（环境工程专业论文）小球藻的自养培养及其产物中多不饱和脂肪酸的研究.pdf

学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作所取得 的研究成果。除了文中已经注明引用的内容外，论文中不包含其他个人或集体已经 发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中 以明确方式标明。本声明的法律后果完全由本人承担。 作者签名：巫墟日期：矽年厂月力曰 学位论文授权使用声明 本人完全了解北京工商大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校 攻读学位期间学位论文所涉及的知识产权属于北京工商大学。学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许学位论文被查阅和借阅；学校 可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、 汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后遵守此规定) 学位论文电子版同意提交后，可于 口当年口一年 口二年后在学校图书馆 网站上发布，供校内师生浏览。 作者签名：建乏跪 导师签名：日期：川年朋7 ，胡 摘要 多不饱和脂肪酸( p u f a s ) 在营养和医学领域有着重要作用。目前p u f a s 主要从鱼 油中提取，工艺复杂，价格昂贵。小球藻中含有丰富的多不饱和脂肪酸，因此利用微 藻，尤其是自养小球藻，可以吸收c 0 2 转化生产多不饱和脂肪酸具有广阔的前景。 本文采用中国淡水藻种库的三株小球藻( 藻株1 0 6 8 、2 7 0 、4 0 ) 和实验室自行筛选 的三株小球藻( 藻株w l z 8 、1 4 、2 4 ) ，通过设计l 9 ( 3 4 ) 正交实验( o n a 2 c 0 3 、初始 p h 值、n p ) 对培养条件进行优选；培养过程中以碳酸钠为碳源，硝酸钠为氮源，磷 酸二氢钾为磷源。通过设计单因素实验( 接种量、温度、光照强度、盐度) 对影响小 球藻自养培养的环境因素进行探索。实验中以小球藻的生物量、生长速率、世代时间、 细胞密度为指标，确定最佳培养条件。在优化培养条件下，六株小球藻的1 2 天生物 量分别为0 4 2 5 、0 3 8 8 、0 2 7 5 、0 2 9 8 、0 3 2 7 、0 3 0 3 9 l 。 本文利用乙醚石油醚法对小球藻产物中的多不饱和脂肪酸进行提取，采用酸碱 结合甲酯化法对多不饱和脂肪酸进行预处理。为提高测定样品预处理的效率，本文通 过设计l 9 ( 3 4 ) 正交实验( p k o h 甲醇、皂化时间、p h 2 s 0 4 甲、酯化时间) 和单因素实验对 预处理条件进行优选。最终确定样品预处理的最优条件是p k o h - 甲醇为0 5 m o l f l ，皂化时 间为1 0 m i n ，0 h 2 s 0 4 甲醇为5 ，酯化时间；n 8 m i n 。测定过程中的r s d 为0 7 3 1 ，六株 小球藻粉经乙醚石油醚提取以及甲酯化过程的加标回收率5 5 5 一8 2 7 。 本文建立了多不饱和脂肪酸的g c m s 的定性定量测定方法。经g c m s 对样品进 行初步分析确定藻粉中主要产物为c 1 6 h 3 0 0 2 、c 1 8 h 3 6 0 2 、c 1 8 h 3 2 0 2 和c 1 8 h 3 0 0 2 。其出峰 时间依次分别为1 5 9 5 、2 0 2 4 、2 0 4 5 和2 1 0 0 。 通过加标回收率折算，六株小球藻粉种p u f a s 的实际产量分别为1 0 6 6 m g g 藻粉、 2 0 5 2 m g g 藻粉、10 7 2 m g g 藻粉、11 6 4 m g g 藻粉、2 6 0 5 m g g 藻粉和12 8 4 m g g 藻粉。 其中每克干藻粉中c 1 6 h 3 0 0 2 含量最高的为w l z 1 4 藻株( 8 0 3 m g ) ；c i s h 3 6 0 2 含量最高 的为4 0 藻株( 4 5 1 m g ) ：c l s h 3 2 0 2 含量最高的为4 0 藻株( 6 9 1 m g ) ；c 1 8 h 3 0 0 2 含量最高的 为2 7 0 藻株( 8 4 7 m g ) 关键词：小球藻；正交试验；自养培养；不饱和脂肪酸 a b s t r a c t t h ep o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s ( p u f a s ) p l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nn u t r i t i o na n d m e d i c i n e 。h o w e v e r t h et r a d i t i o n a l w a y o f e x t r a c t i n g i t f r o m f i s ho i li s t e c h n o l o g i c a l l y ? c o m p l i c a t e d ，r e s u l t i n g i n h i g hp r i c e s c h l o r e l l a c o n t a i n sa b u n d a n t p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s ，s ou s i n gm i c r oa l g a e ，e s p e c i a l l ya u t o t r o p h i cc h l o r e l l a ，c a n a b s o r bc 0 2c o n v e r s i o np r o d u c t i o np o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i dh a sw i d ep r o s p e c t t h i sp a p e ra d o p t e db yt h ec h i n e s ef r e s h w a t e rl i b r a r yr e a s o nc h l o r e l l a ( a l g a es t r a i n s 10 6 8a n d2 7 0 ，4 0 ) a n dl a b o r a t o r yi t s e l fs c r e e n i n gr e a s o nc h l o r e l l a ( w l z 一8 ，a l g a es t r a i n s 1 4 ，2 4 ) ，t h r o u g ht h ed e s i g nl 9 ( 3 4 ) o r t h o g o n a le x p e r i m e n t ( pn a 2 c 0 3 ，i n i t i a lp hv a l u e ， n 伊) o nc u l t i v a t i o nc o n d i t i o no p t i m i z i n g ；i nt h ep r o c e s so fc u l t i v a t i o nf o rc a r b o ns o u r c e s ， s o d i u mn i t r a t ea sn i 仃o g e ns o u r c e ，p o t a s s i t i md i h y d r o g e np h o s p h a t ef o rp h o s p h o r u ss o u r c e t h r o u g ht h ed e s i g ns i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t ( i n o c u l a t i o nq u a n t i t y ，t e m p e r a t u r e ，l i g h t i n t e n s i t ya n ds a l i n i t y ) i n f l u e n c ec h l o r e l l aa u t o t r o p h i ct r a i n i n ge n v i r o n m e n tf a c t o r sw e r e e x p l o r e d e x p e r i m e n t sw i t hc h l o r e l l ao fb i o m a s s ，g r o w t hr a t e ，g e n e r a t i o nt i m e ，c e l ld e n s i t y f o ri n d e x ，d e t e r m i n e dt h eb e s tc u l t i v a t i o nc o n d i t i o n i no p t i m i z i n gc u l t i v a t i o nc o n d i t i o n ， s i xs t r a i n sc h l o r e l l ar e s p e c t i v e l yt h eb i o m a s s1 2d a y s0 4 2 5 、0 3 8 8 、0 2 7 5 、0 2 9 8 10 3 2 7 、 o 3 0 3 9 l ， u s i n gt h em e t h o do fe t h y l p e t r o l e u me t h e rc h l o r e l l ap r o d u c to fp o l y u n s a t u r a t e df a t t y a c i d s ，u s es o d aa c i d e x t r a c t i o nm e t h o do fc o m b i n a t i o n o fm e t h y l p r e t r e a t m e n t p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s t h i sa r t i c l et h r o u g hd e s i g nl 9 ( 3 4 ) o r t h o g o n a le x p e r i m e n t ( p k o h m e t h a n o l ，s a p o n i f i c a t i o nt i m e ，ph 2 s 0 4 a r m o u r ，e s t e r i f i c a t i o nt i m e ) a n ds i n g l ef a c t o r e x p e r i m e n to p t i m i z a t i o no fp r e t r e a t m e n tc o n d i t i o n s u l t i m a t e l y d e t e r m i n et h eo p t i m a l c o n d i t i o n so ft h es a m p l ep r e t r e a t m e n ti spk o h m e t h a n o la s0 5m o i l ，s a p o n i f i c a t i o nt i m ef o r 10 m i nph 2 s 0 4 m c t h a n o l ，i s5 ，e s t e r i f i c a t i o nt i m ef o r8 m i n t h er s di nt h ed e t e r m i n a t i o n p r o c e s si s0 7 一3 1 s i xs t r a i n sc h l o r e l l ap o w d e rb ye t h e r p e t r o l e u me t h e re x t r a c ta n d e l e c t r o l y z i n gp r o c e s so f m e t h y li sp r e v e n t e d t h er e c o v e r y5 5 5 一8 2 7 t h i sp a p e re s t a b l i s h e dt h e p o l y u n s a t u r a t e df a t t y a c i d sg c m sq u a l i m t i v ea n d q u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o nm e t h o d s b yg c m sp r e l i m i n a r ya n a l y s i so ft h es a m p l et o d e t e r m i n ep r o d u c ti sm a i n l yk e l pp o w d e rc 1 6 h 3 0 0 2 ，c 1 8 h 3 6 0 2c 1 8 h 3 2 0 2a n dc i s h 3 0 0 z ，i t s o u to f p e a kt i m ei nt u r n15 9 5 ，r e s p e c t i v e l y2 0 2 4 ，2 0 4 5a n d2 1 0 0 t h r o u g hc o n v e r s i o ni sp r e v e n t e d t h er e c o v e r y ，s i xs t r a i n sc h l o r e l l ap o w d e rk i n do f p u f a sr e s p e c t i v e l yt h ea c t u a lp r o d u c t i o n10 6 6m g ga l g a ep o w d e r ，2 0 5 2m g gk e l p it p o w d e r ，10 7 2m g gk e l pp o w d e r ，1 1 6 4m g gs e a w e e dp o w d e r ，2 6 0 5m g gk e l pp o w d e r a n d12 8 4 m g gk e l pp o w d e r e a c hg r a m sc 1 6 h 3 0 0 2c o n t e n ti na l g a ep o w d e rd r yf o rw l z 1 4a l g a es t r a i n st h eh i g h e s t ( 8 0 3 m g ) ；t h eh i g h e s tc i 8 h 3 6 0 2c o n t e n tf o r4 0a l g a es t r a i n s ( 4 51m g ) ；t h eh i g h e s tc 1 8 h 3 2 0 2c o n t e n tf o r4 0a l g a es t r a i n s ( 6 9 1m g ) ；t h eh i g h e s t c 1 8 h 3 0 0 2c o n t e n tf o r2 7 0a l g a es t r a i n s ( 8 4 7m g ) k e yw o r d s ：c h l o r e l l a , o r t h o g o n a le x p e r i m e n t ，a u t o t r o p h i c c u l t i v a t e ，t h e u n s a t u r a t e df a t t ya c i d i i i 目录 第一章绪论1 1 1 小球藻的概述1 1 1 1小球藻的发现1 1 1 2 小球藻的生物学特性与分布1 1 2 小球藻的自养培养方式2 1 2 1 开放式池塘自养培养系统2 1 2 2 密闭式池塘自养培养系统3 1 2 3 密闭式光生物反应器3 1 3 小球藻产物的研究现状与应用5 1 3 1 利用微藻制备生物燃料5 1 3 2 利用微藻培生产不饱和脂肪酸7 1 3 3 小球藻的营养保健1 0 1 3 4 小球藻的药用价值1 0 1 4 本论文的研究目的与意义1 1 1 5 本论文的研究内容与研究方案1 1 第二章实验材料与方法1 4 2 1 实验材料1 4 2 1 1 实验藻株1 4 2 ，1 。2 实验药品及试剂1 4 2 1 3 实验设备15 2 2 实验方法16 2 2 1 藻株的分离与纯化1 6 2 2 2 藻株的培养与藻体的收集1 8 2 2 3 培养基的选择1 8 2 2 4 生物量测定方法2 0 2 2 5设计l 9 ( 3 4 ) 正交试验及单因素实验优化培养条件2 1 第三章结果与讨论2 5 3 1 培养基的确定2 5 3 2 自养培养条件优化结果2 6 3 。1 。1 藻株1 0 6 8 培养条件的优化结果2 6 3 1 2 藻株2 7 0 培养条件的优化结果3 3 3 1 3藻株4 0 培养条件的优化结果3 8 i v 3 1 4 w l z 8 藻株培养条件的优化结果4 3 3 1 5 w l z 1 4 藻株培养条件的优化结果4 7 3 1 6w l z 2 4 藻株培养条件的优化结果5 2 3 1 7 本节小结5 8 3 3 培养物干燥获取藻粉5 8 3 4 脂肪酸的提取与预处理5 9 3 4 1 脂肪酸的提取5 9 3 4 2 脂肪酸产物的预处理5 9 3 4 3 设计l 9 ( 3 4 ) 正交试验优化产物预处理方法6 0 3 5 g c m s 、f i d g c 测定脂肪酸6 1 3 5 1 测定方法的建立6 1 3 5 2 目标产物的确定6 2 3 5 3 预处理方法的确定与优化结果6 4 3 5 4 实验所用标准曲线6 9 3 5 5 测定结果7 0 3 5 6 本节小结7 4 第四章结论与建议7 6 4 1 结论7 6 4 2 建议7 7 参考文献7 8 v 张正洁：小球藻的自养培养及其产物中多不饱和脂肪酸的研究 1 1 小球藻的概述 1 1 1 小球藻的发现 第一章绪论 1 8 9 0 年，荷兰生物学家b e i j e r i n e k 首先在琼脂平板上成功分离得到一种叫做小球 藻( c h l o r e l l a ) 的纯培养物。1 9 1 9 年，另一科学家o t t ow a r b u r g 将这一纯培养物在实验室 里作为研究植物生理学的工具。研究表明，小球藻不仅能连续快速生长，光能利用率 高，生长受季节影响较小，且藻体内富含蛋白质、不饱和脂肪酸( 亚油酸、亚麻酸、 d h a 、e p a 等) 、类胡萝卜素、虾青素和多种维生素，具有极高的营养价值和提高免 疫力的功效，因此被生物学家广泛用于自养营养的研究。 1 1 2 小球藻的生物学特性与分布 小球藻为绿藻门( c h l o r o p h y t a ) 小球藻属( c h l o r e l l a ) 的一种单细胞绿藻。细胞 形态以椭圆形或圆形为主，细胞直径2 1 2 u r n ，具有一个色素体，周生，呈杯状或片 ：扶；大多数种类的小球藻具有一个蛋白核；以孢子形式进行无性繁殖，母细胞一般连 续2 次或3 次有丝分裂，形成4 、8 或1 6 个似亲孢子，母细胞破裂，似亲孢子离开母 细胞长成营养细胞。 小球藻在自然界生态分布极广，在海洋、湖泊、沟渠、池塘中均可生长繁殖，其 中以淡水种类居多，多数种类在温暖地区的春秋雨季大量出现，春夏之交繁殖最为旺 盛。小球藻对温度的适应能力很强，3 9 高温和一2 低温均有良好的生长品系。现有 世界上已知的小球藻有1 5 种左右，加：之其变种可达百种之多【2 j 。我国常见的种类有 普通小球藻( c h l o r e l l av l g a r i s ) ( 如图1 。1 所示) 、蛋白核小球藻( o h p y r e n o i d o s a ) ( 如 图1 2 示) 和椭圆小球藻( c h e l l i p s o i d e a ) ( 如图1 3 所示) 。 图1 1 普通小球藻 图1 2 蛋白核小球藻 张正洁：小球藻的白养培养及其产物中多不饱和脂肪酸的研究 图1 3 椭圆小球藻 由于小球藻生态分布广，易于培养，生长速度快，且营养丰富等特点，美国、日 本、以色列等国家先后开发出现代化n t l , j , 球藻培养技术并成为小球藻的主要生产国。 目前该领域在我国研究较少。国内开展此项工作，其经济效益和社会效益前景广洲3 1 。 1 2 小球藻的自养培养方式 1 2 1 开放式池塘自养培养系统 开放式池塘培养系统( o p e np o n dc u l t u r es y s t e m ) 是最古老、最简单的藻类培养体 系，包括天然池塘和人工池塘两种型式。天然池塘培养系统主要利用大型天然池塘对 藻类进行培养且不加任何特殊装置；人工池塘培养系统主要在天然池塘地基础上加以 改造，例如附加搅拌、二氧化碳控制等装置。开放式池塘培养系统作为最古老的微藻 培养反应器一直沿用至今，变化之处主要有以下两点1 4 1 ：一是对其混合系统进行过一 些改进；二是利用传感器和计算机实现过程参数的在线检测和工艺优化。 开放式池塘培养系统具有构建简单、成本低廉及操作简便等特点，现已普遍应用 于商业化大规模微藻培养中【5j 。其中最：典型且最常用的当数o s w a l d 设计的跑道池反应 器( r a c e w a yp h o t o b i o r e a c c o r ) i6 | 。该类培养系统占地面积为1 0 0 0 5 0 0 0 m 2 ，培养液深度 为1 5 c m f j 9 环形浅池( 如图1 4 所示) 。以自然光为光源、热源，通过叶轮转动的方式将 池内培养液进行混合与循环，防止藻体沉淀并提高光能利用率。目前大规模生产微藻 的公司( 如：c y a n o t e c h ，e a r t h r i s ef a r m s 等) 均采用此方式对微藻进行培养。 卜口v 嚏f _ dp 矗d d 蛔w h 叫 图1 4 跑道式生物反应器 2 张正洁：小球藻的自养培养及其产物中多不饱和脂肪酸的研究 这类反应器的优点在于成本低、建造容易；缺点在于：( 1 ) 培养效率低。光合效 率约为1 ，而微藻的光合效率最大可达2 0 左右；培养液中生物量浓度很低( 一般为 o 1 9 l 左右) ，( 2 ) 光照强度、温度、p h 值等培养条件无法控制。( 3 ) 易被真菌、原生动 物和其他藻种污染。( 4 ) 反应器中水分蒸发量大，造成培养基浓度增大，培养过程不 稳定。( 5 ) 生产期短，生产受地域及季节等自然条件限制。( 6 ) 池塘系统生产力低， 藻密度较小，藻体收集成本高1 7 j 。由于存在以上缺点，开放式池塘培养系统已严重地 制约了微藻工业的发展。 1 2 2 密闭式池塘自养培养系统 密闭式池塘培养系统解决了开放式池塘培养系统中c 0 2 供应不足、水分蒸发损 失过快、温度无法控制以及容易污染等缺陷。其中简单的一种形式就是在开放式池塘 上加一个透明的盖子，但在加盖以后会因盖上沾有灰尘导致光照不足的现象发生，影 响光合效率，因此这种密闭式池塘系统也无法完全克服上述缺陷。 1 2 3 密闭式光生物反应器 密闭式光生物反应器在密闭式池塘培养系统的基础上装配了c 0 2 供应、温度、光 照等控制系统，从而克服了池塘系统存在的缺陷。同池塘自养培养系统比较，其优势 在于：( 1 ) 实现无菌培养，避免污染。( 2 ) 具备二氧化碳供应及气体交换系统，有利 于藻细胞的生长代谢。( 3 ) 培养条件易于控制，对微藻代谢产物的大量积累非常有利。 ( 4 ) 细胞浓度高，每升可达几克( 比敞开式跑道池中的细胞浓度高出近百倍) ，这给 采收带来了很大的方便。后加工处理费用低。( 5 ) 避免水分蒸发，减少用水量。 基于上述优点密闭式光生物反应器引起了国内外的高度重视，近年来召开的几次 国际会议均强调密闭式光生物反应器开发的重要性。人们甚至认为微藻工业的发展潜 力取决于密闭式光生物反应器技术的发展。针对密闭式光生物反应器的开发已有近2 0 年代的历史，直到9 0 年代以来，才涌现出大量有关密闭式光生物反应器的专利。目前， 主要密闭式光生物反应器有：平板式、管式、柱式、搅拌式发酵罐、浮式薄膜袋等。 1 2 3 1 平板式光生物反应器 平板式光生物反应器于1 9 8 6 年由r a m o sd eo r t e g a - 等i s l 首次开发问世。此反应器液 层薄，光程短，具有光利用率高的特点，适合放大培养，且容易清洗反应器内壁上贴 壁生长的藻体污垢，内部结构相对简单，可以随时调节放置角度以获得最佳的光照强 度，得到较高密度的藻体，实现高密度高产培养。 许波、王长海【9 】在国内首次利用平板式光生物反应器对能合成高度不饱和脂肪酸 花生四烯酸的淡水微藻p a f i e m c h l o r i si n c i s e 进行了高密度培养研究。藻细胞培养密 度达到5 1 5 9 l ；单位体积和面积的细胞生物量产率分别提高到0 7 3 9 l d 和 3 张正洁：小球藻的白养培养及其产物中多不饱和脂肪酸的研究 7 0 1 9 m 2 - d 。 s r c h a e 等o j 设计出可自动调节光暗周期的l 一型平板式光生物反应器，以太阳 光为光源，其构造由上、下两部分组成，上部为受光区域，下部为暗区域。上、下部 分中间用一刮刀片构成培养基光暗区域的内循环。这种反应器有效地减少了藻细胞间 的遮挡作用。 1 2 3 2 管式光生物反应器 管式光生物反应器出现于上世纪5 ( ) 年代( d a v i s ，t a m i y a ，1 9 5 3 ) ，通常采用透明且直 径较小的玻璃、有机玻璃管弯曲成不同形状( 如图1 5 所示) 。利用外部光源可透过 透明管道的方式以实现藻类生产繁殖。由于密封管道系统容易与其它加工设备配套， 因此可用泵把管道内的藻体传递到下道工序，因而整个过程可以实现自动化。 p i r t 等j 建立起管径l c m 的光生物反应器的设计和操作理论及计算机控制装置， 在此基础上，t o r z i l l o 等1 2 1 设计出双层管道式反应器。l e e y k 等针对提高光能利用 率的问题，对管道进行改造，采用螺旋盘管式反应器，且作出大量基础工作及应用研 究。 近年来较为典型的管式光生物反应器的应用主要是f g a c i e nf e m a n d e z 等采用的 气升式管式光生物反应器【1 4 j 以及g a c i e nf e r n a n d e z 采用的螺旋盘绕管式光生物反应 器【l5 j 在诸多的封闭式光生物反应器中，管状光生物反应器发展最快，其可靠性，有效 性和低成本日益引起人们的重视。 图1 5 管式光生物反脞器 1 2 3 3 柱式光生物反应器 柱状气升式反应器由外桶和内桶组成主体结构，藻液借助气流传动在内外筒间循 环，提高微藻光能利用率和传质效率，：畦免由于光合作用放氧造成的培养液中溶解氧 过饱和。张栩等研制出1 0 0 l 夕b 照光内导流气升式藻类光生物反应器以及二氧化碳 配气装置。并根据微藻培养的特点和要求，对反应器的结构进行了改进，以小球藻 ( c h l o r e l l as p ) 9 0 5 4 为材料，进行了培养实验。实验结果显示小球藻的平均产量达到 4 张正洁：小球藻的自养培养及其产物中多不饱和脂肪酸的研究 2 9 3 9 4 9 ( m x d 1 。 1 3 小球藻产物的研究现状与应用 1 3 1利用微藻制备生物燃料 自1 8 世纪产业革命以来，世界正以惊人的速度消耗着各种矿物能源，近一个世 纪消耗的能源几乎等于过去1 9 个世纪所消耗能源的一半，有人预测当世界人口达6 3 亿时能源消耗将达到每年3 1 l 亿吨标准煤。【1 7 j 一些欧美国家把目光投在了新能源即生物质燃料的身上，其生产的“第一代”生物 燃料均源自玉米，油菜籽及大豆等农产品，为缓减对农业造成的压力，当前一些大型 能源公司及生产企业开始把精力转向利用非食用原料一藻类开发第二代生物燃料 1 8 】。经研究证明，微藻制备生物燃料年产量可达到1 8 5 0 加仑英亩1 9 1 。如图1 6 所示， 微藻年每年产出的生物柴油远高于其他农作物。且优点在于：生长速度惊人，比其 他植物快4 0 倍；微藻可大量养殖于天然水体中，不与传统农业争地；微藻油脂比 陆生植物产量高；生物柴油不含硫，且生物柴油泄漏到环境中，可被微生物降解， 不会污染环境。据s a n d i a 国家实验室技术专家佩特称，每公顷藻类所炼出的油比同等 面积农产品炼出的油所产生的能量要高l o 1 0 0 倍。这也正是原先对利用藻类炼油持 质疑态度的一些大型生产企业也要挤身开发藻油的原因。 1 5 0 0 1 0 0 0 5 0 0 0 ， 1 8 5 i 6 3 5 ，5 盟竖翟ii _ 玉米花生红花向日葵油菜籽棕榈油 微藻 图1 6 各种来源的生物能源年产量比较 目前国内外对微藻脂肪酸进行了大量研究，但报道较多的是小球藻( c h l o r e l l a s p ) 、球等鞭金藻( i s o c h r y s i sg a l b a n a ) 、三角褐指藻( p h a e o d a c t y l u m t r i c o m u t u m ) 等。这 些微藻以阳光为能源，以水、二氧化碳和简单的无机元素为原料进行光合作用，所产 生的油脂通过酯化后可转变为生物柴油( 脂肪酸甲酯等) ，提取油脂后的藻渣可以综合 利用，生产动物饲料、有机肥料和甲烷( 如图1 7 所示) 。美国国家可再生能源实验室 r e l ) 的报告指出，微藻油脂生产可能是生物柴油产业和生物经济的重要研究方向。 张正洁：小球藻的自养培养及其产物中多不饱和脂肪酸的研究 图1 7 利用微藻生产生物质的综合利用工艺 早在1 9 7 8 年，美国能源部可再生能源国家实验室( t h en a t i o n a lr e n e w a b l ee n e r g y l a b o r a t o r y ，n r e l ) 开始养殖微藻生产生 物燃料项目( a q u a t i cs p i c e sp r o g r a m ，a s p ) 的研 究，研究内容涉及微藻筛选、微藻生化机理分析、工程微藻制备到中试。经过一年的 中式运行，可获得高达0 0 5 k g ( m 2 d ) 的工程微藻，含油量达到4 0 - - 6 0 。川该项目 大大推动了微藻可再生能源的研究与开发。 2 1 世纪以后，石油价格迅速飙升，国际原油价格己高达1 0 0 1 4 0 美元桶，因此 对微藻的研究迅速繁荣起来，微藻生物柴油技术也取得了长足的进步。在美国、澳洲、 日本、西欧、印度和南非，无论是政府还是企业，都投入大量资金来进行产油微藻的 开发。 2 0 0 2 年，美国圣地亚国家实验室利用分子生物学工程技术，大量研究了微藻细胞 含油量和产量情况，制取出油脂含量丰富，可生产生物燃料的藻油。经研究发现，只 需美国土地面积的o 3 就可生产出满足全美国所需的运输燃料【2 。 除众多研究机构外，许多生物燃料公司也跻身于利用微藻提取生物柴油的领域 中。 美国s a p p h i r e 公司于2 0 0 8 年投资l 亿美元开展养殖海藻生产生物燃料的研究，该公 司通过利用阳光、二氧化碳和光合海藻的工艺开发出辛烷值达9 l 的“绿色”汽油，显示 出微藻汽油与第一代生物乙醇相比的优势所在。【2 2 j 2 0 0 8 年，美国可再生能源集团( r e o ) 宣布该公司己拥有炼制和生产大量高质量的 微藻生物柴油的商业化技术。且该微藻生物柴油产品的质量己超过a s t md 6 7 5 1 和e n 1 4 2 1 4 m 标准。该公司计划采用专有预处理技术对粗藻油进行净化和精制，然后利用 与目前商业规模生物柴油生产过程相似的系统，使之转化为生物柴油。【2 纠 作为石油巨头的壳牌公司也投身二j 二养殖微藻生产生物柴油的研究开发中，并与 h r 生物石油公司计划2 年内建成一个利用藻类生产生物柴油的公司c e l l a n a ，已于2 0 0 7 年在夏威夷正式启动研究工程。公司决定先试建一个占地2 5h m 2 的实验基地作为微 6 张正洁：小球藻的自养培养及其产物中多不饱和脂肪酸的研究 藻养殖场所，随后达到占地1 0 0 0 h m 2 的商业生产规模，最终建成占地2 万公顷的商业化 生物柴油生产基地。壳牌公司预计每公顷面积藻类可年产柴油6 0 吨( 是每公顷麻风树 果产油量的1 5 f 音) ，即年总产量可达1 2 0 万吨。【2 4 】 1 3 2 利用微藻培生产不饱和脂肪酸 脂肪是生物体能量的来源以及能量贮存物质，也是身体组织的重要组成成分。脂 肪酸是组成脂质的基本成分，分为饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸，其中脂肪的碳键上存在 两个或两个以上双键的脂肪酸成为多不饱和脂肪酸( p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s ，简称 p u f a ) ，根据碳分子间双键的位置，可分为c o 一3 、( t o 6 及( 0 9 不饱和脂肪酸，主要包 括油酸( l a ) 、亚油酸( c l a ) 、1 ，亚麻酸( g l a ) 、0 【一亚麻酸( a l a ) 、二十碳五烯酸 ( e p a ) 、二十二碳六烯酸( d h a ) 等( 其分子结构图如图1 8 所示) 目前，全球已知的藻类约有3 万余：仲，其中由于小球藻的不饱和脂肪酸在脂质中 的比例较大而广泛的用于大规模批量培养用以生产不饱和脂肪酸。 o o c 【麻酸 o h 二十二碳六烯酸( d h a )二十碳五烯酸( e p a ) 图1 8 几种多不饱和脂肪酸的分予结构图 1 3 2 1不饱和脂肪酸的合成 脂肪酸的合成主要通过乙酰辅酶a 羧化酶和脂肪酸合成酶两个酶系的反应进行。 在脂肪酸的合成过程中，乙酰辅酶a 是指脂肪酸合成的引物，在碳链的延长过程中， 需要丙二酸单酰辅酶a 参加，酶的作用底物是乙酰一a c p 和丙二酸单酰一a c p ，经过多 步反应形成c 1 6 一c 1 8 脂肪酸硫脂。在微藻细胞中，脂肪酸合成的前体如油酸、亚油 酸和亚麻酸的合成途径与高等植物和酵母细胞相似。 2 5 填不饱和脂肪酸的主要合成途 径有两条，一是厌氧过程，双键先在中等链长度的脂肪酸上形成，然后进行链的延长 反映；另一种是有氧过程，即饱和脂肪酸的去饱和过程在氧分子、n a d h 和n a d p h 存在的条件下进行。 p u f a s 可通过摄入的油酸或亚油酸经代谢途经转化而来( 如图1 9 所示l 2 6 j ) 。经 过一系列碳链的增长和脱氢作用，按顺序交替增加一个双键和2 个碳原子，分别逐步 v j h 0 酸 油 八 张正洁：小球藻的自养培养及其产物中多不饱和脂肪酸的研究 转化为e p a 和d h a 。 油酸1 8 ：l ( 9 ) 一2 h 土去饱和 亚油酸1 8 ：2 ( c o - 6 ) 乏h 去饱杂 18 ：3 ( ( o 6 汁一亚麻酸 踟上 2 0 ：3 ( t o 6 ) 双高r 一亚麻酸 2 h 上 2 0 ：4 ( o ) 一6 ，一 优上 2 2 ：4 ( 0 ) 6 ) 肾上腺酸 2 h 上 2 2 ：5 ( 心6 ) 二十二碳五烯酸 1 8 ：3 ( ( o - 3 ) a - - - 亚麻酸 1 l + 2 c 2 0 ：3 ( o ) 一3 ) 二十碳三烯酸 j 2 h 2 0 ：4 ( 0 ) - 3 ) - - 十碳四烯酸 _ 2 h 2 0 ：5 ( t o 一3 ) - - 十碳五烯酸( e p a ) 上+ 2 c 2 2 ：5 ( o ) 一3 ) 二十二碳五烯酸 2 2 ：6 ( 0 ) - 3 ) 二十二碳六烯酸( d h a ) 图1 9以亚油酸、亚麻酸为前体的多不饱和脂肪酸的合成途径 1 3 2 2 不饱和脂肪酸的生理功能 p u f a s 在人类生命与健康中的重要生理作用己被广泛的研究与报道。2 0 世纪5 0 年代以来，关于膳食中脂肪和胆固醇含量与冠心病发病率之间的关系一直是争论的焦 点。当人体摄入高熔点的饱和脂肪酸( s f a ) 的含量过高时，所形成的s f a 胆固醇酯 熔点高，不易乳化也不易在动脉血管中流动，因此易形成沉淀物沉积在动脉血管壁， 久而久之便发展为动脉硬化。相反，人体摄入富含p u f a s 的油脂，由于p a f u s 熔点低， 所形成的p u f a s 胆固醇酯熔点低，易于乳化、输送和代谢，因此不易在动脉血管壁上 积集沉淀而诱发硬化症和冠心病。 在天然存在的p u f a s 中，亚油酸、亚麻酸等是人体不能自行合成或合成量不够使 用而必须从食物中摄取，因此又被称作为必需脂肪酸。必需脂肪酸是维持人体正常和 正常生理功能所必需的，人体缺乏必需脂肪酸就会出现生长停滞、肾功能衰退等症状， 尤其是中枢神经系统、视网膜和血小板功能异常。 经研究表明，亚油酸、亚麻酸等不饱和脂肪酸可显著降低血液中总胆固醇，非高 密脂蛋白胆固醇及血清中甘三酯的含量，并减少动脉壁上脂质斑的形成与沉积，防止 动脉粥样硬化症的发生。不仅如此，这些不饱和脂肪酸通过提高肝细胞中胰岛素受体 的敏感性，使受损的葡萄糖耐受性恢复正常，从而达到糖尿病的防治。其中d h a 、 e p a 等高不饱和脂肪酸还具有健脑益智、改善视力的功效，俗称”脑黄金”。 8 张正洁：小球藻的自养培养及其产物中多不饱和脂肪酸的研究 1 3 2 3 不饱和脂肪酸的市场与应用 英国营养学会公布，成年人每天需摄入的不饱和脂肪酸量以1 0 1 5 9 为最佳。近 年来，国际上极为重视对多不饱和脂肪酸的研究与开发，尤其是针对3 系列多不饱 和脂肪酸。目前，世界上主要生产厂家主要集中在日本、美国，我国只有小规模的生 产。国内市场上添加有亚油酸、亚麻酸、d h a 、e p a 等不饱和脂肪酸的营养补充剂主 要来源于国外。 日本早在1 9 9 5 年对p u f a s 中d h a 的用量已高达7 0 0 t ，其销售值高达1 3 0 亿日元，每 千克原料( 约含d h a2 7 ) 价格约为8 0 0 0 日元。e p a 价格较d h a 更高，每千克原料 ( 约含e p a2 7 ) 价格达1 1 1 1 3 5 万日元。同年，日本委托日本健康和食品协会评审通 过了3 5 种“特定保健食品”原料，其中包括利用微藻制取的亚麻酸、e p a 、d h a 等。日 本1 9 9 6 年统计表明，其中小球藻食品与蜂王浆以6 0 0 亿日元并列成为当年日本健康食 品销售额第一位【27 | 。 一般认为，不饱和脂肪酸主要来源于鱼油，尤其是深海鱼油。且目前市场上销售的 基本都是从深海鱼油提炼而来。这种传统的获取不饱和脂肪酸的方法存在着一些问 题，具体体现在以下几点： ( 1 )无法保证p u f a s 产量的稳定性 研究显示，富含p u f a s 的主要部位位于鱼类眼窝附近的脂肪中【2 引。然而受捕 获季节、鱼的种类差异、气候条件以及地域差别等条件从而使鱼油脂肪的组成及 含量各有不同，最终无法保证鱼油的产量。 ( 2 ) 工艺复杂成本较高 在富含不饱和脂肪酸的同时，鱼油中也同样富含大量的胆固醇、脂溶性维生 素以及饱和脂肪酸。这些物质被人体摄入后无法通过代谢途径排出体外，从而贮 存在人体的脂肪中。当积累量过高时将会导致肾脏疾病等，对身体还将产生较大的副 作用。另外，鱼油中