（生物医学工程专业论文）shsy5y细胞内钙调控过程及阿片的作用研究.pdf

华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 a b s t r a c t , i c y t o s o l c a * is a k i n d o f i m p o rt a n t i n t r a c e l l u la r s e c o n d m e s s e n g e r . i t r e g u l a t e d m a n y c e l l u l a r p h y s i o l o g i c a l p r o c e s s e s , s u c h a s f e rt i l i z a t i o n , d e v e l o p m e n t , p r o l i f e r a t i o n a n d e l e c t r o c h e m i c a l s i g n a l t r a n s d u c t i o n , e t c . i t i s a l s o i n v o l v e d i n t h e o c c u r r e n c e o f m a n y p a t h o l o g i c a l e v e n t s , s u c h a s a p o t o s i s , a l z h e i m e r s d i s e a s e o r o t h e r n e u o r d e g e n e r a t i o n d i s e a s e s . u n d e r n o r m a l c o n d i t i o n s t h e c y t o s o l c a t c o n c e n t r a t i o n ( c a z l ;) w a s c o n t r o l l e d b y v a r i o u s m e c h a n i s m s t o m a i n t a i n a t a r e la t i v e s t a b l e l e v e l . a s a k i n d o f n e u r o t r a n s m i tt e r , t h e a n a l g e s i a , t o l e r a n c e a n d d e p e n d e n c e e ff e c t s o f o p i o id a r e r e g u l a t e d v i a v a r i o u s i n t r a c e l l u l a r s e c o n d m e s s e n g e r s s y s t e m . t h e s h - s y 5 y c e l l l i n e i s a d o p t e d a s t h e c e l l m o d e l . b y u s i n g v a r io u s k i n d o f e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l t e c h n i q u e s , s u c h a s c e l l - a tt a c h e d p a t c h c l a m p , w h o l e c e l l p a t c h c l a m p a n d m i c r o fl u o r e m e t r i c t e c h n i q u e , w e a r e a b l e t o s t u d y t h e in t r a c e l l u l a r c a t h o m e o s t a s i s r e s p o n d i n g t o d i ff e r e n t s t i m u l i a n d t h e r e l a t io n s h i p b e t w e e n o p i o i d a n d c a * s i g n a l s y s t e m . t h e r e s e a r c h m a i n l y c o n s i s t s o f t h r e e p a r t s . a k in d o f c h o l i n e r g i c - l i k e t r a n s m i tt e r , c a r b a c h o l ( c c h ) i s f o u n d t o t r i g g e r c a l c i u m o s c i l l a t i o n s i n s h - s y 5 y c e l l s . t h e me c h a n i s m o f c a l c i u m o s c i l l a t i o n i s s t u d i e d a n d t h e ma t h e ma t i c a l mo d e l o f t h e o s c i l l a t i o n s i s e s t a b l i s h e d b a s e d o n t h e e x p e r i m e n t a l r e s u l t s o b t a i n e d i n p a r t o n e . p a r t t w o g i v e a n i l l u s t r a t i o n o f t h e t i m e c o u r s e o f c a c l e a r a n c e a ft e r h i g h k d e p o l a r i z a t i o n o r c c h s t i m u l u s . i n t h e l a s t p a rt , t h e d u a l e ff e c t s o f o p i o i d ( b o t h e x c i t a t o ry a n d i n h i b i t o ry) o n i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m s i g n a l a r e s im u l t a n e o u s l y f o u n d i n t h e s a m e c e l l . d i ff e r e n t m o l e c u l a r m e c h a n i s m s u n d e r l i e s t h e s a m e e x c i t a t o ry e ff e c t s o f o p i o i d i n d i s t i n c t c u l t i v a t i o n e n v i r o n m e n t a r e a l s o s t u d i e d . a l l t h e s e w o r k w o u l d b e h e l p fu l t o th e b e tt e r u n d e r s t a n d in g o f i n t r a c e l lu l a r c a z s ig n a l n e t w o r k , r e l a t i o n s b e t w e e n c a a n d n e u r o d e g e n e r a t i o n d i s e a s e s a n d t h e c o m p l e x m o l e c u l a r m e c h a n i s m o f o p i o i d . t h e m a i n r e s u l t s o b t a i n e d a r e l i s t e d b e l o w : 1 . v a r i o u s v o l t a g e g a t e d c h a n n e l c u r r e n t s a r e r e c o r d e d i n s h - m y c e l l s , i n c l u d i n g n a , k a n d c a c h a n n e l . t h e c u r r e n t - v o l t a g e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e m a r e a l s o p l o tt e d b a s e d o n t h e d a t a o b t a i n e d . 8 o p io i d r e c e p t o r a g o n i s t , d p d p e i s f o u n d t o e x e rt i n h i b i t o ry e ff e c t s o n t h e v o c c a c u r r e n t . 一 一 - 一 一 一 - - 一 一 - - - i i i 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 2 . ca; i s m e a s u r e d b y u s in g m ic r o fl u o r e m e t r i c t e c h n i q u e . i t is t h e f i r s t t i m e t o i l l u s t r a t e a c c h- i n d u c e d c a l c i u m o s c i l l a t i o n s e x i s t e d i n s h- s y5 y c e l l s . r e s u l t s a l s o s h o w : ( 1 ) t h e o s c i l l a t i o n s a r e d e t e r m i n e d b y i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m s t o r e s . ( 2 ) e x t r a c e l l u l a r c a e n t ry i s f o u n d d u r i n g t h e o s c i l l a t i o n s a n d i t m a y p r o v i d e a s o u r c e t o r e f i l l t h e s t o r e . ( 3 ) t h e f r e q u e n c y b u t n o t t h e a m p l i t u d e o f t h e o s c i l l a t i o n i s a ff e c t e d b y v a r i o u s f a c t o r , h i n t i n g t h a t t h e i n f o r m a t i o n m a y b e e n c o d e d i n t h e fr e q u e n c y . ( 4 ) t h e m a t h e m a t i c a l m o d e l o f a s i n g l e - p o o l m e d i a t e d c a l c i u m o s c i l l a t i o n i s e s t a b l i s h e d , a n d i t s u c c e s s f u l l y m i m i c s t h e a c t u a l s i t u a t i o n . i t a l s o u n v e i l s t h a t i t i s t h e i n h e r e n t c h a r a c t e r i s t i c o f i n d i v i d u a l c e l l t h a t d e t e r mi n e d i f i t c o u l d e x h i b i t c h a r a c t e r i s t i c o f o s c i l l a t i o n s . 3 . t h e r e c o v e ry t i m e c o u r s e o f c a * , r e s p o n d i n g t o d i ff e r e n t s t i m u l i i s i n v e s t i g a t e d . t h e r e s u l t s o b t a i n e d a r e l i s t e d a s f o l l o w e d : ( 1 ) t h e d y n a m i c s c u r v e s o f c a a f te r h i g h k d e p o l a r iz a t i o n o r c c h s t i m u lu s a r e i l l u s t r a t e d . ( 2 ) c a l c i u m b u ff e r a n d c a - a t p a s e i n e n d o p la s m i c r e t i c u l u m a r e f o u n d t o p l a y a n i m p o rt a n t r o l e i n t h e c le a r a n c e p r o c e s s a f t e r d e p o l a r i z a t i o n . ( 3 ) t h e e ff e c t s o f m i t o c h o n d r i a i n t h e c a c l e a r a n c e a r e a l s o s t u d i e d . 4 . b y u s i n g s p e c i f i c o p io i d r e c e p t o r a g o n i s t a n d a n t a g o n i s t , w e a r e a b l e t o s t u d y t h e r e l a t i o n s h ip b e t w e e n o p i o i d a n d c a * 二 t h e c o n c l u s i o n a r e : ( 1 ) i n c e l l s c u l t i v a t e d f o r 3 - 1 0 d a y s , e x c i t a to ry a n d in h ib i t o r y e ff e c t s o f o p io i d o n c a , i n t h e s a m e c e ll a r e d e t e c t e d i f it h a d b e e n p r e - s t i m u l a t e d b y c a r b a c h o l . t h e s t i m u l a t o ry e ff e c t i s b e l i e v e d t o a tt r i b u t e t o c a r e l e as e f r o m s t o r e , a n d a c t v i a a g ; g o p r o t e i n s u b u n i t ( 2 ) o n t h e c o n t r a r y , i n f r e s h l y d i s s o c i a t e d c e l l s ( 4 8 h o u r s ) , d p d p e a lo n e c o u l d t r i g g e r e l e v a t i o n o f ca;. t h i s e x c i t a t o ry e ff e c t i s a tt r i b u t e d m a i n l y t o e n t r a c e l l u l a r c a e n t r y , a n d a c t v i a a g , p r o t e i n s u b u n i t . 卜 k e y w o r d s : s h - s y 5 y c e l l , p a t c h c l a m p , m e m b r a n e i o n i c c h a n n e l , i n t r a c e l l u l a r c a 2 c o n c e n t r a t i o n ( c a 2 ;) , c a l c i u m o s c i l l a t i o n s , c a l c i u m h o m e o s t as i s , m i t o c h o n d r i a , o p i o i d r e c e p t o r , g p r o t e i n , e x t r a c e l l u l a r c a e n t ry , e x c i t a t o ry e ff e c t s o f o p i o i d 卜 w 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 第一章 绪论 互 1 . 1引言 1 8 8 2年， r i n g e r 第一个发现细胞内 游离钙离子( c a ) 在细胞中的功能， 如 调控心脏的收缩、卵子的受精以及细胞贴附等过程。随后几百年间，人们对它 进行了一系列的研究，现有的结果证明几乎我们所做的工作都受到 c a + 的调 控。例如，如何运动、心脏如何跳动、大脑如何接收和储存信息等。c a 作为 胞内 第二信使，在细胞内调节各种生理过程( b e r r i d g e 1 9 9 7 a ; b e r r i d g e 1 9 9 7 b ) . 例如，在生命的开始，c a 触发了受精过程，它也控制了细胞的发育和分化， 参与调节细胞的各种生理活动，最后在细胞凋亡过程起重要作用。因为要完成 所有的这些功能，c a 十 信号一方面必须非常灵活，另一方面又必须受到严格的 控制。细胞通过使用 c a 2 1 信号的不同的工具包 ( t o o l u n i t )来实现这个非同一 般的灵活性的，即c a 可以在不同的时间，空间和幅度上作用，而不同的细胞 选择不同参数的工具包组合来完成它们的 特定生理功能( b e r r i d g e e t a l . 2 0 0 0 ) 0 大多数c a l 的 效应是 通过几种钙结合蛋白( c a b p , c a l c i u m b i n d in g p r o t e i n ) 以 及 某 些 受c a 调 节的 酶 或蛋白 ， 如 蛋白 激酶( p k c , p r o te in k in a s e c ) , 磷 脂 酶、 肌动蛋白 和离子通道蛋白 等的介导。 例如钙调蛋白( c a m , c a l m o d u l i n ) 是 一种最主 要的钙结合蛋白， 胞内 游离钙离子浓度( c a ,) 的微小变化就会引 起 它活性的改变， 形成不同的构型，从而识别不同的酶系统，引起不同的生物效 应.例如一些药物可以影响 c a m 与 c a l , 的亲和力，二价阳离子也可以与 c a l 竞争结合c a m，从而影响了它对靶酶的活性，最后都影响了总的细胞效应。 一般细胞外c a 浓度为1 .8 m m o u 1 ， 而胞浆内 游离c a 仅为0 . 1 mo ll l ，正是 这种浓度差成为c a l 发挥生理作用的基础， 因 此细胞 【 ca、 是调节各种反应 的关键，这样它的定量检测就变得十分重要( 张云 和 薛绍白 1 9 9 3 ) 0 1 . 2几种基本的电生理技术 1 . 2 . 1游离钙离子浓度测量技术 6 0 年代r i d w a y 和a s h l e y 用水母发光蛋白( a e g u o r i n ) 注入藤壶的肌纤维 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 一一巴 竺 = 巴 巴 竺 竺 = 竺 = 卑 巴 = 竺 竺 = 竺 竺 竺 竺 = 巴 = 竺 巴 = 竺 一一 竺 细 胞 电 第 一 次 测 定 活 细 胞 的 c a , ( r i d g w a y t s i e n t s i e n 1 9 8 6 ; t s i e n 1 9 8 1 ; t s i e n e t a l . 1 9 8 2 ; w i l l a m s e t a l . 1 9 8 5 ) ， 这 些 新的 荧 光 染 料 被 称为 钙荧 光 探 针( f l u o r e s c e n t p r o b e ) ， 属 于 一 种 无 损 伤的 测量方法。 目 前 较常用的 测量的 细胞内 c a 2 * ; 方法包括以 下几 类: 1 钙 结 合 染 料( c a - b in d in g d y e s ) . a r s e n a z o i i i 和a n t ip y ry l a z o i i i 是 最 普 通的 金 属 指 示 剂， 与c a 结 合 后 其 吸 收 光 谱 会 发 生 变 化， 可 用于 测 定 c a * , o 但由于 其发光效率 较低， 近年 来使用 较少。 而t s i e n和其同 事发展的四 碳 化合 物c a 2 , 探 针， 是c a 合 剂b a p t a的 衍生 物， 对c a ll , m g t 的 选择 性 很高， 构成了 荧 光测量 c a 、 的 主 要 方 法， 常 用的 染 料有f u r a - 2 , q u in - 2 和in d o - 1 等。 2 . 钙活化的发光蛋白 ( c a z - a c i t i v a t e d p h o t o p r o t e i n ) ( r i d g w a y t s i e n c o l e 1 9 4 9 ) . 1 9 4 9年出 现电 压钳记录技术， 应用此方法， h o d g k i n 和h u x l e y 于1 9 5 2 年提出并验证了 动作电 位的n a 通道学说， 并因 此而获得诺贝尔生理与医学奖( h o d g k i n e t a l . 1 9 5 2 ) 0 1 9 7 6 年， n e h e r 和s a k m m a n 通过将微电 极用于细胞膜的表面上，首次 在蛙胸皮肌细胞膜上记录到a c h r 通道的单个通道电流， 其分辨率高达p a 量级， 成为生理学发展史上一个重要的里程碑( n e h e r s a k m a n n 若 在 细 胞 贴 附 式 基 础 上 给 以 短 暂 的 脉 冲 负 压 或 电 刺 激 打 破 电 极 内 细 胞 膜， 便 形 成 全 细 胞 模 式 ; 若 在 形 成 细 胞 贴 附 模 式 后 不 是 将 膜 吸 破 而 是 将电 极内 液加 入打 孔 剂( 如n y s t a t i n ( k l e i n b e r g h o r n g i l l i s k . 1 9 9 5 ) 。 不 过， 它不能 分辨直径小于 2 0 0 n m的单个囊泡的融合， 也不能排除胞吞信号的影响。另一种则是近几年发 展起来的 碳纤微电 极( c a r b o n f i b e r e l e c t r o d e , c f e ) 检测 技术( w i g h t m a n e t a l . 1 9 9 1 ) 。在一个适当的电压下，由分泌囊泡释放的物质在碳纤尖端快速氧化反 应后可释放出电子，电流量跟被氧化物质量成正比，因 此，记录到的电 流波形 可以反应出囊泡释放的动态过程和分泌量的大小。当然，碳纤电极只能检测到 局部囊泡的释放，若与检测全细胞分泌的膜电容方法相结合，则可以更全面地 反映分泌的动态过程。 将上述几种方法联合，则可以对细胞进行钙信号、膜离子通道电流、分泌 等多指标测量。这样，可以得出同一刺激中各种因素同时变化的情况，进而可 分析这些变化间的相互关系。 当然，电生理技术亦只能揭示细胞某些方面的特性，各种技术都有其局限 性，只有配合生物化学，分子生物学等手段，研究才会全面和深入。 1 . 3胞内钙信号调控机制 胞浆c a + 浓度受胞内的复杂机制所调控，详图如图1 - 1 所示( k o s t y u k 2 ) 由质膜上钙泵或是n a / c a 交换组成的钙清除机制;3 ) 胞内钙库和线粒 体可以储存c a l . 线粒体 a v c a ca 卜 c a ? 库a t p a 之 尹c a -a t p 3k 图 1 - 1胞内 游离 c a = 的复杂调控机制。涉及的调节机制包括:e r / s r上的钙库，e r / s r 上的c a - a 丁 p 泵，线粒体，细胞膜上的c a - a t p 泵，钙缓冲蛋白， n a / c a + 交换。 1 . 3 . 1胞内钙上升机制 1 .细胞质膜钙通道 外 钙进入途径主要分成三 大类: 电 压门 控的 钙通道( v o l t a g e o p e r a t e d c a l c i u m c h a n n e l , v o c ) ( 甘戈 e t a l . 1 9 9 7 ; 郑永芳 1 9 9 2 ) 、 受体门 控的 钙 通道 ( r e c e p t o r o p e r a t e d c a l c iu m c h a n n e l , r o c ) ( b e r r id g e e t a l . 2 0 0 0 ; b a r r itt 1 9 9 9 ) 和 钙 库控 制 的 钙 通道 ( s t o r e o p e r a t e d c a l c iu m c h a n n e l , s o c ) ( b e r r i d g e 1 9 9 5 ) . v o c 一 般由 五 个 亚 基。 ， 、。 : 、日 、丫 和6 构 成， 其中。 ， 构 成 通道 本 身 和 通 道 调 节 物 结 合 位点。 根据它们的门 控、 动力学特性、 单通道电 导和药理学方法， 可以 将v o c 划分成t , l , n , p , q , r六种。 典型的 受体门 控的钙通道有n m d a通道， 它对 c a 2 1 有高通透性。v o c和r o c的产生机制研究得比 较清楚，而s o c的 产生机理却仍是一个谜。s o c是受钙库的填充状态调节的钙内流途径，没有 解决的主要问 题涉及到钙库排空与通道开 放之间的机制( b e r r i d g e 1 9 9 5 ) 。一种 推测是钙库释放产生了 一 种钙进入因 子( c a l c i u m i n fl u x f a c t o r , c i f ) , 然后扩散 到膜表面打开通道;另一种推测则认为钙库排空的信息直接通过 1 , 4 , 5 一 三 _一-一一-一一 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 竺=巴竺=竺竺=竺巴巴竺竺竺竺 磷 酸 肌 醇 受 体 ( in o s it o l 1 , 4 , 5 - t r i s p h o s p h a t e , i p 3 ) 传 递 到 细 胞 质 膜 上 的s o c 通 道，由 于i p , 受 体 构 象的 变 化引 起到 细 胞 质 膜上的s o c 蛋白 的 构 象 变化， 引 起 外钙流入。 v o c和 r o c的 特性是在短时间内 产生 大量的钙内 流， s o c则产 生较小的、然而却是持续的钙内流。 2 .钙库和胞内钙释放通道 细胞内的e r / s r上存在两 种钙库， i p 。 和 r y r ( ry a n o d i n e ) 两类。 它 们在在 空间 上不重合而独立存在( k o s t y u k 陈宜张 1 9 9 5 ) 。 由 于e r 不是一个均匀分布的整体，所以其上的钙库分布也是各向异性的，或者分布在 离散的细胞器内，或者分布在特异不同的e r小室内。 钙库结构上都包括了几个部分:s e r c a泵，钙释放通道和钙结合蛋白。 而两种钙库上的钙释放通道分别为i p , 和r y r受体通道。由 于细胞种类的差异 性， r y r 受体可以 分 成三种亚型， i p ; 受 体则至少存在四 种亚型 ( m a c k r i l l 1 9 9 9 ) . 在结构上两种受体的 c 一 末梢主域都有位于 e r / s r上的跨膜区域，作为钙释放 通道而存在着，而较大的 n 一 末梢区域形成一个球根状的头部，伸到胞浆中去， 整合控制通道开放和关闭的信号。另外，这两种受体通道的开关的控制机制也 十分类似。由于它们的许多结构和生理上的相似之处，所以一般认为它们有相 同的起源，具体可参见表1 . 1 ( m o o r e n 另 一 方 面，一旦c a z + 浓度上升到一定的程度时，它就会反过来抑制c a z + 的释放，从而 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 保证释放出 来的 c a 的数量足以 触发生理功能而又不损伤细胞。除了 c e之 外， 两种受体释放通道同时 还受其它介质的控制: 对于 i p , 受体来说，另一种 激动剂是i p , 本身: 而 对于r y r受体来说， 另一种激动剂是 环腺昔核酸核 糖体 ( c a d p r ) e i p s 和 r y r型的钙释放通道的开闭都同时受到双重激动剂的控制 ( b e r r i d g e 1 9 9 7 . ; b e r r i d g e e t a l . 2 0 0 0 ) . 1 . 3 . 2胞桨游离钙清除机制 当细胞受到外界刺激后，胞浆内游离钙离子在短时间内上升到很高的水 平， 执行其作为第二信使的功能。 然后胞内的多种机制会迅速清除多余的c a l , 如果 c a 2 l . 长时间保持 在高 水平上时， 细胞会 死亡。 胞内 钙清除的 机制主要分 为三类，钙泵，钠钙交换和钙缓冲。 f 1 .钙泵c a - a t p a s e 可以 分为 细胞 质膜 上的c a t 泵 ( p m c a , p la s m a m e m b r a n e c a 2 - a t p a s e ) 和 e r 上的c a t 泵( s e r c a , s a c r o ( e n d o ) p l a s m i c r e t i c u l u m c a ， 十 一 t p a s e ) 。 尽管它 们 属于同 一种蛋白 ( 基因) 家族( p类离子驱动的a t p酶) ， 在结构、功能和药理学 特 性 上 仍 然存 在很 大差 异 ( 张 云 和 薛 绍白1 9 9 3 ) 0 细胞质膜上钙泵的存在是 1 9 6 6年发现的。它是一种具有高度亲和力的钙 泵， 通过偶联a t p水解酶消耗a t p实现c a t 十 的 逆浓度转运， 对胞内的c a t 变 化敏感。 在 s n a i l神经元质膜上去极化引发的钙升高过程中，大约 4 0 %的进 入胞内的c a t 十 被此机制清除出细胞。 但是， 它将c a t + 泵出细胞的速率仍然未知。 而e r / s r 上钙泵s e r c a由 胞浆内 和细胞器内的c a t 浓度同时控制的。 c a t 的上升激发钙泵将 c 扩泵入内质网，而内质网中的游离 c 扩 填充程度则抑制 s e r c a钙泵。它的效率大约是消耗 l 分子的a t p来转运2 分子的c a t ，结合 常数大约是在0 .4 u m至1 . 1 11 m间， 最大转运速率在0 .5 到5 11 m o l / m g蛋白 / 分钟间。在各类细胞上己发现三类s e r c a基因的存在:s e r c a i 主要位于骨 骼肌上;而 s e r c a 2分布较广，其中 s e r c a 2 a主要位于心肌和平滑肌上， s e r c a 2 b主要位于脑中;对于s e r c a 3的研究还不很深入， 对于其意义不太 明了 ( m o o r e n b : 通 道 附近的 c a ; 上升; c :通道附 近c a p 浓度 上升的示意图。 放通道共同作用则会产生整体的细胞钙信号，肌肉就会收缩，这就是在同一个 细胞内钙信号的空间组织不同而激活完全相反反应的典型例子。一般来说，钙 信号的基本事件有两个功能，影响静息胞内钙水平和局部信号功能。 表1 .3一些典型的基本事件的分布和特性( 邹寿彬 e t a l . 2 0 0 0 ) 基 本 事 件 p u ff b u m p 组织分布钙通道5 0%钙峰 持续时间 2 5 0 ms 5 0 ms 参考文献 x e n o p u s o o c y t e l i mu l u s p h o t o r e c e p t o r s k e l e t a l mu s c l e c a r d i a c mu s c l e s mo o t h mu s c l e s mo o t h mu s c l e i p , r 1 p , r s mo g s y m p a t h e t i c n e u r o n r y r i r y r 2 r y r ( ? ) r y r ( ? ) r y r ( ? ) y a o e l a l 工 1 9 9 5 ) w o n g , k n i g h t 另一方面，通道之间也可以 通过c 工 c r 的过程来协调它们自 身的活动， 如图 1 - 4 所示。 p u ff 翻 亩 . . . . 日 . 1 七 图 1 - 4爪蟾卵 母细胞上的基本和整 体钙信号的 示意图。 a : i p 。 浓度处于低水平时， 少量 的 受体会促使少量c a 的 释放， 形成被称为b l i p s 的 根本事件。 b : i p a 浓度处于中 等 水平 时，一小群受体促使相对较多的c a 释放到胞浆中， 称为 p u f f s 。 但是由于周围的受体兴 奋性较低， 所以 钙信号不能够 传播开。 c : 高i p , 浓度时， 所有的受体 都处于可兴奋 状态。 p u f f s 作为启动点通过c i c r 的 过程产生整体的钙信号。 . 1 . 4 . 2钙信号的作用研究 1 .受精和发育 哺乳动物的生命开始于受精过程。研究发现，当精子和卵子结合时会产生 一个持续数小时的钙振荡。 这个长时间的反复的c a z + 脉冲会启动发育程序。它 有 两 种 截 然 不 同 的 振 荡 子 控 制 一 钙 振 荡 以 及 在 塑 鲍 全 型醚塑叁创丝迫鲤鳌 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 水 平。 其中 ， 钙 振荡 似 乎 才 是主 要的 机 制 ( b e r r id g e e t a l . 1 9 9 8 ) . 胚胎生长然后细胞群分化来执行特定功能时， 钙信号对身体极性和模式形 成起作用。例如，两栖动物和斑马鱼上，它帮助细胞确定产生开始于胚胎结构 顶 端( d o r s a l) 的 或是底部( v e n t r a l ) 的结构。当 这个顶 一 底结构轴形成后， 会伴随 有 自 发的 i p ; 水平上升， 与局限于少量细胞群上的出 现钙振荡峰相一致，它暗示 这些峰值可能会影响顶一 底轴的确定。 胚胎形成时，钙信号又一次被用来控制特定的细胞类型的分化。如在肌肉 的形成过程中自 发的钙上升控制了收缩机制的组装，在心脏的发育过程中，钙 依赖的细胞核激发t - c e l l 因子( n f - a t ) 帮助产生心脏隔膜和阀门。 钙信号也涉及到神经末梢的生长过程中，它还帮助控制神经元细胞的迁 移，以及帮助复杂神经网 络的 最初的配线( w i r i n g - u p ) 过程。 2 .细胞增殖( p r o l i f e r a t i o n ) 生长缺陷的细胞中可以观察到钙信号的变化，同样的现象还在一些癌症相 关的肿瘤细胞中存在。医生在临床的实践中也发现，c a t 内流抑制剂可以作用 于靶点，减缓特定攻击性很强的癌症细胞的生长。 3 .神经元 神经元中 c a 在接收和发送信号的过程中 起关键作用印 i v o t a l ) 。它还调节 着兴奋性和学习记忆过程中的改变。神经元上，原来一般认为钙信号主要来源 于外钙进入， 但是现在发现钙库中的释放也有很大的作用。 有许多例子都表明: 在某些地区，质膜可以与内质网相互作用从而产生空间局限性的信号，调控特 定功能;另一方面它们又可以产生整体的信号。另外， c a ? 也可以作用于细胞 核内，通过开关细胞核内的特定基因来产生长时程记忆( b e r r i d g e e t a l . 1 9 9 8 ) . 4 .细胞死亡 c a z + 信号的变化是细胞死亡过程中的必经步骤。它还在细胞的程序化凋亡 过程中起重要作用，而凋亡会涉及到正常生理的发育过程以及病理条件如 a i d s , a l z h e i m e r s d i e s e as e 和癌症等过程。例如b e l - 2 基因，在正常细胞内会 限制细胞的 增殖;在癌细胞中，b c 1 - 2的突变会阻止细胞死亡，使得细胞无限 繁殖。 而研究发现b c l - 2的防止细胞凋亡的功能是通过改变一些细胞器如内 质 网、 线粒体处理c a z 的方式来实现的( z h u e t a l . 1 9 9 9 ) . 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 1 . 5阿片类物质的研究进展 两千多年前，人们就发现婴粟属植物 p a p e v e r s o m n i f e r u m种子的液体可 以用于镇痛。1 8 0 5年 s e r t u r n e r从中提炼出吗啡( m o r p h i n e ) ，之后人们又从 其中提取出 其他的一些植物碱， 它们被统称为阿片剂( o p i a t e ) 。 近年来，人们 又引入阿片( o p i o i d ) 一词来统称那些具有类吗啡作用的阿片剂，以及不是由v 粟属植物提炼出来的、化学结构与吗啡不同但是具有与吗啡类似的药理作用的 化合物( 韩济生 1 9 9 3 ) 。 1 9 7 3 年，三个实验室同时独立地在哺乳动物脑中找到能与阿片样物质结合 并激发其效应的特定分子，即阿片受体。由于很难想象在动物体内会需要植物 碱的受体，所以人们猜想动物体内可能会有作用于这些受体的内源性物质。不 久， 他们发现具有阿片样活性的肤类， 内 啡肤( e n d o r p h i n ) 、 脑啡肤( e n k e p h a l i n ) 和强啡肤( d y n o r p h i n ) ，分别由前体蛋白 p r o o p i o m e l a n o c o r t i n 、前脑啡肤和 前强啡肤裂解而来。 阿片受体属于 g蛋白祸联受体，已发现的受体种类可以 分为卜 、 6 、 k 三大 类型。 各型的阿片受体还具有多 源性， 协 受体有协 ， 、 1 l 2 , 6 有6 】 、 s 2 , k 有k i . 等亚型，而各亚型中还可以划出次亚型，表 1 . 3列出了不同阿片受体的激动剂 和拮抗剂。 二 _ 表1 . ?. 不 同 r 7 受 1世激 动 m fq 1 a rn m 受体类型 p 激动剂 吗啡今轻戊甲吗啡 d a m g o f e n t a n y l s u f e n t a l e n d o m o r p h i n e p - e n d o r p h i n d y n o r p h i n 1 - 2 9 轻戊甲吗啡d p d p e d a d l e d d d p e d s l e t ( s z ) d e l t o r p h i n i i d y n o r p h i n a ( 1 - 8 ) ( m e t 5 卜 脑啡肤 轻戊甲吗啡u - 5 0 , 4 8 8 h 强啡肤( 1 - 1 3 ) b u t o r p h a n o l 强啡肤( 1 - 1 7 ) a - n e o e n d o r p h i n 拮抗剂 纳洛酮 c t o p 纳洛酮 n a l t r i d o l e i c i - 1 7 4 , 8 6 4 纳洛酮 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 * 专一性的作用是相对的。 轻戊甲 吗啡:e t o r p h i n e : 纳洛酮: n a l o x o n e ; c t o p : d - p e n - c y s - t y r - o r n - t h r - p e n - t h r - n h , ; d a d l e : d - a l a , d - l e u 工脑啡肤; d a m g o : d - a l a , n - m e - p h e - g l y 5 o l 卜脑啡肤: d d d p e : e d - p e n , d - p e n 卜脑啡肤; d p d p e : t y r - d - p e n - g l