（环境工程专业论文）影响剩余污泥减量细菌的实时定量pcr研究.pdf

摘要 剩余污泥如何达到零排放，一直是废水处理的一大难题，虽然一些新工艺的出现， 已经减少了剩余污泥的排放，但在运行过程中，并不能很好的控制污水中的细菌生长环 境。污泥中的菌群直接影响污水的处理效果，只有了解微生物群落多样性和动态性等信 息，才能提高对处理系统的控制能力。污水生物处理系统可视为一个适应了极端环境的 人工生态系统，如自然生态系统一样，它有自身的结构，生物的群落结构也有时空的变 化。 分子生物学技术的出现，使得在分子级别上进行生命现象研究得到了快速的发展。 应用实时定量p c r 法，建立污泥中部分功能性细菌及总细菌的标准曲线，从而得到它 们的数量。应用该方法来对剩余污泥减量起作用的一些特定细菌做动态分析。 本实验以生物砾间接触氧化工艺为基础，以分子生物技术为手段，以污泥中的细菌 为研究对象，利用实时定量p c r 技术来研究对剩余污泥减量起作用的一些功能性细菌 的定量分析。在实际工程中，通过适当的人为方式来改变反应器中一些细菌的相对数量， 改善反应器中内环境条件，最终达到污泥零排放的目的。 本实验选择生物砾间接触氧化反应器和普通活性污泥反应器做平行对比实验，通过 对比两种反应器中的细菌数量，来反映细菌在污泥减量中是如何起作用的。首先进行两 个反应器的启动、挂膜、正常运行，经过长时间的稳定运行，使出水水质稳定并达标( 污 水综合排放标准一级，g b 8 9 8 7 1 9 9 6 ) 。在运行期间，提取活性污泥和生物膜中细菌的 d n a 进行分子生物实验，并对其做动态定量分析。 关键词：实时定量p c r ；生物砾间接触氧化反应器；弯曲杆菌属；假单胞菌； 嗜水气单胞菌：纤发菌属；台湾热单胞菌 a b s t r a c t h o wt on o td i s c l l a i 翟触g 船e x c e s ss i u d g e ，w m c hi s 越w a y sam 萄o rp b l e mo fs e w a g e t r e 咖e n t ，a l t h o u 曲t l l e r ea r es o m en e wc r a 触，w ec o u l dn o tc o n 协o lt l l eb a c t e r i a ll l 毫岫i t a tw e l l 函曩鹅饿ee o 疆s eo f 哆e f a l 醴髓ob 粒l e 蠡a 址撒es k d 辨i 融p 裙to 拄m e 骶a 髓鼹le 懿c 圭o f 叁e w a s t e w a t e r ，w ec o u l di m p r o v et h ec o n n o lc a p a c i t yo ft t l e 讹a t m e n ts y s t e mb y1 l i i d e r s t a i l d i n g t h eb a c t e r i a ld i v e r s i t ya n dd y n a l l l i ci n f o n i l a t i o n t l l eb i o l o g i c a ls y s t e mo fw 嬲t e 戳l t c r 仃e a 衄e n t s y s 敏n e a nb ec o 芏l s i 矗r c da sa 薹l 硪i 蠡e 谢e c o s y s 宅i e m ，w 撼c h 瑟a p t e d 埝饿ee x 敷撒e e r i r o n m e n t ，j u s t l i k et l l en a t u r a l e c o s y s t e m s ，i th a si t so w ns 仇j c t u r e ，i t sb i o l o 百c a l e o 倒陵u 癍移s 讯l c t t 嚣ea l s o 吐a n g e s 遗t i m e 鞠ds p a c e 。 m 0 1 e c u l a rb i 0 1 0 9 yt e c h n o l o g ym a k e st h er c s e a r c h0 nt h ep h e n o m e n o no fl i f ed c v e l o p e d q u i c “yo nt h em o l e c u l e l e v e l a p p l i c a t i o no fr e a l t i i n eq u a n t i t a t i v ep c rm e t h o d ，w ec o u l d e s 洒l i 娥也es 镰毅如珥e 璀v eo fs 。獭e 董弧c l 沁雌lb 翁涮鑫翘d 搬el o t 醵b 獬e 矗鑫遮像es l u d g 奶 锄dg e tt h e i rq u a n t i t y u s i i 培m i sm e t l l o d ，w ec o u l dm 址a 由m a 戚ca n a l y s i st 0s 锄es p e c i f i c a l l y b a c l e a ，w h i c hm a k et h ee x c e s ss l u d g ed e m i n e f a l i z a t i o n 撬s 罐融n e n tb a s e do n 搬eg f a v e ic o n t a c t 蕊蛐妣h n o l o g y ，纽醢n gm o e e u i 甜 b i o t e c m l o l o g ya sam e t h o d ，t a 虹n gt l l eb a c t e d ai nm es l u d g ea s 也eo b j e c to fs t u d y ，a n d 嘲l 熊g 也ef e a l 堆璎e 唾雠瓣l i 重a 矗v ep c r 觚煽o l o g yl o 撵a k ea 掣鞠l i 缀i v e 鞠羹y s i s 醐s o 懋e f i u n c t i o n a lb a c t e r i aw h i c hm a k em ee x c e s ss l u d g ed e m i n e r a l i z a t i o n a p p l y i i l gs o m e 印p r 0 埘a t c h l m 姗a p p r o a c h e sd u r i i l gn l eo p e r a t i o no fm ep r o j e c tt 0c h a n g et l l e 佗l a t i v em l i l l b e ro fs o m eb a c 硎ai i lt h e f 黯e 溆谂i 翔移v e 穗e 魏a b 建o f b 硝c 羹羲l 髓耄e l ya e 毯e v e 德e 癸毽o o f 羹。耄纛i s c 蛔鹅遗g b 搬攫l 溺i 蕊鬈 s l u d g e 1 k se x p e r i m e n tc h o o s e l ec o n v e n t i o n a la c t i v a t e ds l u d g er e a c t o r 猫c o n t r a s to b j e c t ，i n o 砖髓谂糟蠢e c l 铂ew a yo fb a c 砥舔w o 越鹋i 毅l 沁s l 毽d g eb yc 藏纽塔l i 鹋b a c 誊e r 主越唾髓登l i 移o f t 、) i ，oa c t o r s f i r s to f 奎l ，船of e a c t o f ss 斌- u p ，l i n k e d 埝是l m ，o p e 斌越n o 嬲a l l y ，m 馓a ral o n gp 舐o d o fs t a _ b l e o p e r a t i o n ，m ew a t e rb e c a m es 协i i i t ya n dw a 衙q l 珞i i t ys 伽d 乏i r d s ( i l l t e g r a t e d w a s t e w a t e rd i s c h a 唱es t a n d a r d ，g b8 9 8 7 19 9 6 ) c a nb ea c m e v e d d u “n g l eo p e r a t i o n ， e x l 溆蕊g 妞d n ao f 龇b a c 碰舔i n 妞撕i v 蹴ds l u d g e 繇db i o 曩h 协如龇撵o l e 罐l 嚣 b i o l o g ye x p e r i m e n t s ，a n dm a i 【i n gad y n 枷ca n a l y s i st om e b a c t e r i a li i lt h es l u d g e x 黟w o 砖s ：r e a l 墙m eq u a n 螽饿i v ep c g 黻v e le o n 龇l 蕊蠡t i 强f e 酩幻r ；弼嘲搬溅岱够； ，强p 材d p m d 以础点p ；彳p 阳聊d 肘傩，l 咖，i 以口；五钙p 幻砌，投声p ；c a z d 切z d ，2 蝴 t 口 w q n e n s i s i i 独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究工作所取得 的成果。据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果。对本人的研究做出重要贡献麓个人和集体，均已在文中作了 明确的说明。本声明的法德结果由本人承担。 学位论文作者签名：丕盔荔 日期 学位论文使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：东 北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许 论文被查阅和借阅。本人授权东j 师范大学可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、 汇编本学位论文。同意将本学位论文收录到中国优秀博硕士学位论文全文数据库 ( 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社) 、中国学位论文全文数据库( 中国科学技 术信息研究所 等数据库中，并以电子出版物形式出版发行和提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密厩适用本授权书) 学位论文作者签名： 习期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 指导教师签名； 日 期： 电话： 邮编： 东j 艺师范大学硕士学位论文 芒l吉 了l茹麓 废水生物处理总是产生大量的剩余污泥，而污泥中的微生物群落结构的变化会带来 污泥处理性能的改变，趿此，了解污混内部的微生物群落缝构及相对数量的变化对剩余 污泥减量，提高废水处理效率具有重要的指导意义。生物砾闻接触氧纯工艺霹达到剩余 污泥零排放，且污水处理效果好，抗冲击畿力强，是一种有特广泛推广的污水处理新工 艺，毽冀污泥减量排放的机理虽可以雳一些传统的理论来解释，但还缺乏系统的理论体 系，所以本文通过实时定量p c r 技术，对生物砾闻接触氧化反应器内的生物膜、内泥 和活性污泥孛的缨菌徽动态熬分析，研究反应器沟的缨萤韵数量与憨数量的关系，进 步探讨该工艺的剩余污泥减量化的机理。所谓“实时定量p c r 即指在同一个密闭容器 中将p c 聚扩增反应的产物与荧光标记的探针结合在一起，避过监测荧光信号的变化实 现定量。“实时拶是攒在每一个p c r 循环蜃检测扩增产物，当p c r 扩增反应缝束磊，我 们可以得到每一个糕晶的p e r 扩增产物变化腩线。通过分析这些反应曲线，不但可以 褥到绷麓的定性检测结果，还可以对细菌的数量进行精确的定量。 东j 乏师范大学硕士学位论文 绪论 1 1 概述 一 活性污淀法是应用最广泛的污水生物处理技术，僚它一壹存在一个最大的弊端，裁 是会产生大基的剩余污混。目前，剩余污泥处理大都采用壤埋或焚烧，这些常规方法在 处理污泥的同时又会给环境带来新的负麟效应，此外，污泥处理的投姿和运行费用巨大， 可占整个污水厂投资及运行费用的2 5 6 5 u j ，已成为污水厂所筒临的沉重负担。污泥 减量技术正是在这一背景下提点熬。睽谓污泥减量技术，就是在僚证污水处理效渠麓前 提下，采用适当的措施使处理相蔺量的污水所产生的污泥量降低辩各种技术。污泥中的 菌群直接影响处理效果，只有了解微生物群落多样性和动态性等信息，才能提高对处理 系统的控制麓力。2 0 纪6 0 年代，分子生物学技术的出现，使得在分子级别上进行生命现 象研究得到了快速的发展【筋。一系列新技术方法的疲用，将环境微生物的研究从传统方 法提升到薪的赢度。实时荧光定量p c r ( 酞e 班t i m e 爨骓o r e s e 黝t 卿躺t i 濂i v ep c r ，f q p c r ) 是在p c r 技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术，1 9 9 6 年由美丽a p p l i e d 8 i os v s e 曩l s 公司首先摆毒瓣。它是在k 袋反应体系中加入荧光基翻，利用荧光信号来实 时监测整个p c r 进程，最螽通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析溺。 2 污水处理中细菌的原位研究现状 1 2 1 环境样品微生物多样性的研究 研究不同的样品时发现显微镜下可冤的微生物9 9 以上通过常规方法不熊被培养， 由予培养条件与自然条件的差异，实际上培养所得到的只是自然环境中的少部分微生 物，两且往往蠢曩入了浓度远高于窦然状况的营养糖质，其绻果是在凝麓选择压力下群落 结构通常会发生变化，适应丰富营养条件的菌种成为优势种，取代了自然条件下的优势 种。f i s h 技术被广泛应用于环境微生物多样性的研究，s i m o nn a t h a l i e 等在2 0 0 2 年利 用f l s 琏皮术磷究海东中细菌和有害藻类静群之闻的相互作用。p c r d g g e 作势一静指 纹分析技术，具有可重复、快速和操 乍简便等特点，近年来在分予微生态研究方面得到 了广泛的应潮【8 】。丽p c 心d g g e 方法在潜水处理中的应用，则使人们对污水处理过程中 微生物群落的变化产生了新的认识。研究表骧，自然界中在空间上聚集在一起的不同微 生物类群大都在代谢上互惠互利戮。 1 2 2 污水处理中微生物多样性的研究 觚e m 和b 呔馥在1 9 1 4 年发明了活性污泥污水处理法，然而在废水处理过程中微 生物生态学特性一直没有得到深入研究嘲。丽研究微生物个体、群落多样性及其动态变 化对提高处理系统的控制能力具有重要的意义。常规的方法是通过检测特异底物转化率 来研究活性污泥中重要功能菌群的活髅，如耗氧速率、硝化、爱硝化、磷吸收和释放、 2 东北师范大学硕士学位论文 f e 3 + 的还原等。从环境样品中提取微生物总d n a ，经过p c r 扩增1 6 sf r n a 基因后，对扩 增产物进行变性梯度凝胶电泳( d g g e ) 或温度梯度凝胶电泳( t g g e ) 分析，直接观察其多 样性；r r n a 测序和f i s h 结合的群落分析广泛用于监测生物反应器或废水处理设施中的 微生物多样性阳。f i s h 技术能提供处理过程中微生物的数量、空闻分布和厥位生理学 等信息。1 6 sr r n a 为靶序列的f i s h 检测技术被用于检测活性污泥及生物膜微生物群落 结构和数基及其空闻分布，同时对特异菌群进行空闻定位和原位生理学的研究 l 引。 l 。2 3 微生物群落组成及空间分布的研究 d g g e 技术由于可以再现未被培养的微生物信息，从而解决了传统方法的片面性， 在分析环境微生物群落多样性和动态性方面迅速得到了应用。应用共聚焦激光扫描显微 镜f e 璐m 的f l s 嚣技术可以对生物膜和活性污泥絮体的特异种群进行空闻分布研究醛孤。 d o “n g u e s 等应用c l s m ，f i s h 研究了厌氧反应器的生物膜中的乙酸氧化细菌、脱硫微 菌属、产甲烷纲菌、硫酸盐还原细菌的分布1 1 3 】。提取d n a 和经p c r 扩增后，扩增产物照 限制性内切酶进行酶切并电泳，然后用标记探针杂交，从而可以进行r f l p 分析，用以 分析微生物r f l p 的多样性；提取微生物总d n a 后，建立d n a 文库，用1 6 sr r n a 基因探 针筛选d n a 文库中的r p n a 克隆，进行测序和比较，用以揭示微生物序列的多样性。 a m 蝴等根据p c r 扩增的r r n a 序列设计寡核苷酸探针，用f i s h 技术诊断活性污泥中的 微生物群落结构瓣q 。 1 。3 国内外研究现状及分析 关于减少微生物菌团产量的机理，有如下四方面的假设：( 1 ) 能量解偶联：使已 有的a t p 不被细菌利用来合成细胞，从而降低细菌的表观产率系数晗1 ； ( 2 ) 细胞溶解： 使细麓迅速死亡并分解成为基质再次被箕他细菌所利用狰3 ；( 3 ) 微小动物捕食：原生动 物或后生动物以处于其食物链下端的细菌为基质，供其代谢生长h 1 ；( 4 ) 慢速生长细菌 占主导地位：芷常代谢有机物，僵生长速率缓慢的特殊细蔼成为优势菌群强3 。 因前，国内外已有的研究成果报道，多针对前三个机理并集中在两个方面：一是运 用这些机理，研制实际应用技术，进行生活污水或有机废水处理，达到剩余污泥减量效 果。如：根据能量解偶联机理，采用影响生长物质存在( 投加解偶联剂) 、过剩能量存 在( 高基质微生物浓度) 、在过渡时期生长( o x i c s e t t l i n g a n a e r o b i c ，o s a 工艺) 和在不适宣温度下生长( 提高温度) 等方法强3 ；二是以微生物产量与基质降解的定量关 系为目标，研究细胞溶解与微小动物捕食对减少微生物产量的贡献。如：通过对0 s a 工 艺中，溶解微生物产物( s o 】- u b 羔e 臻主e r 曲i a 王p r o d 珏e t s ，s 渺) 较多的污泥储存槽中微 生物产率系数与好氧槽中微生物产率系数的比较，来验证s m p 对微生物产量降低的影响 啼1 。此外，有关s 胛的研究，从s 艘在处理水中的分布、s m p 的测定方法、鳌合性质、 降解能力、毒理特征，影响s 船的因素，到锄p 在废水处理中的数学模型，以及s 船在 好氧和厌氧环境中的比较盯3 。近两年，则集中在s m p 对膜生物反应器中膜的堵塞上，包 括数学模型舞1 与s 渖堵塞膜的可视图像等羚3 。微小动物捕食贡献于微生物产量降低的最 3 东j 师范大学硕士学位论文 瓤报道，是由清华大学环境科学与工程系的黄霞教授和钱易院士研究小组完成的，在传 统活性污泥中雩| 入4 种微小动物( 蠢黝? 蝴蕊耀婀磁蛐始麟留辑黝j 脑 。必j 觑帅a o “妇) 捕食，导致微生物产量降低的研究，证明了该机理的成立n 0 1 1 垤1 。 鸯关慢速生长缨蓥( s 王。矿g r 僻主魏gb a e 专e r 主魏s 秘) 占主导地馥贡献于剩余污泥减量麓 研究报道较少。该假设最先见于2 0 0 3 年，由香港科技大学的g u a n g h a oc h e n 教授提出， 著对其在舔蠢工艺中，是否贡献于剩余污泥减量徽了篱单的实验验证嘲，证明无效。其 他关于慢速生长细蔼代谢特征的研究多见于医学领域娃霹。至今未见在生活污水处理原生 态或模拟环境中，s g b 代谢特性与微生物减量关系的原位研究。 1 。4 实时定量p c r 薹。4 。羔实时定量p e 餮基本孤理 所谓实时荧光定量p c r 技术，是指在p c r 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号 累积实对监测整个愆烂程，最磊逶过标准曲线黠未知模扳进行定量分析煞方法醛。强。在 r e a l ，t i m e 技术的发展过程中，两个重要的发现起着关键的作用：在2 0 世纪9 0 年代早期， 嘲d 冬；a 多聚酶的5 核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光双标记探钟，因此使 得闻接的捡测p c & 产物成为爵畿；此焉，荧光双标记探针的运用使在一密翔豹反应管 中能实时地监测反应全过程。这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展， 导致荧光定量p c r 方法在研究工作中的逶焉。s 强rg 怒嚣nl 是一耪结合予枣沟孛麓双 链d n a 结合染料。与双链d n a 结合后，其荧光大大增吲7 】。这一性质使其用于扩增产物 麴检测非常理想。s 鹕rg 跹嚣n | 麴最大吸收波长麓羽彳黻，激发波长最大约药5 2 翻隧。 在p c r 反应体系中，加入过量s y b r 荧光染料，s y b r 荧光染料特异性地掺入d n a 双链后， 发射荧光信号，两不掺入链中的s y b r 染料分子不发射任何荧光信号，从而保证荧光信 号的增加与p e r 产物的增加完全同步 强l 。 薹。莲。2 实对定量p c r 静後缺点 优点： f 1 ) 灵敏性光谱技术和计算祝技术的联合使耀，大大提高了检测的灵敏度，甚至可 以检测到单拷贝的基因。 ( 2 ) 精确性由于p c r 的平螽效巍，传统p c 袋不能进行精确的定量，两实时荧光定量 瓮r 不受扩增效率和试剂损耗翁影响，利焉扩增进入指数增长期的q 值来定量起始横板 量。 f 3 ) 特异链荧光搽钳是针对靶序列设计，相当予在p c 黼臻过程孛鸯动完成了s o 娃饿e 趣 杂交，具有高特异性。 搿) 安全、快速性实时荧光定量p c r 是在全封闭状态下实现扩增和产物分析的，降 低了演化乙锭的污染，同时可以检测多个样晶，有效减少了劳动量。 5 ) 动态性实时荧光定量p c r 可以在p c r 反应的同时，检测反应的进程。 4 东北师范大学硕士学位论文 缺点： 实时荧光定量p c r 技术需要特殊的热循环仪和试剂，这些都比较昂贵。同时操作时 要考虑以下几个影响因素。包括同源和异源d n a 背景、寡核苷酸杂交特异性、细胞裂解 效率、删瞵a 的部分降解、s y b r ( 氐e nl 的浓度大小、p c 袋产物的长度长短，这些都可 能会引起实时荧光定量p c r 反应在定量上的偏差。因此在操作时需要进行条件的最优化 研究。另终，标准蓝线的制作可缝也存在一定的问题。例如在定量一些不可培养微生物 时，可能要用质粒d n a 的拷贝数来换算才能得到某一微生物种类的丰度，其准确性则值 得探讨【1 6 1 。 1 。5 实验的选题依据、研究内容与意义 剩余污泥的后续处理与处置，一直是废本生物处理豹一大难题，所以研究剩余污泥 减量的机理就成为重要解决的问题。而生物砾间接触氧化法由于其污水处理效果好，剩 余污泥少，抗冲击能力强等优点，并且他的孛试已经在长春净胃潭运行了两年，丽虽出 水水质指标符合标准，并且一直没有剩余污泥排放，所以以生物砾石接触氧化反应器中 载体上的细菌为研究对象。并且细菌的种类已经确定，对这些细菌做定量分析来了解细 菌对剩余污泥减量所起的机理。 本试验是研究在两种不同反应器中，水处理效果的对比，以及两种反应器中活性污 泥和生物膜中的对剩余污泥减量起作用的功麓性细菌在不同时期与空闻内数量变化的 动态分析。而且这几种细菌中，只有假单胞茵的实时定量p c r 扩增条件已被研究，而其 它细菌的扩增条件都需要在试验过程中，不断地摸索与研究，从而确定反应条件。 本试验是拟在课题组已有的研究基础上，利用实时定量p c r 技术对生物砾石球接触 氧化反应法如何达到剩余污泥减量机理的进一步研究，本试验所研究的对象是从前期试 验中建立的主要微生物种群的系统发育树中选出的比较有代表性的细菌，这五种细菌都 存在于普通活性污泥反应器的活性污泥中和生物砾间接触氧化反应器的生物膜和内泥 中，露置部分细菌是作为优势菌群出现的，因蓝研究这些细麓在两种反应系统中的数量， 并将两种反应系统中细菌的数量进行对比，得出细菌对剩余污泥减量的机理，对工艺的 污泥减量枧理研究的运行条件及处理效果提供充分的理论指导，进而促进该工艺替代传 统的生活污水处理工艺，便于广泛推广，所以本课题有重要的理论与实际意义。 东北师范大学硕士学位论文 2 实验装置与方法 2 。1 生物砾间接触氧化反应器与普通活性污泥反应器的启动运行 2 。l 。圭原理 本实验以平行对比的方法来验证生物砾间接触氧化法所处理的水质是否要好于普 通涵性污泥法，以及对比两种反瘟器中的细菌在杰环境中的数量，进一步证明部分功能 性细菌对剩余污泥减量是否起作用。本实验处理过程为：原水经过填满生物砾石球的容 器，在连续曝气的条件下停留一段时间厩，出水在出水口溢出。包括挂膜阶段和稳定运 行阶段，在各个时期进行取样，然后进行分子生物学实验对污泥中的细菌进行研究。为 了准确反映试验过程中细菌的数量，实验所用原水为人造废水，挂膜阶段驯化采用的泥 种采惫长春市第二污水处理厂的曝气池和二沉池。实验中的有关设计参数为：水力停留 时间为1 2 h ，设计流量为1 m ，反应器有效处理污水体积为2 4 l 。 2 1 2 设备与材料 反应器：为直径4 0 c m ，离l o o c m 的下端为圆锥体的圆柱体。 砾石球：由2 3 厘米的砾石经环氧树脂胶绪成的直径为十厘米左右的球状体。 人造废水：成份和浓度见表2 1 。 泥种：长春市第二污水处理厂曝气池和二沉池污泥经沉淀后备5 0 0 武。 储水池：用于存放即将处理的人造废水，为容积1 0 0 l 的长方体有机玻璃容器。 恒温控制器：x m 暑1 0 2 数显温控仪，上海人民企业( 集团) 有限公司。 恒流泵：b t - l o o j ，d g 一2 泵头，保定兰格恒流泵有限公司，单通道o 0 0 6 3 0 “a 嫩n 。 曝气泵：a c o 0 0 3 ，电磁式空气泵，广东日升集团有限公司。 转子流量计：l z 转型玻璃转子流量计，天津市自动纯仪表十四厂。 继电器：j s s 4 8 a s ，双设定循环时间继电器，浙江泰华电器有限公司。 各直径软管适量。 表2 1 人造废水成份和浓度 繇b l e2 - l弧ea 掇鑫c 主蕾w a s l e w 鑫差e e o 醒 o s i l i 能a 觳dc 豫e e 热粕t i 醐 6 东北师范大学硕士学位论文 2 1 3 实验方法 安装好设备之后，在反应器中注入原水至设计水位，分别投入经沉淀浓缩后的曝气 池污泥和二沉池污泥各5 0 0 l n l ，开启恒温控制系统( 温度控制在2 5 度) ，并开始曝气， 不进水也不出水。连续闷曝2 4 小时后，停止曝气，沉淀半小时，然后将上清液排出， 替换为原水，继续闷曝，如此几天过后，观察到石球表面有粘膜附着时，开始连续进水， 水量由小到大，直至达到设计流量1 m ，水力停留时间为1 2 h ，在整个系统的挂膜与运 行阶段，对系统出水的c o d 、s s ，n h 3 - n ，d o 实施连续监测，了解反应器的运行处理 状况。 一i 【 i ， _ l _ 、o ；_ j7 j 一一 i 。 日圜i j13 曰冒i 冒口 l 一储水器6 一碎石球填料 2 一恒流泵7 一恒温探头 3 一曝气装置8 一恒温调节器 4 一继电器9 一溶解氧分析仪 5 一曝气头 图2 1 普通活性污泥反应器与生物砾间接触氧化反应器装置图 f i g2 1 c o n v e 确。矾la c t i v a t c ds l u d g er e a c t o ra n dg c o i 国ae x p e 觚e n t s y s t e m 2 2 采样 在反应器稳定运行后，跟据系统中各个区域环境的不同，分别取石球外部生物膜( 外 膜) 、石球内部污泥( 内泥) 、以及反应器底部的沉淀污泥( 余泥) 三种特定环境的样品。 具体取样方法如下： 外膜：从反应器中的第2 或第3 层的石球上，挑取生物膜生长较好的石球，用蒸馏 水轻轻冲洗，然后用试剂勺刮取适量石球表面的生物膜，溶于装有2 0 0 蚵的无菌水的无 菌瓶中。 内泥：从刚取过外膜的石球中，用一次性注射器，去除前端的针后，接上合适的软 管，然后将管的另一头伸入反应器中，沿石球空隙插进石球内部，抽取样品，置于装有 2 0 0 l n l 的无菌水的无菌瓶中。 余泥：同内泥取法，将注射器与管连接，插到反应器底部的沉淀污泥中，抽取样品 即可。 2 3 样品预处理及总d n a 的提取 东北师范大学硕士学位论文 2 3 1 原理 由于活性污泥细菌种类组成复杂且混杂有大量有毒物质，如何使所有细胞裂解、充 分释放d n a ，有效去除杂质，得到可以进行分子生物学操作的高纯度d n a 是研究活性 污泥种群结构与功能关系的关键所在。为此，本实验对国外报道的方法进行了改进【2 0 1 ， 建立了不需购置专用设备、细胞裂解完全、快速、简便的d n a 提取方法，所得到的d n a 可以满足分子生态学研究的需要【1 刀。实验采用的是“冻融，溶菌酶一s d s 裂解，酚氯仿 抽提 的方案。 2 3 2 设备与试剂 实验所需设备：水浴恒温箱，低温高速离心机，振荡培养箱，漩涡混合击打，液氮 罐，凝胶电泳仪，凝胶成像系统，制冰机 设备规格及厂家见表2 2 表2 2 各设备的生产厂家及规格 1 a b l e2 2t h ee q u i p m e n tm a n u f a c t u r e r sa n ds p e c i f i c a t i o n s 设备名称型号及生产厂家 台式离心机 低温高速离心机 振荡培养箱 稳压稳流电泳仪 凝胶成像仪 制冰机 恒温金属浴 蛋白核酸分析仪 t g l 1 6 g c ，上海安亭科学仪器厂 3 k 3 0 ，s i g m a h z q - x 1 0 0 ，中国哈尔滨市东明医疗仪器厂 d y y - i 6 b ，北京市六一仪器厂 b t s 2 0 m ，u v h o t o m w l o p b - 4 ，上海安亭科学仪器厂制造 t 1 1 e n n oc e l l ，c h b 2 0 2 ，杭州博日科技有限公司 d i1 6 4 0 ，b e c k m a n 试剂： 1 无菌水 2 o 1 m 磷酸盐缓冲液( p h 7 2 ) 3 t e n p 缓冲液( 5 0 m m o l lt r i s _ b a s e ，2 0 m m o l le d l a ，1 0 0 m m o l ln a c l ， 0 0 1 砌聚乙烯吡咯烷酮，p h = 1 0 ) ，灭菌 4 液氮 5 冰盒 6 溶菌酶溶液( o 1 5 m o l l n a c l ，o 1 m 0 1 l n a 2 e d t a ，1 5 m r n l 溶菌酶，p h 8 ) ，其中 溶菌酶配制成3 0 m “的母液，- 2 0 保存备用。 7 1o s d s 溶液( 0 1m o j 呵a c l ，o 5 m o l l 1 r r i s h c ，1o s d s ，p h 8 ) 8 晰s 饱和酚，由鼎国生物技术有限责任公司提供 9 氯仿 1 0 3 m o 儿乙酸铵 r 东北师范大学硕士学位论文 无水乙醇 7 0 乙醇 i 心i a 酶r n a s e a ，1 0 m r n l 6 l o a d i l l gb u 虢r d l l 5 0 0 0m a r k e r ，由大连宝生物工程有限公司提供，m a r k e r 的电泳图见图2 2 琼脂糖( a g a r o s e ) t a e 缓冲溶液 溴化乙啶( e b ) ：1 5 p 面 图2 - 2d l 2 0 0 0m a d 泐1 琼脂糖凝胶电泳图 f i g u r e2 2 d l2 0 0 0m 破e r1 a g a r o s eg e le l e c 仃o p h o r e s i s 2 3 3 实验方法 由于活性颗粒污泥中，含有部分有机物，d n a 提取物颜色偏黑，p c r 扩增效果不 好因此，需要进行预处理，提取d n a 之前，用缓冲液冲洗，以减少d n a 提取物中有 机物的含量。 1 清洗及解絮凝取1 5 i n l 泥样，于1 5 m 1 e p 管中，离心( 1 0 0 0 蛐，5 i n i l l ) 。 弃上清，沉淀( 约1 0 0 m g ) 悬浮于1 n 1 1 的0 1 m 磷酸盐缓冲液( p h = 7 2 ) 中，置于漩涡 混合击打1 5 1 1 1 i n ，再用枪进一步混合去絮凝。室温振荡培育l h 后，1 0 0 蛐离心1 0 幽， 弃上清，沉淀用于d n a 提取【2 2 1 。 2 冻融处理向沉淀中加入0 5 1 1 1 l 灭菌的t e n p 缓冲液，悬浮。将茵液在液氮中 冷冻3 n 血，在6 0 水浴中5 商n ，反复3 次后进行菌体离心( 1 2 0 0 0 g ，4 ，1 0 m i n ) ， 上清液快速置于冰上留用，沉淀用于进一步裂解。 3 溶菌酶一s d s 裂解将沉淀悬浮在o 7 5 l n l 的溶菌酶溶液中。3 7 温浴1 h ，期间 每隔1 5 幽将菌液上下摇匀，温浴后向菌液中加入o 7 5 叫1 0 s d s 溶液，上下摇匀，待 菌液变清后，离心1 0 m i i l ( 1 2 0 0 0 g 4 ) ，取上清置于冰上留用。 4 d n a 提取与纯化收集前两步的d n a 上清液( 1 5 2 血) ，分成两管( 2 o e p 管) ， o 1 2 3 4 5 6 7 8 1itl 1i，l 洚 粼燃渤 瓣 瓣 嫩 东北师范大学硕士学位论文 用等体积的强s 饱和酚抽提2 次、酚+ 氯仿( 1 ：1 ) 和氯仿各抽提1 次。加2 0 “l 的3 m o 儿 乙酸铵和1 5 砌无水乙醇沉淀饼、a ，2 0 至少放置3 0 i l = l f m ，离心( 2 0 商n ，1 4 0 0 0 g ，4 ) 。 用l m l 的7 0 乙醇洗涤沉淀，离心l o 碰n ( 1 o o g ，4 ) ，弃上清。d n a 沉淀放置室温 干燥后，溶于5 0 弘l 高纯水中，加r n a s e a 3 弘l ( 1 0 m 动越) ，3 7 温浴3 0 两建消化r n a ，样 品在2 0 保存备用i z 。 5 d n a 纯度检测测定d n a 样品在2 6 0 i 】m 和2 8 0 砌的吸光值，计算 a b s 2 6 跳封彩国s 2 8 黼m 的比值确定样品纯度。 6 。d n a 浓度电泳检测d n a 浓度用l 琼脂糖凝胶进行电泳检测，凝胶成像系统 纪录。1 琼脂糖凝胶电泳的具体方法是：0 2 9 琼脂糖用2 0 皿的1 也溶解，加热沸 腾三次至完全溶解，倒入胶槽内，加l p l 的e b ，混匀，插上小梳，等待至冷却成形， 拔出巷梳，将胶放入充满l 科瞧( 或t b e ) 缓冲液的电泳槽内，向小孔内点入样品和 l o a d i n gb u 仃e r 的混合物以及对应的m 破e r ，开始电泳。电泳结束后，将胶放置到凝胶成 像系统中，观察分离结果并记录。 2 4p c r 反应引物的设计 2 4 1 原理 根据序列分析的结采进行引物的设计，首先确定弓| 物的设计位点，然后遵循弓| 物的 设计原则，利用p _ f i m c fe x p f e s ss o 瓢磁e 引物设计软件设计出对应的引物。再在试验过 程中进行不断的摸索，然厢得出对应的引物。 2 。4 。2 引物设计的原则 引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之 间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发d n a 聚 合反应( 即错配) 。弓| 物设计应注意如下要点醛弼： l 。引物的长度一般为1 5 3 0 b p ，常用的是1 8 - 2 7 b p ，但不应大于3 8 ，因为过长会导 致其延伸温度大于7 4 ，不适于t a qd n a 聚合酶进行反应。 2 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3 端相似性较高的序列，否则 容易导致错配。引物3 端出现3 个以上的连续碱基，如g g g 或c c c 也会使错误引发 机率增加。 3 引物3 端的末位碱基对t a q 酶的d n a 合成效率有较大的影响。不同的末位碱 基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为a 的错配效率明显高予其他3 个碱基， 因此应当避免在引物的3 端使用碱基a 。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致p c r 反应失败。5 端序列对p c r 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4 弓l 物序列的g c 含量一般为4 0 6 蝴，过高或过低都不利于引发反应。上下游引 物的g c 含量不能相差太大。 l o 东北师范大学硕士学位论文 5 。引物所对应模扳彼置序列的t l 觳值在7 2 左右可使复性条件最佳。弧n 值的计 算有多种方法，如按公式n n = 4 ( g c ) + 2 0 钮) ，在o l i g o 软件中使用的是最邻近法( t l l e 黼a 穗辩i g 搭m e 氆。纛。 6 龋值是指d n a 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对豹 相对稳定性。虑当选用3 端g 值较低( 绝对值不超过9 ) ，而5 端和中间a g 值相对 较毒熊弓| 物。号 耪的3 端贻矗g 值过高，容易在错配链点形成双链结构并雩l 发渊众聚 合反应。 7 引物二聚体及发夹结构的能值邀黼( 超过4 5 k e a l 搬0 1 ) 易导致产生引物二聚体 带，并且降低碍l 物有效浓度而使p c r 反应不能正常进行。 s 。对雩l 物的修饰一般是在墨端增加酶切位点，疲根据下步实验孛要捶入船鼗产 物酶载体的穗应序残两确定。 。 2 。5p e r 舞。增 2 5 1 原理 类似于d n a 的天然复制过程，其特舜性依赖于与靶序列两端嚣补的寡核瞢酸弓l 物。 p c r 豳变性退火延伸三个基本反应步骤构成：模板d n a 的变性：模板d n a 经加热 至9 3 左右定对闻薏，使模援脒a 双链或经聚扩增形成的双链渊a 解离，使之 成为单链，以便它与引物结合，荧下轮葳应徽准备；模板d n a 萼辱| 物的运火( 复性) ： 模板d n a 经加热变性成单链后，温度降歪5 5 左右，引物与模板d n a 单链的互补序 列配对结合；零；物的延 枣：d 】妊模板一弓 物结合物在嘲蹦a 聚合酶的幸筝用下，激 烈t p 为反应原料，靶窿列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模 板d n a 链互补的半保篷复制链熏复循环变性一退火一延伸三过程，就可获得更多的“半 保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板【l 霹。 环境样黼中提取到的粼量通常较低瑟且缀杂，为了获得麓够焉于后续分析的大 量暇，提取蒋酶臻a 需要进行多聚酶链式反应( 鹣l y 燃e 穗敷热粥a c 疰豫，p c 鹚扩增。 本实验研究的是对污泥、减量起作用的些细菌数量的变化，以及这蝗细菌在总的微生物 群落墅所占的相对数量1 2 霹。因戴，实验中选择了这些细菌的特异性引物和以原核生物遥 用的零| 物。特异雩| 物p c r 产物片段为2 鳓印左右，露露通用譬| 物p c 袋产物片段圭l 姊左 右。 2 。s 。2 试剂与设备 董。试剂：零l 物 2 p c r 反应试剂盒：由宝泰克生物科技公司提供，其制品内容见表2 。3 3 无菌水 4 ，冰盒、p c 爻管 5 p c 袋反应仪：基因扩增仪，1 ) e b i o e r 6 ，离心机：台式高速离心机，弼“1 6 g ，上海医用分析仪器厂 l l 东北师范大学硕士学位论文 7 。凝胶电泳仪及凝胶成像系统：稳压稳流电泳仪，d y 曩6 b ，北京市六一仪器厂 8 制冰机：l q p b 4 上海安亭科学仪器厂 表2 3p c r 反应试剂盒 囊l e 2 ，3p c r 凇e 矗艟敞 试剂盒组成试剂体积 飘k a r at a 唾( 5 u 加1 ) lo c rb u & 矗 ( m 9 2 + p l _ u s ) d n t pm i x t l l r e ( 各2 5 m m ) 6 i 乃a d 玉毽b u f 妨 5 0p l l 蛐 8 0 0 u l l 蕊 2 。5 3 实验方法 1 在冰上配置p c r 反应液，反应液组份鲡表2 4 ，其中模板d n a 的量是把所提 d n a 稀释到合适倍数( 一般为2 0 0 倍) ，加1 此于反应液中。此稀释倍数需e l j 多次p c r 反应摸索两褥，且因样燕不固和提取浓度不餍丽变化。 2 启动p c r 反应仪，设置热循环反应条件如表2 5 ，将配置的反应液快速稍加离 心后，均匀放入仪器中。 3 反应完毕后，取2 3 此反应产物，用2 ( w v ) 的琼脂糖凝胶电泳，检测p c r 扩增结果。 表2 4p c r 反应液组份( 5 西) 1 a b l e2 4p c rr c a c t i o no f t h e 铲o u p ( 5 0p1 ) 反应组分反应液体积 2 t a qp c rm a s t c rm & ( o 1 u m l ) 模板d n a ( 基因组d n a ) 弓l 物l l 鲰 引物2 ( 1 呻m ) 灭菌蒸馏水 表2 5p c r 反应热循环条件 强b l e2 5p c rf e a c t i o nt h 蝴a lc y c l i n gc o n d i t i o n s 2 。6p 勰纯化阉收d n 武 2 6 1 原理 p c r 扩增的产物是p c r 扩增时反应液的混合物，里面含有有时含有一些菲特异性 n 哇 n 呻 l l l 1 “ 却哪m m 鼬 2 2 2 o q 星p 叭 东北师范大学硕学位论文 条带，即引物二聚体，其并非实验所需，所以应对其进行处理。嚣此需要对反瘦物进行 纯化回收，得到高纯度的d n a ，作为进步分析的原材料。 幺s 。2 试帮 裘2 6 瞽遥琼舞鬟糖凝胶蹦a 阉收试裁鑫 罩痨l e2 下酝n 黟l 疆诿两蛀嚣蹦i 确舔 试剂盒缀成d p 2 0 9 0 2 ( 5 0 次)