（物理化学专业论文）电化学免疫传感器测定牛奶中残留青霉素的研究.pdf

首都师范大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取 得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰 写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：甸巳皿两 首都师范大学位论文授权使用声明 日期：砷年月l j 日 本人完全了解首都师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文 并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利 目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据 库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规 定。 学位论文作者签名： 都师范大学硕十学位论文 中文摘要 中文摘要 青霉素是一种高效广谱抗生素类药物，广泛应用于预防及治疗奶牛疾病。但是，由于 大量使用青霉素而造成在牛奶等动物源性食品中的残留已经严重影响到人们的身体健康 和进出口贸易。因此，青霉素残留的检测已经日益引起科学家的广泛关注。生物电化学传 感器是当前电化学和电分析化学十分活跃的研究领域，目前已经应用到生命科学、环境科 学、分析科学、材料科学等许多方面。由于其所特有的检测快速、灵敏度高、专一性强， 简单经济等优点，较之青霉素残留的传统检测方法，更有希望实现该类抗生素残留的现场 检测。本文研究了用不同修饰方法将青霉素酶或青霉素多克隆抗体固定化，以玻碳电极为 基底电极制备了酶传感器和免疫传感器，以电流为响应信号测定磷酸缓冲溶液和牛奶中的 残留青霉素。具体研究工作如下： l 、研究了电化学聚合亚甲蓝膜在不同酸度条件下氧化还原情况，得到酸催化反应活 化能e a 与酸度的关系，e a 随p h 值增大而增大，还原峰电流降低。同时由于聚合亚甲蓝膜 对h + 敏感，利用对青霉素酶催化青霉素水解产生青霉噻唑酸，用电化学聚合并静电吸附 青霉素酶制成电流型聚合亚甲蓝青霉素酶传感器。采用两种方法间接测定了青霉素含量： 电位在0 4 v 时，还原反应的计时电流值与青霉素浓度成正比，定量限0 0 5 i t g m l ；当电位 在0 6 o 6 v 时，其循环伏安的还原峰电流值与青霉素浓度成正比，定量限0 1 | _ t g m l ；并 应用到实际牛奶体系中，计时电流法与循环伏安法的定量限分别o 2 和0 4 i _ t g m l 。与电位 型传感器相比，电流型传感器比电位型传感器检出限降低，效果更好；与化学交联法电 流型传感器相比，制备方法简单、重现性高，为牛奶中青霉素检测提供了一种新方法。 2 、采用纳米二氧化钛( n 0 2 ) 固定辣根过氧化酶( h r p ) ，研究了h r p 在纳米t i 0 2 微粒、t i 0 2 纳米管修饰的玻碳( g c ) 电极表面上的直接电子转移行为，结果表明h r p 在t i 0 2 纳米管g c 电极表面比在纳米t i 0 2 微* 、2 g c 电极更能进行有效和稳定的直接电子转移反 应，且h r p 能保持对h 2 0 2 还原的生物电催化活性。初步研究h r p 标记抗体固定在砸0 2 纳米管g c 电极的直接电化学行为，为抗原抗体免疫反应信号的选择提供了参考依据。 3 、研究了面0 2 纳米管固定h r p 标记的青霉素多克隆抗体在玻碳电极上制备青霉素 免疫传感器。所制得的免疫传感器在磷酸盐缓冲溶液中表现出直接电化学行为。然后置于 含有青霉素抗原分子的磷酸盐缓冲溶液中进行培育，h r p 标记抗体与青霉素免疫结合形 成抗原抗体复合物，利用循环伏安法测定免疫结合后的h r p 直接电化学还原峰电流的降 低，从而测定出青霉素的浓度。在优化的实验条件下，样品中青霉素浓度在0 0 0 4 1 都师范大学硕1 学位论文 中文摘要 o 1 i j t g m l 与0 2 i o i t g m l 范围内与电流降低成两段线性关系，定量限为o 0 0 4 肛g m l 。 应用到牛奶实际体系中，青霉素在浓度为0 0 0 8 0 0 4 肛g m l 范围内，线性良好，定量限 o 0 0 8 1 a g m l ，比酶传感器的定量限下降了1 0 倍。该免疫传感器表现出较好的稳定性，为 牛奶中青霉素残留检测提供了一种新颖简便的方法。 关键词：青霉素残留，牛奶，生物电化学传感器，二氧化钛纳米管 首都师范丈学硕：l 学位论文a b s t r a c t a b s t r a c t p e n i c i l l i ni si nb e t a - l a c t a mf 锄m f l y nh a sab r o a ds p e c ：伽肌o fa n t i b a c t e r i a la c t i v i t ya n d c o m m o n l yu s e df o rp r o p h y l a c t i co tt h e r a p e u t i cp u r p o s ei nv e t e r i n a r ym e d i c i n e t h ep r e s e n c eo f p e n i c i l l i nr e s i d u e si nf o o do fa n i m a lo r i g i n ( m i l k , m e a t ) h a sas e r i o u si n f l u e n c eo nh e a l t ho ft h e p u b l i ca n dt r a d eo fi m p o r t sa n de x p o r t s e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r sh a v eb e e nt h em o s t b u r g e o n i n g a n do n eo ft h em o s tf l o u r i s hr e s e a r c hr & l h l l si nt h e e l e c t r o c h e m i s t r ya n d e l e c t r o a n a l y t i cc h e m i s t r y t h e yh a v eb e e nw i d e l ya p p l i e di nm a n yc a s e ss u c ha sl i f es c i e n c e ， e n v i r o n m e n t a ls c i e n c e , a n a l y t i cs c i e n c e , a n dm a t e r i a ls c i e n c e b e c a u s eo ft h em e r i t so f s p e e d i n e s s ，h i g hs e n s i t i v i t y , s p e c i f i c i t ya n de c o n o m y , e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r sc o u l db ea n a l t e r n a t i v et oc o m m o n l yu s e da s s a y s i nt h i sp a p e r , p e n i e i l l i n a s ea n dp e n i c i l l i na n t i b o d ya r e i m m o b i l i z e db yd i f f e r e n tm e t h o d so n 西a s sc a r b o ne l e c t r o d e st oc o n s t r u c te l l z y m eb i o s e n s o r sa n d i m m u n o b i s e n s o r s a tl a s tp e n i c i l l i ni sd e t e c t e di np h o s p h a t i cb u f f e rs o l u t i o n ( p b s ) a n dm i l kw i t h t h ec u r r e n ta sr e s p o n s i v es i g n a l s i nd e t a i l ，t h et h e s i si n c l u d e st h ef o l l o w i n gp a r t s ： p a r to n e , m e t h y l e n eb l u ei se l e c t r o c h e m i c a lp o l y m e r i z e do ng l a s sc a r b o ne l e c t r o d ea n dt h e p o l y m e r i z e dm e m b r a n e sa r es t u d i e db yc y c l i cv o l t a m m e r t r ya td i f f e r e n tp hv a l u e s a n dt h e c h a n g i n go f a c t i v a t i o ne n e r g yf r o mv a r i o u sp hv a l u e so ne l e c t r o d em o d i f i e dw i t hm bp o l y m e r f i l mi si n v e s t i g a t e d t h ep e n i e i l l i n a s ee l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o ri sm a d et h r o u g hp e u i c i l l i n a s e b ea b s o r b e di np o l y ( m e t h y l e n eb l u e ) m e m b r a n e s c h r o n o a m p e r o m e t r ya n dc y c l i c v o l t a m m e r t r ym e t h o d sa r eu s e dt od e t e c tp e n i c i l l i nr e s i d u e si np b sa n di nm i l k w h e nw o r k i n g p o t e n t i a li s 一0 4 v , t h ed e t e r m i n a t i o nl i m i tf o ru s i n gc h r o n o a m p e r o m e t r yi s0 0 5 r t g m li np b s a n d0 2 p g m li nm i l k w h e nw o r k i n g p o t e n t i a li s o 昏6 vf o ru s i n gc y c l i cv o l t a m m e r t r yi s o 1 i x g m li np b sa n d0 4 1 x g m li nm i l k u s i n gt h i sm e t h o d , t h ed e t e r m i n a t i o nl i m i ti sl o w e rt h a n p o t e n t i o m e t e re l e c t r o c h e m i c a lb i o s e u s o r sa n di m m o b i l i z e dm e t h o di ss i m p l e rt h a n g l u t a r a l d e h y d e - b o v i n es e l u ma l b u m i n t h ep r o p o s e dm e t h o dp r o v i d e san e vp r o m i s i n gw a yf o r t h ep e n i c i l l i nr e s i d u e sd e t e c t i o n p a r tt w o ，h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s ea n da n t i b o d yl a b e l e dh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s ei m m o b i l i z e d o nt h es u r f a c eo f n a n ot i t a n i u md i o x i d em o d i f i e sg l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e t h es t u d yi n d i c a t e s t h a th r po nn a n o t u b l et i 0 2 g ce l e c t r o d ec a l lg e n e r a t em o r ee f f e c t i v ea n ds t a b l ed i r e c te l e c t r o n t r a n s f e rr e a c t i o nt h a nn a n o p a r t i c l e st i o z g ce l e c t r e d e , m e a n w h i l eh r pm a i n t a i n st h e b i o a c t i v i t yt oh 2 0 2 a n dt h er e s e a r c ho f a n t i b o d yl a b e l e dh r pp r o v i d e sas e l e c t e ds i g n a lf o r a n t i b o d y - a n t i g e ui m m u n o a s s a y 1 一 首都师范大学硕士学位论文 a b s t r a c t p a r tt h r e e ，an o v e li m m u n o s e n s o rf o rt h ed e t e r m i n a t i o no f p e n i c i l l i ni sm a d eb y i m m o b i l i z a t i o no f h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) l a b d e dp e n i c i l l i na n f i b o d yo nn a n o t u b l et i 0 2 西a s sc a r b o ne l e c t r o d e s t h e i n c u b a t i o no f t h ei m m u n o s e n s o ri n0 1m o l lp b s ( p h7 o ) c o n t a i n i n gp e n i c i l l i na n t i g e nw a sa t t r i b u t e dt ot h ef o r m a t i o no f a n t i g e n a n t i b o d yc o m p l e x ，w h i c h b l o c k e dt h ee l e c t r o nt r a n s f e ro f h r pt o w a r dt h ee l e c t r o d ea n dr e s u l t e di ns i g n i f i c a n td e c r e a s eo f p e a kc u r r e n t u n d e ro p t i m ac o n d i t i o n s ，t h ed e c r e a s eo f t h e c u r r e n ti sp r o p o r t i o n a lt op e n i c i l l i n c o n c e n t r a t i o nr a n g i n gf r o mo 0 0 4t o0 1 i - l g m la n d0 2t o1 0 1 a g m l ；t h ed e t e r m i n a t i o nl i m i ti s o 0 0 4 1 a g m l t h ep e n i c i l l i ni m m u n o s e n s o rs h o w sag o o da c c u r a c ya n da na c c e p t a b l ep r e c i s i o n a n df a b r i c a t i o nr e p r o d u c i b i l i t y t h ep r o p o s e dm e t h o dp r o v i d e san e w p r o m i s i n gw a y f o rt h e p e n i c i l l i nr e s i d u e sd e t e c t i o n k e yw o r d s ：p e n i c i l l i nr e s i d u e s ，m i l le l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r s ，n a n o t u b l et i 0 2 4 首都师范大学顾。j 二学位论文 第一章绪论 第一章绪论 随着全球经济一体化和食品贸易国际化，一个全球重要的公共卫生问题一食品安全 已成为世界性的挑战。随着我国经济的快速发展，人民生活水平的不断提高，人们对食品 安全与卫生越来越重视，对无公害绿色食品的要求也越来越迫切，对奶及奶制品的需求量 也伴随着居民饮食结构的改变而逐年增加。然而，由于经济利益的驱使，抗生素在畜牧业 生产中的不合理应用越来越多，由此所产生的抗生素残留已经严重影响到人们的身体健 康。特别是加入w t o 以来，青霉素残留问题已经开始影响到我国的进出口和国家的经济利 益。所以，迫切需要建立灵敏度、准确度和精密度均符合要求的抗生素残留检测方法。 1 目前牛奶中残留青霉素检测的研究现状 1 1 牛奶中残留青霉素的现状 随着众多媒体对“有抗食品”、“有抗奶”的频频曝光，一时间社会上大有“谈抗色变” 之势。抗生素i l 】又称抗菌素，指由细菌、霉菌或其他微生物在生活过程中所产生的具有抗 病原体或其他活性的一类物质。我国是抗生素药物使用大国，对抗菌药物的应用也十分广 泛。但是，近年来随着经济利益的驱使和科学知识的不足，抗菌药物从广泛使用演变成过 量使用甚至滥用，严重威胁着人类健康。合理使用抗菌药物、加强抗菌药物的监督管理正 逐渐被全社会所关注。青霉素是兽药中最常使用的抗生素之一，主要用于预防和治疗奶牛 的乳腺炎，治疗尿道、胃肠道和呼吸道感染等。在我国奶制品中青霉素残留主要有以下几 个原因【2 - 3 】： 1 、预防和治疗畜禽疾病用药 以治疗和预防为目的，通过口服、注射、局部用药等方法给奶牛使用青霉素，以治疗 奶牛临床型、隐性型乳腺炎和子宫内膜炎等疾病。药物进入机体后通过乳腺管到达感染乳 区进行消炎。奶牛在接受这种治疗后，乳中的药物残留期可延缓到停药3 5 天后。如果 将正在接受治疗的奶牛分泌的牛奶挤入贮奶罐，或用药过量使得患病奶牛分泌含抗生素牛 奶的时间延长，均可能导致原料乳中抗生素超标。美国f d a 调查表明，用药不当是导致 牛奶中青霉素残留的主要原斟4 】。 2 、在食品保鲜中引入药物 有些养殖户为了谋取个人的经济利益，在高温季节为了防止牛奶酸败而在其中掺入青 首都师范人学硕十学位论文 第一章绪论 霉素或链霉素来抑制微生物的生长、繁殖。这样就造成不同程度的食品污染。 3 、不遵守休药期的规定 休药期是指畜禽停止给药到许可屠宰或它们的产品( 乳、蛋) 许可上市的间隔时间。 凡供给食品的动物的用药，均需规定休药期。休药期的规定不仅可以维护动物健康，更重 要的是能够减少或避免供人食用的动物组织或产品中残留药物超标。许多农户受经济利益 驱使，对泌乳期的奶牛用药，并且不遵守休药期的规定使牛奶中青霉素的残留量超标。 4 、滥用青霉素和饲料添加剂 兽药生产不规范、兽药制剂中不注明有效成分、随意扩大适用范围等，容易导致错误 用药、重复用药，增加药物残量。许多养殖户，畜禽一旦发病，大量投用青、链霉素，且 经常几种抗菌药物同时使用，或盲目加大用药剂量。这些在用药剂量、给药途径、用药部 位和用药动物的种类等方面不符合用药规定，造成药物残留。一些亚治疗剂量的抗生素被 用来作为生长促进剂，使用量提高，也造成了高水平的抗生素残留。 5 、饲料在加工、生产过程中受到污染 将盛过青、链霉素的容器用于贮藏饲料，或使用没有充分洗净的盛过药物的贮藏容器， 造成饲料加工过程中的抗生素污染。e g a n 5 1 调查表明，重复使用经抗生素治疗的乳牛用过 的挤乳器给正常乳牛挤乳，可使j 下常牛的乳中残留抗生素，他指出：挤乳是乳中抗生素残 留的另一个来源。 研究已经证实，牛奶中的抗生素十分稳定。奶中抗生素基本不受温度影响，不会在加 工过程中破坏和分解。牛奶在经过巴氏高温杀毒后，抗生素仅减少5 9 7 ，相当一部分抗 生素仍旧残留在牛奶中，这就形成了兽药残留。残留的青霉素就会对人体造成很大的危害 6 4 1 。 青霉素对人体的危害主要有：( 1 ) 奶中残留青霉素药物可使部分食用者发生过敏性反 应，轻者表现为荨麻疹、发热、关节肿痛等，严重时可出现过敏性休克，甚至危及生命。( 2 ) 经常食用低剂量药物残留的食品可使细菌产生耐药性，动物在经常反复摄入同一种抗菌药 物后，体内部分敏感菌株产生耐药性，成为耐药菌株。这些耐药菌株通过动物性食品进入 人体，当人体发生由这些耐药菌株引起的疾病时，就会给临床治疗带来一定的困难，甚至 延误j 下常的治疗过程。( 3 ) 长期饮用有青霉素残留的牛奶，使体内的有益菌群破坏，造成 消化道微生态环境紊乱，从而可能导致腹泻和引起维生素缺乏等，危害人体健康。 另外由于抗生素残留量超标，我国出口的畜产品多次遭到发达国家的退货、销毁，甚 至中断贸易往来。这不仅给我国出口贸易和农业生产造成巨大损失，更重要的是损害了我 首都师范大学硕士学位论文第一章绪论 国畜产品在国际上的声誉。例如：2 0 世纪9 0 年代初我国首先向日本出口肉鸡，因药物“克球 粉”残留超标，相继被退回，现在日本对中国进口肉鸡检疫越来越严格。1 9 9 8 年，欧盟国家 决定，继续保持对中国畜产出口的贸易禁运，虽然其中原因很多，但中国畜产品中的药物 残留是主要问题之一。欧盟2 0 0 2 年初开始全面禁止进口中国的虾、兔和家禽肉等动物源 性食品和水产品，导致2 0 0 2 年上半年中国水产品出口下降7 0 以上，仅浙江省2 0 0 2 年一季 度就因此减少农产品出口l 亿美元 9 1 。2 0 0 2 年l 7 月，中国对日本出口的活鳗同比下降2 3 ， 冻鸡下降4 1 。2 0 0 2 年1 月2 8 日，欧盟以氯霉素残留为由宣布全面禁止从中国进口动物源性 食品。此项“禁令”封杀了中国每年约7 亿美元的相关产品出口。从这些情况看，药残已成 为制约我国畜禽产品出口的重大问题。 随着社会的进步和人们对抗生素残留的日益重视，各国都制定了各种抗生素最高残留 限量( m a x i m u mr e s i d u el i m i t ，m r l ) 标准。在美国政府 1 0 。1 1 1 ，牛奶中青霉素类抗生素的 残留控制很严格。规定所有牛奶必须检测其中青霉素类抗生素的残留。青霉素g ，阿莫西 林、氨苄青霉素和邻氯青霉素的m r l 分别为5 “g l ，1 0 “班，l o p g l 和l o “g l 。欧盟【1 2 - 1 3 规定青霉素类抗生素在牛奶中的m r l 标准，见表1 1 。其中青霉素g 、阿莫西林和氨苄 青霉素为4 p l 。在我国为了尽量降低药品在乳品中的残留，杜绝其对人类健康的危害， 国家有关部门制定了许多相应的法律法规。最新发布的动物性食品中兽药最高残留限量 规定，牛，羊奶中青霉素的残留量不得超过4 1 x g k g ( p p b ) 。2 0 0 1 年l o 月，农业部发布实 施的无公害食品生鲜牛乳行业标准，对新鲜牛乳的卫生指标明确规定了“抗生素不得 检出”。但由于检测方法和条件的限制，对上述标准未能严格执行，致使我国畜产品中青 霉素残留问题一直未能得以解决，这就在客观上要求改进传统的检测方法，引进先进的检 测仪器，寻求一种快速精确的检测方法，使得检测结果更加准确可靠。 表1 1 欧盟食品中争内酰胺类抗生素的最高残留限量( i | t g k g ) b - 内酰胺类药物 肌肉 牛奶 氨苄青霉素( a m p i c i u i n ) 羟氨苄青霉素( a m o x i c i l l i n ) 苄青霉素( p e n i e i l l i n - g ) 苯唑青霉素( o x a c i l l i n ) 邻氯青霉素( c l o x a e i l l i n ) 双氯青霉素( d i c l o x a c i l l i n ) 乙氧萘青霉素( n a f c i l l i n ) 4 4 4 如 如 粥 如 如 如 姗 姗 姗 姗 首都师范人学硕l ：学位论文 第一章绪论 头孢匹林( c e f a p i r i n ) 头孢噻呋( e e f l i o f u r ) 5 0 1 0 0 0 6 0 1 0 0 表1 2 我国青霉素类药物在动物性食品中的晟高残留限量( ug k g ) 1 2 现有检测方法及存在的主要问题 抗生素检测技术种类很多，以技术原理分类大致可分为微生物检测方澍h 】、化学测定 法【1 5 】、免疫学测定法【1 6 1 。 、 1 2 1 微生物检测方法 微生物法是抗生素残留检测的传统方法濑4 定原理是根据抗生素对微生物生理机能、 代谢等抑制作用，来定性或定量检测样品中抗微生物药物的残留，包括t i c 法、纸片法 和管碟法等。t t c 法即2 3 5 氯化三苯四氮唑法，是目前我国食品卫生标准中规定的牛 乳中抗生素残留的检测方法( g b 5 4 0 9 8 5 ) 。常用的纸片法有枯草杆菌纸片法和嗜热脂肪杆 菌纸片检测法。这两种方法其操作过程基本相同，而选用的菌种不同。管碟法是由f o s t e r 和w o o dr u f f 两人于1 9 4 4 年创建，就是用含有敏感菌的琼脂做成平皿，上面放小管， 管中放已知抗生素标准液和未知试样液，经培养后，抗生素标准液周围琼脂不长细菌，即 为抑菌圈，如试样周围也出现抑菌圈表示含有抗生素，当时所用菌种为枯草杆菌。微生物 法样品处理简便，回收率高，不需要特殊仪器设备。吴瑕m 肄用管碟扩散法检测了牛乳 中青霉素g 残留量，并与1 r c 法相比较，得到满意结果。张可煜【l8 】用杯蝶法测定了猪和 鸡可食性组织中残留的氨苄青霉素。尽管微生物法在基层单位使用广泛，但该法的精确度、 准确度都不够高，且检测过程烦琐，耗时较长，不易筛选到敏感菌株，易受其它抗菌药物 首都师范大学硕十学位论文第一章绪论 的影响，不适应现场快速检测。 1 2 2 化学检测方法 抗生素残留的理化检测技术利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应或性质来测 定其含量，如高效液相色谱法( h p l c ) 【1 9 】、气相色谱法( g c ) 、质谱法( m s ) 、薄层色谱法 法( t l c ) 、联用技术( 常见的联用技术有t l c m s 、g c m s 、l c m s 、毛细管电泳法 ( c z e ) m s 、l c 核磁共振法( n m r ) ) 等等。王超 2 0 - 2 1 1 等用高效液相色谱柱前衍生法 测定了牛奶和猪肉中残留的青霉素g 、青霉素v 、苯唑青霉素、邻氯青霉素和双氯青霉素。 m o a t s 矧用自动在线痕量富集的方法对奶样进行净化，然后用高效液相色谱法测定了牛奶 中残留的氨苄青霉素和阿莫斯林。v e r d o n 等【2 3 】使用离子对反相高效液相色谱柱前衍生化 法测定了牛奶中苯唑青霉素、邻氯青霉素和双氯青霉素三种青霉素类药物残留，检测限可 达2 p l 。高效液相色谱法虽然具有较高的精确性、准确性和敏感性，但因其流程烦琐， 设备昂贵，需要专业技术人员，检测速度慢等原因，很难实现现场检测和普及推广，不能 满足社会对检测快速及时的要求。 1 2 3 免疫检测法 免疫分析法( i m m u n o 鹪s a y ，i a s ) 是以抗原与抗体的特异性可逆性结合反应为基础的 分析技术。非常适合于复杂基质中痕量组分的分离或检测，而且i a s 技术作为兽药残留 分析的检测手段能使分析过程，特别是前处理步骤大大简化，可以作为相对独立的快速检 测方法。包括酶免疫测定法嗍、荧光免疫测定法【捌、胶体金免疫测定法【2 6 1 ，s a m s o n o v az v 【矧等采用间接免疫法测定牛奶中氨苄青霉素的含量，检测范围1 0 “l l0 0 0 吲l ，检 测限5 0 l g l 。b e n i t o p c n a e e 2 7 1 等建立了荧光免疫测定p 内酰胺类抗生素残留的方法，对青 霉素的检测限为2 4 斗g l ，回收率为9 9 1 0 5 。但这种技术开发过程投入资金多，时 间长，样品前处理较复杂、难以定量，同样也很难实现现场检测，不能满足快速、无损伤 的检测要求。 总之，兽药残留分析是复杂混合物中微量或痕量组分的分析技术，既需要精细的微量 操作手段，又需要高灵敏的痕量检测技术，难度大、仪器化程度和分析成本高，分析质量 控制和分析策略( 如筛选性分析、确证性分析) 都有特殊要求。近年来，涌现出了许多新的 技术平台来完善现有检测方法的不足，生物传感器技术就是其中之一生物传感器是以固 9 首都师范大学硕士学位论文第一章绪论 定化的生物成分或生物体本身为敏感材料，与适当的化学换能器相结合，用于快速检测物 理、化学、生物量的新型器件。生物传感器与常规的化学及生物化学分析方法相比具有良 好的敏感性、准确性和特异性，易操作、价格便宜、方便、省时，精度高、便于利用计算 机收集和处理数据以及不会或很少损伤样品和造成污染，易于批量生产等优点，是一种新 型的检测技术。该项技术被列为迈向2 l 世纪五大医学检验技术之一，同时又是一种知识 密集、涉及多学科的综合性技术，是现代生物技术与物理学、化学等多学科、多领域相交 叉和结合的产物。从c l a r k 和l y o n s 最先提出生物传感器的设想距今已有4 0 多年。从2 0 世纪6 0 年代中期报道的最早的生物传感器一葡萄糖传感器至今，已有多种生物传感器 问世。2 0 世纪8 0 年代以来，由于不断采用新原理、新技术，生物传感器蓬勃发展，取得 了长足的进步。目前国外研制成功的传感器已有许多，如青霉素传感器，葡萄糖传感器， 谷胺酰胺传感器，谷胺酸传感器，检测有机磷残留的纤维光度传感器，检测普杀类除草剂 的免疫传感器，测定肉品新鲜度的酶传感器，检测黄曲霉素、甲醇、乙醇、硝酸盐、氨基 酸的传感器，测定d n a 和r n a 的光纤生物传感器等等。我国生物传感器的研究进展也 很快，目前，已有湿度传感器、测定土壤中水分的传感器、测定水中b o d 的传感器、测 定香蕉中草酸含量的组织传感器等( 2 8 1 。在上述各种生物传感器中，电化学生物传感器的 研究最为成熟，已有商品进入市场，如葡萄糖传感器。在青霉素检测方面，在线检测发酵 生产青霉素的生物电化学传感器的研究较多，而测定青霉素残留的生物电化学传感器的研 究相对较少，因此该项技术具有很大的丌发潜力。 2 生物电化学传感器 2 1 生物电化学传感器的发展 生物电化学传感器以生物材料作为敏感元件，电极作为转化元件，电势或电流等作为 特征检测信号。其中的生物材料包括了酶、抗原、抗体、激素等生物体成分和细胞、细胞 器、组织等生物体本身。由于生物材料作为敏感元器件使其具有高速选择性，这种传感器 已成为一种最直接的生命反应过程检测方法；且控制速度快、灵敏度高和使用简便并且不 破坏样品等特点则又使其特别适用于生物溶液和活体组织中某组分的连续监测。 早在1 9 6 2 年，c l a r k 在纽约自然科学学会的论文集中首次提出了“在化学电极的敏感 膜中加入酶以实现对目标物进行选择性分析”的设想。1 9 6 7 年，u p d i k e 等人把葡萄糖氧 化酶固定化膜和氧电极组装在一起，制成了第一代生物传感器。经过4 0 年地不断发展， 首都师范大学硕士学位论文第一章绪论 随着研究的深入，各种物理手段不断地被引入到生物传感器，当今的生物传感技术日新月 异。 早期的酶电极反应，主要是利用酶促反应的共反应剂或反应产物的电化学活性进行检 测，这种电极的缺点是工作电位高、背景电流大、易受其他物质干扰。为了克服上述缺点， 在酶电极中广泛应用着一种促进酶活性中心与电极表面之间电子转移的物质一介体 ( m e d i a t o r ) 。1 9 7 6 年，可溶性的六氰合铁酸盐首次被作为介体加入敏感膜中充当酶与电极 之问的电子传递剂，以提高传感器的性能。现在，介体己广泛应用于电流型酶电极制作中。 如c h e nlq 等j 研究了改进的葡萄糖氧化酶( g o d ) 传感器，添加聚赖氨酸等改进酶与电 极间的电子传递。信号明显，响应范围可以达到4 5x 1 0 - 3 m o l l 。v g g a v a l a s 3 0 】等利用多 孔碳电极有效改进酶传感器的稳定性，对酶的活性无影响，可以增加酶的吸附量。 1 9 8 4 年，t u r n e r 等人报道了用二茂铁及其衍生物作为氧化还原酶，并以此为基础发 展了能大规模生产具有高重现性酶电极的丝网印刷技术，该技术推动了生物传感器的发 展。2 0 世纪9 0 年代初，生物传感器的研究进入第二阶段，这时期的生物传感器称为第二 代生物传感器，其特点是引入电子介体，使响应信号更灵敏，响应速度更快速。2 l 世纪 发展的生物感器为第三代产品，随着微加工技术和纳米技术的进步，生物传感器不断地向 微型化、集成化方向发展f 3 2 】，便携式测试仪已得到快速发展。过去几年中，生物传感器 研发的方向有了显著变化，许多新的生物技术相继出现，如生物表达化学、表面定性、分 子标记以及纳米科技等，带动了生物传感器在各种环境下应用的增长。 当今，纳米材料在生物传感器中的应用，使其研究进入一个崭新阶段。纳米颗粒对酶 生物传感器的敏感性有增强作用，酶电极的性能是由酶的催化活性、酶活性中心和电极表 面之间电子交换速率决定的。纳米颗粒比表面积大、表面自由能高，吸附能力较强，使更 多的酶分子可以固定在纳米颗粒表面。另外，由于纳米颗粒尺寸很小，有可能与酶内部的 亲水基团发生作用，从而引起酶构型上的变化【3 3 】。这种变化使得酶的活性中心更接近底 物，提高了酶的催化效率。比如：纳米金a u 颗粒是电的良导体，具有很好的生物相容性， 而改性纳米s i 0 2 颗粒对生物分子又具有很好的选择吸附性0 4 1 。因此，可望实现纳米a u 和s i 0 2 颗粒与酶分子活性中心及电极表面之间的直接电化学作用，大大增强生物传感器 的灵敏度。 在生物传感器研究领域内，集纳米技术、生物技术和自组装方法于一体，实现具有 高酶活性的三维有序组装制备生物传感器的报道不多。从已有的一些报道来看，加入纳米 粒子后制备的生物传感器的灵敏度得到了很大提高。响应时间的缩短，检测线性范围的增 首都师范人学硕l 学位论文 第一章绪论 大，都表明了生物传感器性能的提高。国内外学者还对纳米颗粒增强葡萄糖氧化酶( g o d ) 生物传感裂3 5 1 开展了大量研究。结果表明：葡萄糖生物传感器具有选择性高、测试简便、 快速的特点，是检测葡萄糖浓度最常用的方法。人的血液和体液中含有许多干扰物质，通 过引入纳米颗粒，还可以改善葡萄糖传感器抗干扰性能。 2 0 世纪9 0 年代，我国生物传感器在研究与开发应用方面取得了非常大的进展，国内 许多高校与研究所，如长春应化所、清华大学、武汉大学、湖南大学、华东师大、浙江大 学、南京大学与复旦大学等在酶传感器、免疫传感器、d n a 化学修饰电极、生物芯片、 微生物传感器、组织传感器等领域进行了大量卓有成效的基础研究工作。第一代和第二代 传感器如葡萄糖传感器、氨基酸传感器、b o d 传感器已进入商品化阶段，并应用于分析 监测领域；对第三代传感器的探索性研究也十分踊跃，国家在政策、资金和管理上给予了 相当的扶持，大大促进了生物传感器的研究发展。 总之，生物电化学传感器由于其选择性高、操作简单、灵敏度高、响应时间短等优势， 越来越受到众多研究工作者的重视。随着人们对生物体认识的不断深入，随着各学科不断 地发展，生物传感器必将在各个领域发挥更大的作用。 2 2 生物电化学传感器的分类 生物电化学传感器根据生物敏感材料的不同，可分为酶传感、免疫传感器、电化学 d n a 传感器、微生物传感器以及动植物组织传感器等。其中，前三者更常见，它们的应 用尤其重要。 2 2 1 酶传惑器 酶传感器的反应原理是传感器的敏感膜中包含有固定化的酶，当酶与被测定的无机物 质或有机物质反应时，反应产物被传感器响应。目前已经报道的酶传感器有几百种，已商 品化的有十几种，如g o d ( 葡萄糖氧化酶) 电极传感器、l 乳酸单氧化酶电极传感器、 尿酸酶电极传感器、胆固醇传感器、生化需氧量( b o d ) 测定仪等。酶传感器目前投入使用 较少，这是因为自然界已经鉴定的2 5 0 0 多种酶大都不稳定，且难以提纯和固定，使其商 品化受到限制。为此，选择稳定的酶并采用合适的酶固定化方法，以及对相关酶电极反应 过程进行研究已成为酶电极研究的重点。 近期，i s a ok a r u b e 等总结了酶传感器在环境分析中的应用，并介绍了目前酶固定化 首都师范大学硕士学位论文 第一章绪论 研究的状况。d ij u n w e i 3 6 1 等将超氧化物歧化酶固定在 - p v a 溶胶凝胶薄膜，大大提高 了酶的响应速率以及固定酶的稳定性。穆绍林等用电化学方法将黄嘌呤氧化酶固定在聚苯 胺中制成的聚苯胺黄嘌呤氧化酶电极，具有快速的生物电化学响应和较高的稳定性。 b i l k o v a 【3 7 肄用高碘酸钠活化半乳糖氧化酶的糖链，并通过活化的糖链将半乳糖氧化酶定 向固定由于大分子底物容易接近酶的活性位点，因而催化动力学参数得到了改善。 e n r i q u e 等【3 8 1 研制了一种新型的微型酶传感器，用于检测中枢神经嘌呤的释放，其响应快、 稳定性好、检测灵敏度达2 0 0m a ( m o l l 伽) 。董飒英等【3 9 - 4 0 做了葡萄糖球菌肠毒素 c i ( s e c i ) 生物传感器的制备和电化学机理的研究，以期确定最佳制备条件。 2 2 2 免疫传感器 新近出现的免疫传感器是利用抗体对抗原的结合和识别功能将抗体或抗原与电极组 合而成的检测装置。利用抗体和抗原的特效性结合，检测膜上生成抗体和抗原复合物的电 位改变，从而获得不同的响应。目前已经制成的免疫电极有诊断原发性肝癌的甲胎蛋白 ( a f p 或a p f ) 免疫传感器、测定人血清蛋i 刍( h s a ) 的免疫传感器、胰岛素免疫传感器、诊 断早期妊娠的h c g 免疫传感器、i g g 免疫传感器以及胰岛素免疫传感器等。 西南大学袁若及其研究小组结合纳米技术【4 l l 、反电荷技术【4 2 1 、溶胶凝胶【4 3 1 技术研 制出了白喉、乙肝、风疹、脑膜炎等传染性疾病及甲胎蛋白、癌胚抗原肿瘤标志物生物传 感器并用于临床试验，已取得了显著成果，达到了国际先进水平。如将研制出的纳米金和 辣根过氧物酶修饰于金表面的电流型免疫传感器用于乙肝表面抗原的检测 4 t 】。他们首次 利用辣根过氧化物酶代替小牛血清( b s a ) ，封闭纳米金颗粒层上可能存在的活性位点， 阻止非特异性结合，同时可以放大抗原抗体反应信号。通过检测可知：其线性范围为 2 5 6 p g l - 5 6 3 2 肛班，最低检测量为o 8 5 1 t g l 由此可以看出：该传感器比用b s a 封闭 的传感器灵敏度更高，线性范围更宽。e p m e x l y a n t s c v a 4 4 1 等将含有胆碱脂酶的硝化纤维 膜固定在银电极表面中，利用戊二醛和正己烷将致病真菌( 硒c h o p h y t o nm b m r a ) 抗体连 接在纤维膜上从而制得用于检测致病真菌抗原的电流型免疫传感器。该传感器可稳定存放 至少3 5 天，最低检测量为1 0 肛g l ，免疫测定所需时间少于l o 分钟。z o n g d a i 4 5 l 等利用蒸 气沉积方法，将辣根过氧化物酶标记癌抗原1 2 5 ( c a - 1 2 5 ) 用二氧化钛固定在玻碳电极表 面，利用竞争机制，样品溶液中的c a 1 2 5 抗体限制了酶标c a 1 2 5 抗体与抗原结合的量， 从而用于检测c a - 1 2 5 。g z if u 等 4 6 1 将巯基乙胺( a e t ) 固定到金电极表面，进而化学 吸附纳米金颗粒，再将免疫球蛋白抗体( a n t i i g g ) 吸附在纳米金颗粒表面，从而制得高 首都师范大学硕十学位论文第一章绪论 灵敏电位型免疫传感器。通过循环伏安法和交流阻抗技术考察表明，裸金电极和纳米金组 装电极存在很大差异，其检出限为1 2 i _ t g l ，实验结果与e l i s a 实验结果相近。 2 2 3 电化学d n a 传感器 电化学d n a 生物传感器是近几年发展起来的一种全新的d n a 检测技术。它的原理 是利用固定在电极表面的某一特定序列的s s d n