基础，系统研究了j y l l 对p a h s 、p c b s 的降解效果和影响因素以及与 p h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u mj y l 6 联合降解效率，并借助气相色谱一质谱联用 技术对降解中间产物的定性分析，初步探讨了该菌株对菲、芘、苯并( 口) 芘和 p c b l 8 、p c b 7 7 的代谢途径。论文主要研究内容和结果如下： 1 污染土壤中p a h s 和变压器油中p c b s 的提取及分析 ( 1 ) 采用索氏提取、超声提取及超临界c 0 2 提取三种样品前处理技术，结 合g c f i d 分析技术，研究获得了济南炼油厂及胜利油田土壤中p a h s 的污染 特征。济南炼油厂土壤中检出全部1 6 种p a h s ，浓度范围为5 0 5 9 3 2b t g k g ； 胜利油田采油厂土壤中检出1 2 种p a h s ，浓度范围为2 2 7 7 - 1 1 0 7 3p , g k g ，两处 土壤均在一定程度上受到了p a h s 的污染。三种提取技术均有很好的提取效率 和重现性，相对标准偏差( r s d ) 小于5 ( n = 3 ) ，p a h s 加标回收率为 8 8 7 1 0 2 6 ，符合美国e p a 标准中环境样品回收率( 7 0 1 4 0 ) 及r s d ( 乜o ) 的要求。 ( 2 ) 采用液液萃取、超声萃取及固相萃取等三种样品前处理技术，结合本 实验室前期建立的p c b s 分析方法，研究建立了简便快速的p c b s 提取及g c e c d 分析技术。研究测定了废弃国产变压器油中类二嗯英类及阻转类p c b s 的成分与 含量，检出1 0 种类二嗯英类p c b s ( p c b 7 7 ，8 1 ，1 0 5 ，1 1 4 ，1 1 8 ，1 2 3 ，1 2 6 ，1 5 6 ，1 6 7 ， 1 8 9 ) 和4 种阻转类p c b s ( p c b 4 5 ，9 5 ，1 3 2 ，1 4 9 ) 。实验还结合a r c o l o r1 2 4 2 标准品 对变压器油中p c b s 组分进行了分析，得至i j p c b s 的分布特征：二氯联苯含量为 1 4 2 ；三氯联苯含量为5 1 2 ；四氯联苯含量为2 9 8 ；五氯和六氯联苯含量为 山东大学博 学位论文 4 8 。由此可见，国产变压器油以三氯联苯为主，高氯代p c b s 所占比例很少。 三种提取方法的r s d 均小于5 ( n = 3 ) ，内标p c b 2 0 9 的回收率为8 2 3 9 1 6 ， 符合美国e p a 标准中回收率及相对标准偏差的要求。 2 p a h s 、p c b s 降解菌的分离与鉴定 ( 1 ) p a h s 、p c b s 优势降解菌的分离。采集济南市炼油厂、胜利油田采油 厂及原济南市变压器厂的土样，以菲、蒽、芘的混合样品为唯一碳源，采用定 时定量转接、逐步提高碳源浓度的方法，共获得1 2 5 个单菌落，经降解效率初 步测定，选取降解能力较强的两株细菌j y l l 和j y 3 a 进行鉴定研究。 ( 2 ) j y l l 和j y 3 a 的鉴定。通过形态特征描述，综合运用生理生化检测、 脂肪酸分析、甲基萘醌分型及g c 摩尔百分含量测定等方法，结合1 6 sr d n a 序列分析、构建系统进化树，j y 3 a 被认为属于b a c i l l u s 菌属的丑s u b t i l i s 类群， 由于b a c i l l u s 菌属目前定名的复杂性和不确定性，尚需进一步p f g e 和 d n a d n a 杂交实验数据支持鉴定到种。 ( 3 ) j y l1 被鉴定为j a n i b a c t e r 菌属。该属1 9 9 7 年方予以命名，确定模式种 为j a n i b a c t e rl i m o s u s ，至今仅有5 个种的报道。但j y l l 与该属模式种有较大差 异，与其遗传距离最近的为j a n i b a c t e ra n o p h e l i s 。细胞脂肪酸组成及含量分析 结果表明，j y l l 在脂肪酸化学分类特征上表现出独特的菌株特异性，不同于 j a n i b a c t e rl i m o s u s 和j a n i b a c t e ra n o p h e l i s 的已有报道。初步实验表明j y l l 在表 现出良好的p a h s 降解能力的同时，对p c b s 亦有较好的降解能力，因此选择 j y l l 菌作为后续研究的出发菌株。 3 j a n i b a c t e rs p j y l l 对p a h s 、p c b s 的降解效果及影响因素研究 ( 1 ) j a n i b a c t e rs p j y ll 对p a h s 的降解效果 研究了液体培养条件下，j a n i b a c t e rs p j y l l 对初始浓度为1 0 0m g lp a h s 的 降解效果。结果表明，j a n i b a c t e rs p j y l l 不仅对低分子量p a h s ! t l l 菲、芴、苊等 有很好的降解效果，对四环的芘、荧蒽、苯并( 口) 蒽等也有较好的降解效果，五 环和六环的高分子量p a h s 也有不同程度的降解。由此可见，j y l l 表现出非常宽 的降解底物谱及很强的降解能力。 ( 2 ) 影响j a n i b a c t e rs p j y l l x 寸p a h s 的降解效率的因素 实验中分别以三环的菲、四环的芘和五环的苯并( a ) 芘为代表，研究了不同 p a h s 初始浓度、不同浓度的表面活性n t w e e n8 0 和t r i t o nx 1 0 0 及水杨酸诱导作 i i 山东人了：博十学位论文 詈音曼曼詈曼詈皇詈詈皇皇詈詈詈曼詈詈皇葛曹皇鼍詈寡暑! - 。m i i 皇暑皇皇詈詈詈鼍皇量皇皇曼置皇曼鼍曼 用对p a h s 降解效率的影响。结果表明：随着初始浓度的增加，芘和苯并( 口) 芘的 降解效率逐渐降低，而菲则可以在很宽的浓度范围内全部降解；表面活性剂 t w e e n8 0 对p a h s 降解有一定的促进作用；通过用水杨酸做共代谢底物，相比用 菲作共代谢底物，苯并( 口) 芘的降解效率提高了2 8 。 ( 3 ) j a n i b a c t e rs p j y l1 对p c b s 的降解效果 实验研究了在液相纯培养条件下，j y l l 对初始浓度分别1 0m g l 及1 0 0m g l p c b s 的降解效果。结果表明，随着初始浓度增加，降解效率略有下降，但总体 上j y l i 聂j p c b s 具有较好的降解效果。对于初始浓度为1 0r a g 1 的p c b s ，二氯及三 氯p c b s 的降解效率为8 3 - 一1 0 0 ，多数高于9 0 ；四氯p c b s 的降解效率为 7 8 0 旷9 4 ；五氯及六氯p c b s 的降解效率也达到5 0 “5 。j y l l 对邻位、对位取 代p c b s 均可降解，只是随着氯原子数增加，降解效率降低。由此可见，氯原子 取代位置并不是影响j y l l 对p c b s 降解的主要因素。 ( 4 ) 天然植物组分诱导d a n i b a c t e rs p j y l l 降解p c b s 通过在液体培养基中添加九州虫草子座挥发油、唐古特青兰挥发油、草果 挥发油、香芹酮、柠檬烯等天然植物组分，考察了其对j a n n i b a c t o rs p j y l l 降 解p c b s 效率的影响。结果表明九州虫草子座挥发油、香芹酮能显著提高绝大 多数p c b s 的降解效率，柠檬稀也有一定的促进作用。 4 j a n i b a c t e rs p j y l1 - p c h r y s o s p o r i u mj y l 6 联合降解p a h s 、p c b s 利用白腐真菌胞外氧化还原酶系丰富，底物专一性低，对外源物质的降解 不受其浓度大小的影响等优点，在j a n i b a c t e rs p j y l l 中加入一株白腐真菌一黄 孢原毛平革菌( 户c h r y s o s p o r i u mj y l 6 ) ，研究其联合降解作用。实验结果表明： 液体培养条件下，混合菌对p a h s 的降解效果明显好于单一菌降解效果，尤其 是四环的芘和五环的苯并( 口) 葸、苯并( 妨荧蒽的降解效率相比j y l1 单独降解提 高了2 0 以上。对于模拟污染土壤环境，混合菌对芘和苯并( 口) 芘的降解效率分 别为7 3 和6 0 ，相比用单一菌降解也得到很大程度的提高。同样液体培养条 件下，混合菌对p c b s 的降解效果明显优于单一菌降解效果。尤其是对于类二 嗯英类的六氯联苯p c b l 5 6 ，1 6 7 和七氯联苯p c b l 8 9 ，单一菌并不利用；而当两 株菌联合降解时，三种高氯p c b s 降解了1 0 左右。在此实验基础上，用混合 菌直接降解变压器油及模拟污染土壤中的p c b s 。结果表明：变压器油中p c b s 的降解效率为8 7 8 3 3 ；对于模拟污染土壤样品，除p c b 7 4 ，类二嗯英类 i i i 山东大学博十学传论文 詈詈詈詈皇鼍詈皇i , i 一i i i iio 鼍皇皇詈喜量置鼍詈詈皇皇皇皇暑暑詈 p c b l 0 5 ，1 1 8 和阻转类p c b l 3 2 ，1 4 9 没有降解外，其余p c b s 的降解效率为 1 8 4 - 7 2 6 。 5 j a n i b a c t e rs p j y ll 降解p a h s 、p c b s 中间产物及代谢途径初步分析 以三环的菲、四环的芘和五环的苯并( 口) 芘作为j y l l 降解p a h s 代谢途径分 析的研究对象；以三氯p c b l 8 及类二嗯英类p c b 7 7 作为j y l l 降解p c b s 代谢 途径分析的研究对象，利用g c m s 技术，通过对中间产物的检测，初步推导 了j y l l 降解p a h s 、p c b s 的代谢途径。 ( 1 ) 菲：菲在双加氧酶的作用下生成顺式2 ，3 二氢二羟基菲，然后转化成 1 羟基二萘酸，脱羧后生成1 萘酚，最后开环生成水杨酸。 ( 2 ) 芘：芘在双加氧酶的作用下生成顺式4 ，5 二氢二羟基芘，然后在脱氢 酶作用下重新芳香化生成顺式4 ，5 二羟基芘，该产物进一步通过双加氧酶开环 生成4 ，5 二羧酸菲，最终在脱羧酶的作用下生成4 羟基菲，最后开环生成邻苯二 甲酸。 ( 3 ) 苯并( 口) 芘：苯并0 ) 芘在双加氧酶的作用下生成顺式7 ，8 二氢- 二羟基苯 并( 口) 芘，然后在脱氢酶作用下重新芳香化生成顺式7 ，8 - 二羟基苯并( 口) 芘，该产 物进一步通过双加氧酶开环生成7 羟基8 羧酸芘。 ( 4 ) 三氯联苯p c b l 8 和四氯联苯p c b 7 7 代谢途径基本相同，即j y l1 进攻 p c b s 的2 ，3 位，生成2 ，3 二氢二羟基p c b s ，该产物在脱氢酶的作用下生成2 ，3 二羟基p c b s ；然后在第二个双加氧酶作用下开环生成2 ，5 一二氯2 羟基6 氧 6 2 ，5 二氯苯基2 ，4 己二烯酸，该产物在水解酶的作用下生成氯代苯甲酸。 关键词：多环芳烃；多氯联苯；j a n i b a c t e rs p j y l l ； pc h r y s o s p o r i u mj y l 6 ； 微生物降解 i v 山东大学博1 ：学位论文 a b s t r a c t a st h er e p r e s e n t a t i v es u b s t a n c e so fp e r s i s t e n to 曙a n i cp o l l u t a n t s ( p o p s ) ，s t u d yo n t h ea n a l y s i sm e t h o d ，e n v i r o n m e n t a li m p a c ta n dp o l l u t i o nr e p a i r i n go fp o l y c y c l i c a r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ( p a h s ) a n dp o l y c h l o r i n a t e db i p h e n y l s ( p c b s ) i sar e s e a r c h e m p h a s i si na l lo v e rt h ew o r l d e s p e c i a l l ym i c r o b i o d e g r a d a t i o ni sc o n s i d e r e dt ob ea m a j o rw a yt ow i p eo f fp a h sa n dp c b si nt h ee n v i r o n m e n t b a s e do nt h er e v i e wo f r e l a t e ds t u d yi nt h ew o r l d w i d e ，ah i g h l ye f f e c t i v ep a h sa n dp c b s - d e g r a d i n g b a c t e r i n mw a si s o l a t e d t h ei s o l a t ew a si d e n t i f i e da sj a n i b a c t e rs p 、析n 1r e s p e c tt o i t s16 sr d n as e q u e n c ea n df a t t ya c i dp r o f i l e s ，a sw e l la sv a r i o u sp h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s ，a n dn a m e dj y l1 f u r t h e rs t u d yh a sb e e nd o n es y s t e m a t i c a l l yo n d e g r a d a t i o na b i l i t ya n dr e l e v a n tf a c t o r st h a ta f f e c tt h ed e g r a d a t i o np e r f o r m a n c e c o - d e g r a d a t i o no fp a h sa n dp c b s 、析mj r l 1a n d 户c h r y s o s p o r i u mj r16w a sa l s o r e s e a r c h e d t h ep r o b a b l ep a t h w a yo fp a h sa n dp c b sd e g r a d e db yj y llw e r e p r o p o s e d 、析md e t e c t i n g t h em e t a b o l i t e sb yg c - m s t h em a i nc o m e ma n d e x p e r i m e n t a lr e s u l t sa r ea sf o l l o w ： 1 e x t r a c t i o na n da n a l y s i so fp a h sf r o mp o l l u t e ds o i la n dp c b sf r o m t r a n s f o r m e ro i l ( 1 ) s o x h l c te x t r a c t i o n , s u p e r c r i t i c a lc 0 2e x t r a c t i o na n du l t r a s o n i ce x t r a c t i o n w e r es e l e c t e dt oe x t r a c tp a h sf r o mp o l l u t e ds o i lg a t h e r e df r o mj i n a no i lr e f i n e r y f a c t o r ya n ds h e n g l io i lf i e l d a n dt h ee x t r a c t sw e r ea n a l y z e db yg c f i d t h e r e s u l t ss h o w e dt h a t ：16k i n d so fp a h si nj i n a no i lr e f i n e r yf a c t o r yw e r ed e t e c t e d 、啊t 1 1ac o n c e n t r a t i o no f5 0 - 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p c b sw e r ed e t e c t e di nt h e c h i n e s et r a n s f o r m e ro i l o t h e rp c b sc o m p o n e n t sw e r ea l s oa n a l y z e dw i t ha r c o l o r 12 4 2s t a n d a r d t h er e c o v e r yo fi n t e r n a ls t a n d a r do fp c b 2 0 9 、析md i f f e r e n te x t r a c t i o n m e t h o dw a si nt h er a n g eo f8 2 3 9 1 6 a n dt h er s d l e s st h a n5 ，m e e t i n gt h e u se p as t a n d a r do fr e c o v e r i e sa n dr s do fr e p e a t e ds a m p l e s 2 i s o l a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fp a h sa n dp c b s d e g r a d i n gb a c t e r i a 16p a i l s - d e g r a d i n gs t r a i n sw e r en e w l yi s o l a t e df r o mt h ep o l l u t e ds o i li nj i n a n o i lr e f m e r yf a c t o r y ，s h e n g l io i lf i e l da n df o r m e rj i n a np o w e rt r a n s f o r m e rf a c t o r y ， s h a n d o n gp r o v i n c eo fc h i n a t w ob a c t e r i a , j y l1 a n dj y 3 a ，w e r ei n v e s t i g a t e d s t r a i nj y l1w a si d e n t i f i e da sj a n i b a c t e rs p w i t hr e s p e c tt oi t sm o r p h o l o g y , 16 s r d n as e q u e n c e ，p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s ，a n df a t t ya c i dp r o f i l e s ，a sw e l la sv a r i o u s p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s t h es t r a i nw a sg r a m - p o s i t i v e ， n o n m o t i l e ，n o n - s p o r e - f o r m i n g ，s h o r tr o d si ny o u n gc u l t u r e ，0 8 - 1 0p mi nd i a m e t e r a n d1 3 - 1 6l a i nl o n g ，a n dc o c c o i dc e l l si nt h es t a t i o n a r yp h a s eo fg r o w t ht h a ta r e 1 0 - 1 2l g ni nd i a m e t e ra n d1 3 - 1 5p , ml o n g ，o c c u r r e di np a i r sa n ds o m e t i m e si n c h a i n so ri ng r o u p ，a e r o b i c ，o x i d a s e w e e kp o s i t i v e ，c a t a l a s e p o s i t i v e o nt h eb a s i so f 16 sr d n as e q u e n c es i m i l a r i t ys t u d i e s ，s t r a i nj y llw a ss h o w nt ob em o s tc l o s e l y r e l a t e dt oj a n i b a c t e ra n o p h e l i s ( 9 9 9 3 ) ，jt e r r a e ( 9 8 4 8 ) ，zm a r i n u s ( 9 8 3 8 ) ， l i m o s u s ( 9 8 3 4 ) ， m e l o n i s( 9 8 2 0 ) a n dz c o r a l l i c o l a ( 9 7 7 9 ) c h e m o t a x o n o m i cd a t a ( m e n a q u i n o n e ，g cc o n t e n ta n dm a j o rf a t t ya c i d s ) s u p p o r t e d t h ea l l o c a t i o no ft h es t r a i nt ot h eg e n u sj a n i b a c t e r s t r a i nj y 3 aw a sc h a r a c t e r i z e da sm o t i l e ，r o d - s h a p e d ，g r a m - p o s i t i v e ，e n d o s p o r e f o r m i n g ，s i n g l eo ri np a i r sa n ds o m e t i m e si nc h a i n s ，a e r o b i c ，o x i d a s e 。p o s i t i v e ， c a t a l a s e - p o s i t i v e o nt h eb a s i so f16 sr d n as e q u e n c es i m i l a r i t ys t u d i e s ，s t r a i nj y 3 a w a ss h o w nt ob em o s tc l o s e l yr e l a t e dt o 丑v a l l i s m o r t i s ( 9 9 6 9 ) ，丑s u b t i l e ( 9 9 6 5 ) ，丑a m y l o l i q u e f a c i e n s ( 9 9 6 0 ) ，丑m o j a v e n s i s ( 9 9 5 7 ) a n d 丑a t r o p h a e u s ( 9 9 4 2 ) c h e m o t a x o n o m i cd a t as u p p o r t e dt h ep r o p o s a lt oa s s i g nt h es t r a i nt ot h e 丑 s u b t i l i sg r o u po ft h eg e n u sb a c i l l u s 山东大学博七学位论文 3 s t u d yo fd e g r a d a t i o na b i l i t ya n dr e l a t e df a c t o r st h a ta f f e c tt h ed e g r a d a t i o n p e r f o r m a n c eo fp a h sa n dp c b sb yj a n i b a c t e rs p j y l1 ( 1 ) d e g r a d a t i o no f p a h sb yj a n i b a c t e rs p j y l l p a h sw i t l li n i t i a lc o n c e n t r a t i o no f10 0m g qw e r ed e g r a d e dw i t hj y l1i nl i q u i d c u l t u r e t h er e s u l ts h o w e dt h a tn o t o n l yt h e l o wm o l e c u l a rp a h s ，s u c ha s p h e n a n t h r e n e ，f l u o r e n e a n da c e n a p h t h e n e ，b u ta l s o p y r e n e ，f l u o r a n t h e n ea n d b e n z o ( a ) a n t h r a c e n eh a v eag o o dd e g r a d a t i o nr e s u l t a l s ot h eh i g hm o l e c u l a rp a h s d e g r a d e di nd i f f e r e n td e g r e e j y llp r e s e n t e daw i d ed e g r a d a t i o ns p e c t r u ma n dh i 曲 e f f e c t i v ed e g r a d a t i o na b i l i t y ( 2 ) e f f e c t so fd i f f e r e n ti n i t i a lc o n c e n t r a t i o n s ，s u r f a c t a n ta n ds a l i c y l i ca c i do nt h e d e g r a d a t i o ne f f i c i e n c yo fp a h sw e r es t u d i e dt a k i n gp h e n a n t h r e n e ，p y r e n ea n d b e n z o ( a ) p y r e n ea sr e p r e s e n t a t i v e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed e g r a d a t i o ne f f i c i e n c y o fp y r e n ea n db e n z o ( a ) p y r e n ed e c r e a s e d 、) l ，i t l lt h ei n c r e a s eo fi n i t i a lc o n c e n t r a t i o n ， w h i l ep h e n a n t h r e n ec a nb ed e g r a d e dc o m p l e t e l y 、 ，i 廿ld i f f e r e n ti n i t i a lc o n c e n t r a t i o n s t w e e n8 0i sh e l p f u lf o rt h ed e g r a d a t i o no fp a h s t h r o u g ha d d i n gs a l i c y l i ca c i di n t h em e d i u m ，t h ed e g r a d a t i o ne f f i c i e n c yo fb e n z o ( a ) p y r e n ei n c r e a s e d2 8 c o m p a r e d w i t hp h e n a n t h r e n ea sc o m e t a b o l i z e ds u b s t a n c e ( 3 ) d e g r a d a t i o no fp c b sb yd a n i b a c t e rs p j y ll t h ed e g r a d a t i o ne f f i c i e n c yo fp c b s 、析廿1ac o n c e n t r a t i o no f10m e g la n d10 0 m 朗w a ss t u d i e ds e p a r a t e l y t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ed e g r a d a t i o ne f f i c i e n c y d e c r e a s e di ns o m ed e g r e ew i t l lt h ei n c r e a s eo fi n i t i a lc o n c e n t r a t i o no fp c b s b u t j y ll p r e s e n t e dag o o dp e r f o r m a n c e a saw h o l e f o rp c b s 、析t l la ni n i t i a l c o n c e n t r a t i o no f10m g 1 ，t h ed e g r a d a t i o ne f f i c i e n c i e so ft h ed ia n dt r i c l o r i n e - 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