（环境科学与工程专业论文）荧光分子探针制备、性能研究及其在环境分析化学中的应用.pdf

硕士学位论文 今后更多更好的荧光分子探针设计合成中发挥巨大的作用。本文在第4 章中对传 统荧光团葸进行了卤化修饰；在前人工作的基础上合成了中间体2 ，4 - 二羟基苯 乙酮，并利用它合成了分子内共轭电荷转移荧光化合物2 ，4 二羟基- 4 - ( n ，n - 二甲基氨基) 查尔酮，它们将在阴离子荧光分子探针的设计合成中发挥重要作用。 关键词：荧光分子探针；羟自由基；f e n t o n 反应系统；c u ( i i ) ；9 - 氯甲基葸； 查尔酮 a b s t r a c t w i t ht h er a p i dd e v e l o p m e n to fi n d u s t r y , m o r ea n dm o r et o x i ca n dh a r m f u l p o l l u t a n t sa r eb r o u g h ta b o u t ，s u c ha sh e a v ym e t a l s ，p e s t i c i d e s ，o r g a n i cc o m p o u n d s ，e t a 1 a n a l y z i n ga n dm o n i t o r i n gt h et r a c ep o l l u t a n t sb e c o m e sm o r ea n dm o r ei m p o r t a n ti n t h ef i e l d so f e n v i r o n m e n t a ls c i e n c ea n de n g i n e e r i n g t a k ea d v a n t a g eo f h i g hs e n s i t i v i t y a n ds e l e c t i v i t y , t f l n o r e s c e n c ea n a l y s i sw a sd e v e l o p e d , a n df l u o r e s c e n tp r o b eh a sb e e n w i d e l ya p p l i e di ne n v i r o n m e n t a la n a l y t i c a lc h e m i s t r y h y d r o x y lr a d i c a li sap o w e r f u lo x i d a n t i tr e a c t s1 航t hm o s to r g a n i cp o l l u t a n ta n d a l s ow i t hi n o r g a n i cc o m p o u n d s t h e r e f o r e ，h y d r o x y lr a d i c a lf r e q u e n t l yi n v o l v e di nt h e t r e a t m e n to fw a s t e w a t e r sb ya d v a n c e do x i d a t i o np r o c e s s e s ( a o p ) i ti sa l s ob e l i e v e d t h a th y d r o x y lr a d i c a li sa ni m p o r t a n ts p e c i e sf o ro x i d a t i o ni nb i o l o g i c a lp r o c e s s e s h o w e v e r , s o m eo ft h er e s u l t sr e m a i nc o n t r o v e r s i a ld u et ot h el a c ko far e l i a b l e d e t e c t i o nm e t h o df o rh y d r o x y lr a d i c a l i nc h a p t e rt w o ，af l u o r e s c e n c ep r o b e f o rh y d r o x y lr a d i c a la n a l y s i sb a s e do n a d d i t i o nr e a c t i o nb e t w e e nra n dh y d r o x y lr a d i c a lg e n e r a t e di nf e n t o ns y s t e m sw a s d e s c r i b e d i no p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h em e t h o dc a l lm o n i t o rh y d r o g e np e r o x i d ei nt h e r a n g eo f1 o x l o 6 1 o x l o s m o l l t h em e t h o dp r o v e dt ob eas i m p l ea n ds e n s i t i v e t e c h n i q u ef o rt h ed e t e r m i n a t i o no fh y d r o x y lr a d i c a l s ( o h ) t h ef l u o r e s c e n c e d e c r e m e n tw a sp r o p o r t i o n a lt ot h ea m o u n to fh y d r o x y lr a d i c a l sg e n e r a t e df r o mt h e r e a c t i o no ff e ( i i ) w i t hh 2 0 2 b a s e do nt h i sm e c h a n i s m ，an e wm e t h o df o r t h e d e t e r m i n a t i o no fh y d r o x y lr a d i c a l sh a sb e e nd e v e l o p e d t h ep r o p o s e dm e t h o dp r o v e d t ob es i m p l ea n ds e n s i t i v e a n di tm a y b eap o t e n t i a l l yp o w e r f u lt o o lt os t u d yt h e h y d r o x y lr a d i c a l si nb i o l c i 西c a lm a t e r i a l s c o p p e rf i m c t i o n sa sc a t a l y s t sf o re n z y m a t i ca c t i v i t yi nh u m a nb o d i e s d r i n k i n g w a t e rc o n t a i n i n gc o p p e ri nv e r ys m a l lq u a n t i t i e sm a ya c t u a l l yr e d u c et h ep o s s i b i l i t yo f d e f i c i e n c i e so fc o p p e ri nt h ed i e t h o w e v e r , w a t e rc o n t a i n i n ga m o u n t sh i g h e rt h a nl m g li sl i k e l yt os u p p l yt o om u c ho ft h i sm e t a l ，a n dt h e r ew i l lb e e nad a n g e ro f o v e r d o s ea n dt o x i ce f f e c tt oi n f a n t sa n dt op e o p l ew i t hc e r t a i nm e t a b o l i cd i s o r d e r s t h e r e f o r e ，i ti sn e c e s s a r yt of o u n de f f i c i e n tm e t h o d sf o rd e t e r m i n a t i o no fc u ( i i ) i o n s i na q u e o u ss o l u t i o n i nc h a p t e rt h r e e ，a nb i s a n t h r a c e n es c h i f fb a s ed e r i v a t i v e ，1 , 7 一b i s ( a n t h r a c e n ) 9 - y l m e t h y l e n e ( 8 a n t h ) ，w h i c hb e h a v e s a sf l u o r e s c e n c e p r o b e f o rt h es e l e c t i v e d e t e r m i n a t i o no fc u ( i i ) i o n si na q u e o u sm e d i u mw a ss y n t h e s i z e d t h er e s u l t so f s t u d i e so nt h ep r e p a r e df l u o r e s c e n c ep r o b es h o w st h a ti tr e s p o n s ee x t r e m e l yh i g h s e n s i t i v i t ya n ds e l e c t i v i t yt oc u ( i di o n so v e ro t h e rm e t a l s ，a n dt h ef o r m a t i o no f c o m p l e xb e t w e e nb a n t ha n dc u ( i i ) i o n sr e s u l ti nt h ef l u o r e s c e n c eq u e n c h i n g 1 1 1 e p r e p a r e df l u o r e s c e n c ep r o b ee x h i b i tl i n e a rr e s p o n s et oc u ( 1 i ) o v a rt h ec o n c e n t r a t i o nr a n g e f r o m3 0 1 0 。7t o1 0 1 0 一m o l l w i t had e t e c t i o nl i m i to f 4 0 x1 0 4m o l l 1 1 1 ep r e l i m i n a r y a p p l i c a t i o nr e s u l ts h o w st h a t 山ea m o u n to fc u ( i f ) i na q u e o u ss o l u t i o nc a nb ed e t e r m i n e d s u c c e s s f u l l yb yt h ep r e p a r e dp r o b e k e y w o r d s ：f l u o r e s c e n c ep r o b e ；h y d r o x y lr a d i c a l ；f e n t o ns y s t e m ；c u ( i i ) ； 9 - ( c h l o r o m e t h y l ) a n t h r a e e n e ；c h a l c o n e v 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献 的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法 律后果由本人承担。 作者签名： 耀华 日期：撕 年1 1 月加日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被 查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编 本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密囤。 ( 请在以上相应方框内打。”) 作者签名： 导师签名： 日期：沙刃年i i , e j 加日 日期：如0 7 年1 1 月2 - o e l岗蓼 朱冲 硕士学位论文 1 1 荧光分子探针概述 第1 章文献综述 环境分析化学是环境化学的重要组成部分，是环境监测的核心内容之一。同 时，环境分析化学又是分析化学的重要分支，它与分析化学的其它领域相比，具 有以下特点： 1 它的研究对象包括大气、水体、土壤、固体废弃物和生物体等，研究范围 十分广泛； 2 在环境中化学物质不仅本身多变，而且常常互相作用，在各环境介质中不 断发生迁移、转化，因此环境分析面对的是一个不稳定的动态系统； 3 进入环境的许多组分，其含量往往极其低微，因而环境分析所涉及的化学 物质多在痕量或超痕量水平。 由于这些特点的存在，使得环境分析化学引入了许多现代分析化学的尖端技 术，荧光分析法就是其中之一。与常用的分光光度法相比，荧光分析法具有如下 特点： 1 灵敏度高。荧光分析法中，荧光是从入射光的直角方向检测，即在黑暗背 景下检测荧光的增强( 或发射) ；而分光光度法是在入射光的直线方向检测，即 在明亮背景下检测光的减弱( 或吸收) ，因此，荧光分析法比通常的紫外和可见 光分光光度法的灵敏度高2 3 个数量级，检测限可达1 0 叫1 0 - 1 2 9 m l 。 2 选择性好。荧光光谱包括激发光谱和发射光谱。在用荧光分析法鉴定物质 时选择性更好，因为分光光度法只能得到待测物质的特征吸收光谱，而荧光光谱 法既能依据特征发射又能利用激发光谱或依据特征吸收来鉴定物质。 3 取样容易，试样需要量少。由于方法的灵敏度高，使试样的用量大大减少。 此外，荧光分析法还可以用于气体、固体和浑浊试样的分析。 4 能提供较多的物理参数。荧光分析法能提供包括激发光谱、发射光谱、荧 光强度、总荧光量、量子产率、荧光寿命、荧光偏振和斯托克斯位移等许多物理 参数，这些参数反映了被研究物质分子的各种特性，并且通过它们可以得到分子 的更多的信息。 一 荧光分子探针( f l u o r e s c e n t m o l e c u l a r p r o b e ) 是荧光分析法中经常使用的概念。 一般来说，凡是在一定体系内，当某种物质或体系的某一物理性质发生变化时， 该分子的荧光信号能发生相应的改变，这种分子就可称为某一物质或物理性质的 荧光分子探针【l 。2 1 。荧光分子探针在环境分析化学中的设计、应用与日俱增，占有 重要的地位。很多化学和生物化学领域的被分析物或物理性质都可以用荧光分析 法来检测，如有机污染物、金属离子、气体、湿度、p h 值等，其原因就在于荧光 分析法具有灵敏度高、取样量少以及可供选择的参数多而有利于提高方法的选择 性等优点。本论文主要研究的是金属c u ( i i ) 离子和羟自由基( 0 h ) 的荧光分子探 针的设计合成和应用，因此本章主要介绍运用荧光分子探针检测待测物时涉及的 基本概念，荧光分子探针的识别原理，探针分子的设计合成方法及其在环境分析 化学中应用，以及常用的荧光分子探针中间体的修饰，并对c u ( i i ) 离子荧光分子 探针和羟自由基的荧光分子探针研究的最新进展进行了概述。 1 1 1 基本概念【3 】 1 1 1 1 荧光 物质分子中具有不同的能级，电子分布于不同的能级中，当分子吸收紫外及 可见区电磁辐射后，它的电子能级由基态跃迁到激发态，处于激发态的电子不稳 定，一般又很快地以热能或电磁辐射形式将这部分能量释放出来，使激发态分子 回到基态。荧光就是处于激发态的分子返回基态过程中伴随着放射出来的一种光 能。当一个分子处于单重激发态的最低振动能级时，去活化过程以1 0 - 9 l o _ 7 s 时 间内发射一个光量子的形式返回到基态，这一过程称为荧光发射，此时发射出来 的光即为荧光。 1 1 1 2 激发光谱与发射光谱 改变激发光波长，在荧光最强的波长处测量荧光强度的变化，即以激发光波 长k 为横坐标，荧光强度i f 为纵坐标作图，便可以得到荧光物质的激发光谱。激 发光谱实质上就是荧光物质的吸收光谱。测量得到的激发光谱往往随仪器的不同 有所差异，但其形状与吸收光谱形状极为相似，经校正后的真实激发光谱不仅形 状相同，而且波长位置也一样。如果保持激发光波长和强度不变，测量不同波长 处荧光强度分布，以荧光波长丸。为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，便得到荧 光发射光谱或称荧光光谱。 1 1 1 3 荧光强度 荧光强度( f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t y ) 是指在一定条件下仪器所测的荧光物质发 射荧光强弱的一种量度。荧光物质所发射的荧光无固定方向，而实际中所测量的 是某一方向的荧光，它除与物质本身的荧光量子产率有关外，还与介质、环境、 仪器性能等因素有关。物质吸收光越多。处于激发态的分子越多，发出的荧光强 度就越强，可以用数学表达式表达荧光强度( f ) 与其影响因素的关系 f = 2 3 0 f l o b c 式中：f 为荧光强度；铆为荧光量子产率；1 0 为照射到被测物质上的光强度； 为物质的摩尔光吸收系数；b 为检测池厚度：c 为物质浓度。 在荧光测定中，荧光强度应该与入射光强度和被测物质浓度成正比例。但从 2 硕士学位论文 上式可以看出，在荧光物质浓度很小的情况下，产生的荧光强度才与溶液中物质 浓度成正比，但是，当浓度增大到一定程度，荧光强度增加不再成线形关系，而 常常随浓度的增加而下降。 1 1 1 4 荧光量子产率和荧光寿命 荧光量子产率( f l u o r e s c e n c eq u a n t u my i e l d ) 也称为荧光效率，是物质的固有 属性，理论上定义为荧光物质吸收光后所发射的荧光光子数与吸收的激发光子数 之比，即 中f = 发射的荧光光子数吸收激发光的光子数 在同一浓度下，o f 越大，荧光强度越大，由于激发分子的去活化过程还包括 非辐射跃迁，因此啡通常小于l 。在荧光检测中，有分析应用价值的荧光试剂或 其他物质的o f 应该为0 1 以上。 荧光寿命( 1 i f co f f l u o r e s c e n c e ) 可以用下式测定： l n f o l n f f = 一仃 f o 和f t 分别代表t - - o 和t = i t 时的荧光强度，通过实验测量不同时间的f t 值，确 定其关系曲线，其斜率就是荧光寿命。 1 1 2 荧光与分子结构的关系 4 1 荧光的产生涉及吸收辐射和激发态分子发射辐射两个过程。对强荧光物质， 其结构往往具有下列特点。 ( i ) 兀一兀跃迁类型有利于发射荧光 大多荧光物质都是由尢一兀或n 一霄跃迁到激发态，再经电磁辐射或非电磁辐 射方式跃迁到达第一激发态的振动能级上，再经丌。一兀或冗一n 跃迁而发射荧 光。由于丌一丌跃迁的e 值要比兀一n 跃迁大l0 2 1 0 3 倍，而且跃迁寿命要短1 0 2 s ， 因此霄一兀跃迁的荧光量子产率高，有利于荧光的发射。 ( 2 ) 发光分子中要具有共轭兀键体系 共轭的程度越大，离域兀电子越容易激发，分子发光越易产生。如线性多环 芳烃苯、萘、蒽、并四苯的荧光发射量子产率依次为0 1 1 、o 2 9 、o 4 6 、o 6 0 ，荧 光峰波长依次为2 7 8 m n 、3 2 1 r i m 、4 0 0 h m 、4 8 0 h m 。 ( 3 ) 具有刚性结构平面的分子有利于荧光发射 分子的共平面性愈大，其有效的兀电子离域也愈大，也即兀电子的共轭程度越 大，荧光的量子产率也将越大，荧光波长也移向长波方向。这主要是由于分子的 刚性平面结构减少了分子振动，减少了体系间跨越跃迁到三重态及碰撞去活化的 可能性，而分子缺乏刚性可使内部转换的速度增大，非刚性分子的一部分相对于 其他部分可作低频振动，造成某些能量损失，结果增加了非辐射去活化的可能性。 ( 4 ) 取代基对分子荧光有显著影响，有以下一些规律。 给电子基团的存在会加强荧光发射。作用特别明显的是一n h 2 和一o h ，由于 n 电子的电子云与芳环上的兀电子轨道平行，共享了共轭兀电子结构，扩大了共轭 双键体系。这些取代基为酸基或碱基，在酸碱介质中易转化为相应盐，使荧光变 弱。 吸电子基团，如- c o o h 、- c h o 、n 0 2 、- n = n 一等的存在会使荧光强度减 弱。有的r l 电子不与芳环上的兀电子云共平面，这类化合物一般n 一兀是禁戒跃迁， 单重激发态s l 为n 一冗型，s l t l 之间的跨越强烈。 取代基位置对荧光的影响。对于芳香烃而言，一般邻、对位取代基增强荧 光，问位取代基抑制荧光( - - c n 取代基例外) 。当取代基存在使共轭增加时，取 代基的影响下降。当两取代基共存时，可能其中一个起主导作用。 重原子取代基存在时，会使荧光减弱，磷光增强，这个效应称为内重原子 效应( i n t e r n a lh e a v y a t o me f f e c t ) 这主要是因为重原子的存在使荧光体的电子 自旋一轨道耦合作用加强，s l t 1 之间的跨越明显增强的缘故。 1 1 - 3 荧光定量分析的各种条件 在荧光定量分析中，必须根据试样的种类、待测成分的浓度、共存物质的种 类及其浓度选择适当的荧光反应类型和操作条件，选择准则一般是荧光强度高、 影响荧光强度的因素少、分析的精密度高等。为了确定荧光分析的最佳工作条件， 应考察p h 值、温度、试剂用量、溶剂种类与用量、荧光化合物的稳定性等因素的 影响及其消除方法。试剂的纯度也是不可忽视的因素，此外还必须准确测定待测 组分的激发和发射光谱。 1 溶剂 同一种荧光物质在不同的溶剂中，其荧光光谱的位置和荧光强度都可能会有 显著的不同。如果溶剂和荧光物质之间形成了化合物或溶剂使荧光物质的电离状 态改变，则荧光峰的波长和荧光强度都会发生很大的变化。从应用的角度来讲， 对于溶剂主要考虑三个因素：溶剂的选择要适当；溶剂应有足够的纯度：溶剂特 别是混合溶剂，有时往往更有利于提高荧光物质的荧光强度。 2 试剂 荧光分析所用的试剂纯度是十分重要的，即使是特级试剂，其中极少量的杂 质有时也会与荧光分子探针反应，并产生荧光或猝灭荧光而造成错误的分析结果； 试剂长期放置有时会分解，溶解在试剂溶液中的氧具有猝灭荧光作用，从而影响 荧光光谱的形状和荧光强度。因此，实际工作中往往需要针对各种试剂的特征， 认真研究它们的保存条件。实验中各种试剂一般都需要提纯要注意做空白试验， 配制水溶液时必须使用去离子水或二次蒸馏水 4 3 p h 值 溶液的p h 值对荧光物质的荧光光谱以及荧光强度具有很大影响，进行定量分 析时，必须选择最佳p h 范围。荧光物质为弱碱或弱酸时，溶液的p h 值的改变，会 使其电离状态发生变化，从而影响其荧光光谱和荧光强度。对于金属离子与有机 试剂形成的荧光络合物，溶液的p h 值改变还会影响到络合物组成的改变，从而影 响到它们的荧光性质。 4 温度 一般来说，溶液随温度降低而荧光效率升高、荧光强度增大，这是由于温度 降低时，介质的粘度增大，荧光物质分子与溶剂分子的碰撞随之减少的缘故。由 于激发光源产生的热量，容易导致温度的变化，有时一分钟可以上升8 1 0 c ，因 此，在精确测定时应备有恒温池架，以恒定温度。实际工作中，一般控制在2 0 2 5 ( 2 范围内。需要注意的是，有时有些反应速度较慢，往往要加热才能使反应完 全。 5 荧光物质的稳定性 在激发光的直接照射下，有些荧光物质不稳定，当连续地用激发光照射时， 因荧光物质的光分解或聚合，会使荧光强度减弱。对于这些荧光强度不太稳定的 成分应尽快测定，不要经常开启光闸，使光分解现象尽量减少。生成荧光物质的 反应速度和荧光物质的稳定性及其化学结构有关，不同结构之间的差别较大。在 定量测定之前，必须认真考察荧光物质的稳定性。 6 共存物质的影响 在定量分析中，共存物质的干扰主要有以下几个方面：共存物的荧光猝灭作 用，共存物质产生背景荧光，共存物质与荧光物质发生反应、共存物质吸收激发 光或荧光使荧光强度减弱等。遇到这些情况必须采取相应的措施，消除其干扰。 共存物质的存在，会影响荧光分析的定量测定，实际工作中应认真分析其影响原 因，不可轻易放过。有时往往因此发现新类型的荧光反应。 1 1 4 荧光分子探针性能的评价标准 通常评价荧光分子探针的性能应主要考虑其灵敏度、选择性、实时性和原位 检测性能等四方面因素。其中，影响灵敏性的因素有许多：首先，探针分子与被 检测物的结合强度是识别灵敏的前提；其次，识别信息的荧光信号转换效率同样 影响识别灵敏性，荧光增强的探针一般会比荧光猝灭的探针灵敏性高；另外，荧 光团的发射波长、量子产率、斯托克斯位移、背景荧光干扰等也会影响探针的检 测灵敏性，灵敏性还与仪器性能有关。而选择性则主要取决于探针分子与被检测 物的特异性的结合，有时某些被结合的客体可直接影响荧光团的发射性能，这种 情况下识别选择性还与其结合的客体性质有关，当然，专一选择性是最好的。实 荧光分子探针的制备、性能研究及其在环境分析化学中的应用 时性主要包括识别响应的速度和可逆性两个方面，如果可逆响应的速度快于被检 测客体的变化速度相匹配，则可称之为实时响应探针；原位检测性能主要取决于 探针分子与被检测体系的相溶性，探针应能以独立的分子状态分散于被检测体系 并发出识别信号。 1 2 荧光分子探针的识别原理 1 2 1 光诱导电子转移p 7 1 ( p e t ，p h o t o i n d u c e de l e c t r o nt r a n s f e r ) 各种阳离子荧光分子探针中，利用p e t 原理设计的荧光分子探针最为常见 这类探针设计原理明确，特别是对于碱金属、碱土金属和氢离子通常都可以获得 荧光增强的探针。典型的p e t 荧光探针体系是由具有电子给予能力的识别基团 ( r e c e p t o r ) ，通过连接基团( s p a c e r ) 和荧光基团( f l u o r o p h o r e ) 相连而构成的 功能分子其中识别基团的功能是结合客体并将结合信息传递给荧光团；荧光团 是光吸收和荧光发射的场所，并且它的荧光发射强度与识别基团的结合状态相关： 这两个部分与连接基团相连构成一个分子，并且使识别信息有效的转化为荧光强 度变化。 在p e t 荧光分子探针中，识别基团与荧光团之间的识别信息与光信号之间的 转化是靠光诱导电子转移完成的。大多数p e t 荧光分子探针的设计是基于识别基 团( 受体) 与待测物质( 客体) 的结合，使p e t 过程受到抑制、荧光团荧光恢复 的原理设计的。其具体工作过程如下：具有电子给予能力的识别基团能够将处于 最高能级的电子转入激发态荧光团因电子激发而空出的电子轨道，使被光激发的 电子无法直接跃迁回原基态轨道发射荧光，导致荧光团的荧光猝灭；然而，当识 别基团与客体结合后，降低了识别基团的给电子能力，p e t 过程被减弱或不再发 生，使荧光团的荧光发射增强。因此在未结合客体之前，探针分子不发射荧光， 或荧光很弱，一旦受体与客体结合，荧光团就会恢复发射出荧光。 1 2 2 分子内共扼电荷转移【6 3 9 1 ( i c t ，i n t r a m o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e r ) 典型的i c t 荧光分子探针是由荧光团与识别基团直接相连构成。在荧光团的 两边分别连有吸电子基团( 电子受体) 与供电子基团( 电子给体) ，并且供电子 基团或吸电子基团本身又充当识别基团或识别基团的一部分。当荧光团被激发后， 会进一步增加分子内从电子给体到电子受体的电荷转移。当识别基团与客体结合 后，会对荧光团的推拉电子体系产生影响，或是减弱分子内电荷转移，或是强化 电荷转移，从而导致荧光光谱的变化，主要表现为荧光光谱红移或蓝移。一般情 况下，i c t 荧光分子探针对荧光强度的影响不如p e t 探针那么显著。 在i c t 中，有一种情况被称为扭曲的分子内电荷转移( t i c t ，t w i s t e d i n t r a m o l e c u l a rc h a r g e t r a n s f e r ) ，在具有推一拉电子共振体系的荧光分子中，如果 6 硕士学位论文 推电子基( 如二甲氨基) 是通过单键与荧光团相连的，当荧光团被光子激发时， 由于强烈的分子内光诱导电荷转移，导致原来与芳环共平面的电子给体绕单键旋 转，而与芳环平面处于正交状态，原来的共振系统被破坏，部分电荷转移变为完 全的电子转移，形成t i c t 激发。当形成t i c t 激发时，原有的i c t 荧光则被猝灭。 t i c t 态常常不发射或发射弱的长波荧光，少数情况下出现i c t 与t i c t 双重荧光现 象。 c o s n a r d 等设计合成了一种典型的i c t 荧光探针，氮杂冠醚既是识别基团，同 时也是推一拉电子体系的电子给体。当冠醚与碱土金属离子( 如c a ( i i ) 离子) 络合 时，由于金属离子的拉电子效应，降低了冠醚氮原子的供电子能力，因此发生荧 光蓝移，且荧光增强。识别基团为电子接受体的i c t 荧光探针也有报道，在该i c t 荧光探针分子处于未结合状态时，二甲氨基和氮杂冠醚部分均为电子给体；当冠 醚与碱土金属c a 0 0 络合后，拉电子能力增强，使探针转化成推一拉电子体系，荧 光发生红移。在v a l c u r 设计合成的i c t 荧光探针分子中，苯并冠醚识别基团与香豆 素荧光团是间接相连的，但当钙离子与之结合时荧光波长显著红移、强度略有猝 灭。这种现象出现可以设想是荧光团中羰基氧参与了配位，促进了荧光团的电荷 转移。多数i c t 荧光探针在结合客体后，荧光光谱移动在2 0 r i m 左右，荧光强度变 化不明显。 1 2 3 激基缔合物1 0 i ( e x e i m e r ) 当两个相同的荧光团，如多环芳烃萘、葸和芘等连接到一个受体分子的合适 位置时，其中一个被激发的荧光团( 单体) 会和另一个处于基态的荧光团形成分 子内激基缔合物。它的发射光谱不同于单体，表现为一个新的、宽而强的、长波 无精细结构的发射峰。由于形成这种激基缔合物需要激发态分子与基态分子达到 “碰撞”距离3 5 a ，因此荧光团间的距离是激基缔合物形成和破坏的关键。所以 利用各种分子问的作用力改变两个荧光团间的距离，如用结合客体前后单体激基 缔合物的荧光光谱变化表达客体被识别信息。萘、葸、芘等荧光团由于具有较长 的激发单线态寿命，易形成激基缔合物，常常被用于设计此类探针。 p a r k e r 等设计合成了一种荧光分子探针，通过酰胺连结了4 个萘分子，z n ( 1 1 ) 进入分子空腔，改变四个萘荧光团的位置，导致激基缔合物荧光增强，k u b o 等 设计合成了一种氮杂冠醚上连有两个芘荧光发射基团的荧光分子探针，当氮杂冠 醚络合k ( i ) 或b a 0 0 后会使荧光增强，同时单体激基缔合物的荧光强度比发生了 变化。k a w a k a m i 等设计合成了一种两个萘荧光团通过聚醚键连接的荧光分子探 针，碱土金属离子c “i i ) 、b “1 1 ) 可以与氧乙烯上的多个氧原子及酯键上的氧原子 络合，造成链的收缩，使两个萘环得以靠近，促进激基缔合物的形成，使萘单体 发射荧光减弱。j i n 等设计合成了一个以杯芳烃为识别基的荧光离子探针，当锂离 7 子被结合时，单体荧光增强，激基缔合物的荧光强度减弱。 1 2 4 荧光共振能量转移【m 1 2 l ( f i 也t ，f l u o r e s c e n c er e s o n a t ee n e r g y t r a n s f e r ) 当能量给体荧光团d 与能量受体荧光团a 相隔的距离远大于d - a 的碰撞直径 时，只要d 与a 的基态和第一激发态两者的振动能级间能量差相当，或者说d 的发 射光谱与a 吸收光谱能有效的重叠，就能够发生从d 到a 的非辐射能量转移，又称 为长距离能量转移。但实际上d a 发射能量转移的条件是很苛刻的，两者除了光 谱重叠外，还必须以适当的方式排列a 可以是荧光团，也可以是荧光淬灭团。 对于前一种形式，激发d 时，由于能量转移，将观察到a 的荧光发射；而后一种情 形，只能观察到d 的荧光被a 淬灭的情况。 p e a r c e 等用多肽将罗丹明b 和氨基香豆素连接合成了一种典型的f r e t 荧光 分子探针，氨基香豆素的激发和发射的波长分别是4 0 9 r i m 和4 7 3 n m ，而罗丹明b 的 激发和发射波长分别是5 6 8 n m 和5 8 3 n m ，在中性缓冲溶液中，当n i ( i i ) 被两个荧光 基团间的氨基酸残基结合后，两个荧光团问的距离缩小，f r e t 显著。当用波长为 4 0 9 r i m 的光激发香豆素时，随着n i ( i i ) 浓度的增加。在5 8 3 n m 罗丹明b 的发射光谱 逐渐增强。 w a n g 等将葸与查尔酮两个不同的荧光团用脂肪胺长链连接成一个荧光分子 探针，分子中的脂肪叔胺能够通过p e t 猝灭葸的荧光。在酸性条件下，该p e t 过 程被阻止，但葱被激发后并不发荧光，而是将能量传递给查尔酮使其发荧光。 c a s a 等设计了一种荧光分子探针体系，包含三氨乙基胺衍生物和羧基香豆素 两种不同的荧光团，其中三氨乙基胺衍生物是一个络合锌离子促使荧光发射的 p e t 荧光分子探针：当溶液中含有羧基香豆素时。它能够与锌离子络合使之与荧 光团萘十分靠近，发生能量转移。当用短波激发萘时，主要发射的是香豆素的荧 光。 1 2 5 基于其它原理设计的荧光分子探针 除了上述几种设计原理以外，也有一些荧光分子探针是按照其它原理设计， 甚至是意外所得，但效果却非常好。 c h e n 等合成了一种本身荧光很弱的荧光分子探针，然而该荧光分子探针在 乙腈溶液中对铅离子具有选择性荧光增强识别效果。识别过程中荧光增强4 0 倍并 有1 5 n m 的荧光红移，这种识别现象是铅离子配位时影响了探针分子的光诱导分子 内电荷转移及分子的构象刚性的结果。 h e n a r i c h 等合成了一种对汞离子具有选择性化学反应的荧光分子探针，在该 探针的乙腈溶液中加入汞离子后荧光显著增强( 3 4 倍) 并红移，进一步研究结果 8 表明，该荧光分子探针是不可逆的化学计量性的识别分子。 1 3 荧光分子探针的设计合成 1 3 - 1 5 】 1 3 1 荧光团的选择 荧光分子探针中的荧光团通过给出荧光强度的增强和减弱，以及荧光峰值波 长的位移等信息来反映微观世界的分子识别作用。然而，尽管关于荧光化分子探 针的研究工作比较多，但荧光分子探针中所用的荧光团却非常有限，主要为荧光 素类衍生物、多环芳烃类化合物及其他可以发荧光的有机化合物和金属配合物等。 寻找灵敏度高、选择性好、对光稳定、量子产率高、可用于设计合成荧光分子探 针的新型荧光团，对于荧光分子探针的研制是非常重要的。目前设计荧光分子探 针常用的荧光团有葸【1 6 - 2 0 、芘【2 卜2 2 1 、l ，8 萘酰亚胺 2 3 。6 】、荧光素1 2 7 1 、罗丹明口耵、 查尔酮【2 9 j 和香豆素【3 l 】等。 以葸、芘为主要代表的稠环芳烃类一般都是具有强而稳定的荧光，在荧光分 子探研究针领域里，它们作为结构最简单的荧光团经常用于基础理论的研究。特 别重要的是，蒽、芘能产生激基缔合物荧光这一特征是其它种类荧光团不具备的。 到目前为止，基予激基缔合物原理设计的探针，绝大多数都是以葸和芘作为荧光 团的，但是这类荧光团往往具有致癌性，吸收波在紫外区，大大限制了其作为生 物荧光分子探针的应用。 1 ，8 萘酰亚胺是由l ，8 萘酸酐和伯胺缩合后生成的。1 ，8 萘酸酐本身是一个 荧光发射团，但荧光微弱，如果萘环上有给电子基团，就形成了荧光团。但若是 吸电子基团，则不显示荧光。这类荧光团的分子结构有共同的特点：具有较大的 共轭体系；分子结构中一端具有强的给电子基团，另一端具有强的吸电子基团， 因此，其分子结构中存在着一大的。吸供电子共轭体系”。处于这样体系中的电 子很易受到光的照射而发生跃迁，从而产生荧光，特别是4 位有强烈供电子基( 如 氨基) 的衍生物都能够发射很强的荧光，其光化学与光物理特点是光稳定性好、 荧光发射波长适中且s t o c k s 位移大。目前国内外有关1 ，8 - 萘酞亚胺类化合合物的 研究主要集中在亚胺的变化和萘环的修饰上。 荧光素和罗丹明都是非常重要的荧光染料，其特点是荧光量子效率高，因此 在生物医学用荧光探针领域应用非常广泛。但是，它们的缺点也很明显，其s t o c k s 位移小，对环境因素如p h 值、温度等很敏感，特别是p h 值，它们不适合在中性 和酸性条件下使用；而且当它们与生物大分子结合后，荧光猝灭非常严重，达 6 0 9 0 。尽管如此由于目前还没有合适的替代品，它们在生物医学上的应用仍然 是应用最广泛的荧光团。 查尔酮和香豆素是典型分子内共轭的电荷转移化合物，是另一类发光物种， 9 荧光分子探针的制备、性能研究及其在环境分析化学中的应用 无论它们是处于基态或激发态，它们的分子都表现为极化结构，一端偏正，而另 一端偏负。这类化合物的分子内存在。推电子”和“拉电子”两个部分。它们在 基态时就具有极化结构，而在光照激发后则更进一步强化了这种极化特征。当荧 光分子探针在接受外来物种后，则将因所接受物种与发光的荧光团间位置的不同， 而引起发光化合物荧光发射行为的变化。这是由于外来物种的引入导致发光化合 物分子内电荷的重新分布，以及化合物在不同位置接受外来物种时所引起的i c t 能级的变化。所有这些都将十分灵敏的在其发光强度和能量上反映出来。因此， 分子内共轭的电荷转移化合物被广泛用作荧光分子探针的荧光基团。由于分子内 共轭的电荷转移化合物两端存在着不同的极性基团，因此当将它们用作为荧光团 时，必须考虑如何与其相联结以完成其作为敏感荧光基团目的问题。 1 3 2 受体部分的选择 荧光分子探针中的受体部分( 识别基团) 是体现探针分子识别功能的主要部 分。受体部分对客体的识别不仅限于对金属阳离子( 包括碱金属，碱土金属以及 过渡金属离子) 而且也涉及阴离子和中性分子等，对于不同类别化学物质的识别 有其特定的要求。为了能实现高度的专一性识别，在对受体的选择和设计时，关 键是要实现接受体与识别物种间的高度互补，其中包括形状，尺寸以及作用点( 或 键合点) 分布等的相互匹配，这是极为重要的。因此，设计合成具有作用点合理 排布的三维结构体系，可认为是分子接受体的设计中最高标准所在，但目前荧光 分子探针的研究状况离这一要求还有一定距离。在荧光分子探针的设计合成中， 常用的识别基团有冠酬3 2 枷】、开链聚醚 4 1 - 4 3 】、多乙烯多胺【槔蜘、环糊精【4 7 1 、杯芳 烃 4 - 4 9 1 、多肽 5 0 - 5 1 j 等。 冠醚类受体( 包括单环冠醚，穴醚，开链冠醚) 对阳离子客体有较好的亲和 性，主要用于碱金属，碱土金属及氢氧根离子的识别。冠醚对阳离子的选择性主 要由冠醚中的杂原子( 氧，硫，氮) 与金属离子的配位作用，以及冠醚孔穴的尺 寸决定。冠醚与荧光化合物分子以不同方式结合，当冠醚络合了阳离子后，对整 个体系引起扰动，进而影响其光物理性能，提供出相关的信息。 全氧杂冠醚一般的含氧数为4 1 0 个，可与l i + 、n a + 、n h 4 + 、c s + 、a g + 、a u + 、 c a z + 、s r z + 、b a ”、c d 2 + 、h g 。、p b ”等形成络合物。冠醚荧光分子探针的合成， 大多是利用苯并冠醚的苯环的反应活性、芳环上取代基的反应活性，或通过冠醚 环外侧链上的脂肪族反应性基团将荧光团引入。 氮杂冠醚按环中氮原子的数量可分为单氮杂冠醚、双氮杂冠醚、多氮杂冠醚 和全氮杂冠醚( 大环多胺) 氮杂冠醚由于空腔及杂原子的不同，表现出对不同 的金属离子显著的选择性。不仅因为它的配位选择性，同时氮杂冠醚与荧光团连 接方便，并且识别信息容易通过p e t 、i c t 等方式影响荧光信号。所以这类冠醚在 l o 硕士学位论文 荧光分子探针中应用最为广泛。 冠醚中的氧原子为硬碱，对碱金属和碱土金属离子有较强的络合作用；硫原 子为软碱，当冠醚中部分氧原子被硫原子所替代后对重金属或过渡金属离子有特 异的络合能力，能形成稳定的络合物。 环糊精是继冠醚后的第二代受体。环糊精是由葡萄糖通过l ，4 糖苷键相连形 成的一类筒状化合物，其内腔疏水而外部亲水。一般是将荧光团连接在环糊精上， 在水溶液中，荧光团进入环糊精的疏水空腔，在与受体结合时，客体将荧光团从 空腔中逐出，导致荧光变化。这类探针多用来识别中性分子。进入环糊精内腔的 有机体分子往往处于某种强制取向或受制约的构象状态。对于处于环糊精内腔的 荧光团化合物。其光物理、光化学性质会受到环糊精内腔尺寸和极性的影响，可 能会不同于处于自由状态的分子。 对环糊精极其敏感的荧光化合物，比如丹磺酞胺( d n s ) ，常常与环糊精联用。 或者直接将荧光化合物键连在环糊精上，可识别不同种类的外来客体物种。在水 溶液中，d n s 进入环糊精内腔发射强荧光，当加入外来客体时，d n s 不断离开环 糊精内腔，进入强极性的水溶液中使其荧光强度