（应用化学专业论文）多胺与DNA相互作用的研究.pdf

中国日用化学工业研究院硕十学位论文 摘要 将重组的d n a 缩拢成致密的小球送入细胞的过程是实现基因转染的关键步骤。某 些分子在水溶液中达到一定浓度、温度或改变溶剂性质时，就有可能与d n a 相互作用 形成复合物，并诱导d n a 构象发生由线圈到小球的转变。阳离子表面活性剂通过静电 引力诱导d n a 发生舒展线圈状向紧密小球状的构象转变。但是由于阳离子表面活性剂 的生物毒性及与d n a 相互作用程度的不可控性等缺点限制了其可能的应用。 多胺可以诱导d n a 发生缩拢、聚集、沉淀甚至二级结构的转变，并且由于其生源 性及特定的生物功能避免了阳离子表面活性剂的缺点。国外已用多种方法进行了深入研 究，如圆二色谱法、核磁共振、傅立叶拉曼变换光谱、原子力显微镜等，由于多胺和d n a 相互作用的微观过程十分复杂，并且基因转染步骤中的不同条件( 如细胞内外n a + 、k + 离子浓度的差异等) 对二者相互作用的影响也很大，因此有必要从不同的角度对二者的 相互作用进行考查。本论文在前人工作的基础上通过浊度法、相图、紫外光谱法和z e t a 电位法对精胺与d n a 的相互作用进行了考察。结果表明：多胺与d n a 之间不仅存在着 强烈的静电作用，同时多胺与d n a 碱基对之间也存在着相互作用；多胺所带正电荷越 多，与d n a 的作用越强烈，水溶液条件下亚精胺( s p d ) 、盐酸胍( g d ) 与d n a 有较弱 的相互作用，但不能使d n a 产生相分离；加入n a c l 后，由于外加电解质的静电屏蔽效 应，s p m 与d n a 之间的相互作用减弱，n a c l 浓度越大，二者之间相互作用越弱， s p m d n a 体系的相图曲线线性相关性越低。并且c e + 、m 矿+ 的屏蔽作用大于k + 、n a + 。 p h 的升高使多胺d n a 的相互作用减弱。 本论文还对多胺、表面活性剂与d n a 的相互作用进行了比较。结果表明：表面活 性剂与d n a 的相互作用以静电作用和疏水缔合为主导，而多胺与d n a 相互作用过程中 静电作用力是唯一的驱动力。由于缔合机理的差异，盐效应也不完全相同。阳离子表面 活性剂d n a 体系在低d n a 浓度下，少量n a c i 加入加强二者相互作用；高d n a 浓度 下，n a c l 加入屏蔽二者相互作用；n a c i 浓度过高时，二者相互作用减弱。对于两性 表面活性剂d n a 体系，n a c l 的加入加强二者相互作用。多胺d n a 体系，由于屏蔽效 应，n a c l 的加入，二者相互作用减弱。通过本论文的研究期望对扩展多胺在生命科学领 域的应用起到一定作用。 关键词：多胺，d n a ，相互作用，盐效应 中国日用化学工业研究院 硕士学位论文 a b s t r a c t t h ec o m p a c t i o no fd n at o n a n o p a r t i c l e si s ab i o l o g i c a l l yi m p o r t a n tp h e n o m e n o n i n v o l v e di nt h eg e n et r a n s f e r i n g s o m em o l e c u l a rc a l li n d u c et h ec o n f o r m a t i o no fd n a c h a n g i n gf o r mu n f o l d e dc o i lt oc o m p a c t e dg l o u b ei na q u e o u ss o l u t i o na ts p e c i f i ec o n d i t i o n s m a n yp a p e r sh a v ed i s c u s s e dt h ep h e n o m e n o no fd n ac o m b i n e dw i t ho p p o s i t c l yc h a r g e d c a t i o n i cs u r f a c t a n t sb ye l e c t r o s t a t i ca t t r a c t i o n a n dt h ec o n f o r m a t i o no fd n ac h a n g i n gf r o m u n f o l d e dc o i lt oc o m p a c t e dm o b u l e b u ts o m ed i s a d v a n t a g e s ，s u c ha sc e l lt o x i c i t ya n d u n c o n t r o l l a b l ec o m b i n a t i o n , r e s t r i c tt h ep o t e n t i a l a p p l i c a t i o no fc a t i o n i cs u r f a c t a n t d n a c o m p l e x i ti saf a c tt h a tt h ep o l y a m i n e sf a c i l i t a t et h eb zt r a n s i t i o no fd n aa n di n d u c et h e c o n d e n s a t i o no fd n at oc o m p a c to r d e r e df o r m s w h i l ea v o i d i n gt h ed i s a d v a n t a g e so fc a t i o n i e s u r f a c t a n t sb e c a u s eo f i t sb i o l o g i cf u n c t i o i l s i n v e s t i g a t i o n so f p o l y a m i n e s - d n a h a v ei n c l u d e d e l e c t r o n i cc i r c u l a rd i c h r o i s ms p e c t r o s c o p v n m r ，f o u r i e rt r a n s f o r n lr a n l a ns t u d y ，a t o m i e f o r c em i c r o s c o p i cs t u d y ，e ta 1 n o to n l yt h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e np o l y a m i n ea n dd n aa r e c o m p l i c a t e d ，b u ta l s ot h ec o n d i t i o n so fd i f f e r e n tg e n et r a n s f e rs t 印a l ev a r i o u s s oi t i s n e c e s s a r yt oh a v e s t i g a t et h ei n t e r a c t i o n sf r o md i s s i m i l a ra s p e c t s b a s e do nt h ep r e v i o u sr e s u l t s ， w es t u d i e do nt h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nd n aa n dp o l y a m i n eb yt h em e t h o d so f t u r b i d i t y , p h a s ed i a g r a m u v s p e c t r u ma n dz e t ap o t e n t i a l n er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e r ei s e l e c t r o s t a t i ca t t r a c t i o nb e t w e e ns p ma n dd n a a n dt h e r ea r ea l s oi n t e r a c t i o n sb e t w e e ns p m a n dd n ab a s ep a i r t h eh i 曲e l v a l e n c eo fp o l y a m i n ei s ，t h es t r o n g e ri n t e r a c t i o no fs y s t e mi s i i la q u e o u ss o l u t i o n , i n t e r a c t i o n sb e t w e e nd n aa n ds p d g da r ew e a k e r , a n dc a nn o tl e a dt o t h ep h u s es e p a r a t i o n p u t t i n gh an a c l t h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e ns p ma n dd n aw i l lb eb a f f l e d b e c a u s eo fe l e c t r o s t a t i c - s e r e e n i n ge 虢c t n e1 1 i 曲e rn a c lc o n c e n t r a t i o ni s ，t h ew e a k e r i n t e r a c t i o ni sa n dl i n e a r i t yr e l a t i v i t vo ft h ep h a s ec b r v eo fs y s t e mr e d u c e s t l l er e s u l t so fz e t a p o t e n t i a la l s oi n d i c a t e dt h a te l e c t r o s t a t i cs c r e e ne f f e e to fc a _ ”a n dm + a r es t r o n g e rt h a nt h a t o fk + a n dn a 十t h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e np o l y a m i n ea n dd n aw i l lb eb a f f i e di ft h ep ho ft h e s y e t e mr i s e s t 1 1 i s p a d e r d i s c u s s e dt h ed i f f e r e n c eb e t w e e nt h es u r f a c t a n t d n as y s t e ma n d p o l y a m i n e d n as y s t e me i t h e r t h es u r f a c t a n t d n ac o m p l e xi si n d u c e db ye l e c t r o s t a i ca n d h y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o nw h i l et h ep o l y a m i n e d n ac o m p l e xi si n d u c e dj u s tb ye l e c t r o s t a i c i n t e r a c t i o n a st h ev a r i o u sm e c h a n i s mo fi n t e r a c t i o n , t h es a l te f f e c ti sd i f f e r e n tb e t w e e n s u r f a c t a n t d n as y s t e ma n dp o l y a m i n e d n as y s t e m f o rc a t i o n i cs u r f a c t a n t s t h ei n t e r a c t i o n s a r ei n t e n s i f i e dw h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fd n aa n dn a c la r eb o t hl o ww h i l et h ei n t e r a c t i o n s a r eb a m e dw h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fd n aa n dn a c la r eh i g h t h ea d d i t i o no fn a c lw i l l s t r e n m h e nt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e na m p h o t e r i cs u r f a c t a n t sa n dd n a o nt h ec o n t r a r y , t h e i n t e r a c t i o n sb e t w e e np o l y a m i n ea n dd n aw i l lb eb a f f l e dw i t ht h ea d d i t i o no fn a c l t h e r e s e a r c ho f t h i sp a p e ri sl o o kf o r w a r dt oe x p a n d i n gt h ep o l y a m i n ea p p l i c a t i o ni nl i f es c i e n c e k e yw o r d s ：p o l y a m i n e ：d n a ：i n t e r a c t i o n ：s a l te f f e c t 创新性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得 的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或 撰写过的科研成果。对本论文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：i 坠 i = 1 l t l t 谢1 哆 。： ! ：! ：。： 关于学位论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解主国旦旦垡堂墨些盟窟隆有关保留、使用学位论文的规 定，同意主国日用化堂工业壁窥院一保留或向国家有关部门或机构送交论文复印件和电 子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权主国旦旦垡鲎三些盟宝堕可以将本学位论文 的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存 论文和汇编本学位论文。本论文所取得的研究成果属主国旦旦垡堂墨些盈窥医，其他 任何个人或集体未经授权不得使用。 论文作者签名：盘芏 导师签名：曰期：塑! 乡 中国日用化学工业研究院硕士学位论文 主要创新点 1 利用相图的方法从宏观角度对多胺d n a 的相互作用进行研究，通过对宏观相行为的 分析，期望获得体系内部的分子水平信息，以便为多胺的应用提供更好的理论依据。 2 利用z e t a 电位法、紫外光谱法和相图法研究多胺d n a 体系的相互作用中的盐效应。 3 将多胺d n a 的相互作用与阳离子s a a 和两性s a i l 与d n a 的相互作用进行了比较说 明，为其在基因工程上的应用进一步打下基础。 第一章绪论 1 1 引言 第一章绪论 基因工程是2 0 世纪7 0 年代发展起来的一项生物学高新技术，在医药、食品、化 工、环保、能源、农业等方面均有广阔的运用前景。d n a 是一种具有双螺旋结构的、 在水溶液中具有高度负电的生物聚电解质。d n a 分子可以不同构象存在：细胞中天 然d n a 常以紧密集堆积的小球状方式存在，而水溶液中的d n a 一般以空间舒展的 线圈状形式存在 1 】。将重组的d n a 缩拢成致密的小球送入细胞的过程是实现基因转 染的关键步骤t ”。 在水溶液中，某些分子达到一定浓度、温度或溶剂性质改变时，就有可能与d n a 相互作用形成复合物，并诱导d n a 发生由线圈到小球的构象转变。d n a 缩拢成纳米 颗粒是生物学上一个重要现象，涉及病毒头基和细胞核中d n a 的包裹，及非病毒基 因传输载体的发展。目前大量的阳离子分子，包括阳离子油脂、多胺脂和聚氮丙啶， 作为非病毒基因传输载体被广泛研究【粥】。这些分子作用机理的第一步是d n a 分子缩 拢为纳米颗粒，以便通过胞吞作用和或其它目前没有确定的机理传输通过细胞膜。 近年来有许多关于d n a 可与阳离子表面活性剂及阳离子脂质体发生相互作用形成复 合物，并伴随d n a 构象转变的报道【9 - 1 1 1 ，这些研究结果为基因疗法开辟了可能的途 径陋1 4 1 ，并正在向l 临床治疗转化 1 5 , 16 】。但由于阳离子表面活性剂体系一些不可避免的 缺点，如阳离子表面活性剂的细胞毒性、与d n a 形成复合物稳定性低等，限制了其 可能的应用。两性表面活性剂在一定程度上避免了阳离子表面活性剂的缺点，并具有 其他表面活性剂没有的性质，但对d n a 的压缩效果不如阳离子表面活性剂。与表面 活性剂相比，多胺类化合物由于其生源性及特定的生物功能，可以作为良好的d n a 压缩试剂，致使d n a 形成紧密小球状而有可能作为潜在的非病毒载体【1 7 1 。本章首先 叙述了d n a 的性质、多胺的特点，接下来主要介绍了研究多胺与d n a 相互作用的 常用方法以及如今国际上对多胺与d n a 相互作用的相关文献报道和主要的研究结 果。 1 2 d n a 的性质 脱氧核糖核酸d n a ( d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ) 是相对分子量很大的高聚物，它的 中国日用化学t 业研究院硕士研究生学何论文 基本单位是核苷酸，是由成千上万甚至几百万个单核苷酸按一定的序列顺序组成的多 聚核苷酸长链。单核苷酸是由一个磷酸分子、一个脱氧核糖和一个碱基构成 d n a 的一级结构实际上就是构成d n a 的脱氧核苷酸按照一定的排列顺序而形 成的线性结构。d n a 的二级结构即d n a 的空间结构，由碱基间氢键和疏水键维持的 双螺旋结构( 图1 1 ) 。双螺旋链的扭曲 或再次螺旋就构成了d n a 的三级结构。 d n a 存在有一种以上的双螺旋构型， 在生理盐浓度下d n a 采取经典的b 型， 在细胞中也主要采取b 型。除了b 型之外， 还发现a 、c 、d 型构象的右手双螺旋， 以及z 型的左手双螺旋。b 和a 型构象是 d n a 的基本构象。在d n a 空间结构中， 嘌呤与嘧啶碱位于双螺旋的内侧，磷酸与 核糖在外侧彼此通过3 ，5 磷酸二酯键相 连接，形成d n a 分子的骨架。 d n a 中脱氧核苷酸除末端磷酸残基 外，其骨架的磷酸二酯中磷酸残基只有一 个解离常数，p k a = 1 5 。由于磷酸残基中 图l - ld n a 的双螺旋结构 p k a 较低，而且有多价解离性，因此，在f i g 1 1s c h e m a t i cs a 掣a mo f d n a c o n f i g u r a t i o n p h 4 的水溶液中，核酸几乎全部以“聚阴离子”状态存在。体系的p h 直接影响d n a 双螺旋结构中碱基对间氢键的稳定性：只有p h 在4 0 i i 0 之间，碱基对间的氢键是 稳定的：p h 超过此范围，d n a 结构与性质可能要发生改变。并且d n a 具有两性的 特点，其等电点为p h = 4 0 4 5 ，此时其溶解度最低，其磷酸骨架中的磷酸根可以电 离呈阴离子状态，因此，为了便于研究，在化学领域常将d n a 看作一种带高度负电 荷的生物聚电解质或聚阴离子。 1 3 多胺 多胺( p o l y a m i n e ) 是在所有生物有机体内发现的一群脂肪族的聚阳离子化合物的 总称【1 8 】。在动物细胞内多胺经常由丁二胺、亚精胺和精胺组成( 结构式见图1 2 ) 。 精胺只能在真核细胞中被合成，而丁二胺和亚精胺在原核生物中也可以找到。随着细 胞循环多胺的浓度不断变化，人们认为它们在细胞增殖和区分、d n a 压缩、蛋白质 2 第一章绪论 分析、膜稳定和个别酶活性( 如激酶、拓补异构酶以及关系到生物新陈代谢的酶) u 9 - 2 4 中有着重要的作用。外生的多胺和他们的相似物容易被运输进细胞，并且病态情况下 ( 如癌症、牛皮癣和镰刀细胞贫血症) ，在生物流体和组织中它们的浓度显著升高。 尽管这些化合物在涉及细胞生长的不同过程中有非常重要的作用，但它们在生物细胞 中的角色和作用机理到目前为止还不大清楚。在生理学离子条件下，多胺带正电， d n a 上带负电的磷酸盐是它们的主要作用目标。多胺可使d n a 稳定，以抵抗热交性、 碱变性、酶降解、剪切破坏、辐射破坏、插入和芳香环染色。它们对于维持细胞内 d n a 的压缩状态起着重要作用，方便d n a 进入噬菌体头基 2 5 - 2 8 】。有实验表明多胺可 以像无机c o ( n h 3 ) 4 3 + 阳离子一样使天然d n a 分子压缩和聚梨2 4 1 ，并将对生物学上重 要的包裹过程，像染色体结构的组织，提供有用的模型。多胺和它们的乙酰基衍生物 在诱导稳定化左手螺旋的z d n a 上有着重要的作用 3 5 - 3 8 】。所以像它们的乙酰基衍生物 一样，多胺诱导d n a 发生构象转变，如聚( d g - - m 5 d c ) 聚( d g m 5 d c ) 由b 到z 型 的转变【”j 9 ，柏】。多胺与d n a 的结合似乎很可能影响构象动力学( 如弯曲扭转和短暂的 碱基不配对) 。多胺对d n a 热稳定性的影响由其离子电荷、p h 、和介质浓度等物理 化学参数影响。 r 1 _ c i c i -c i + 池n 厂n 厂n + h 3 精胺： h 2h 2 丁二胺：+ n h 3 、一4 、n h 3 + 图1 - 2y _ - 胺( p u t r e s c i n e ) 、亚精胺( s p e r m i d i n e ) 、精胺( s p e r m i n e ) 的化学结构 f i g 1 - 2c h e m i c a ls t r u c t u r e so f t h ep u t r e s c i n e 、s p e r m i d i n ea n ds p e r m i n e 1 4 所用多胺结构 研究多胺与d n a 的相互作用中，所用多胺种类主要有精胺，亚精胺，及它们的 n 一甲基化相似物，氨氧基基团取代多胺末端n h 2 基团得到的相似物，l ，3 一二胺丙 3 中国日用化学工业研究院硕十研究生学位论文 烷，l ，5 一戊二胺，多胺乙酰基衍生物等。在目前所发展的研究多胺与d n a 的相互作 用技术中，天然多胺的一些修正，如电荷剥离，变换烷基链长度，增加支链等方法可 用来合成所需要的多胺结构和电荷数，以满足实际应用中的需求。 1 5 多胺与d n a 相互作用研究方法及所得结论 脱氧核糖核酸d n a ( d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ) 是相对分子量很大的高聚物，它的 基本单位是核苷酸，是由成千上万甚至几百万个单核苷酸按一定的序列顺序组成的多 聚核苷酸长链。带正电的多胺与带负电的聚电解质核酸相互作用已经被很好的确立， 在生物体外的相互作用已经研究的很多。对多胺和d n a 相互作用的研究包括了平衡 研究，核磁共振研究，x 光散射研究，计算机模拟研究，能量计算和d n a 熔解研究 等。d n a 存在有一种以上的双螺旋构型，在生理盐浓度下d n a 采取经典的b 型， 在细胞中也主要采取b 型。多胺不但可以增加d n a 的熔解温度，并且可以通过交互 g c 碱基顺序来推动d n a 由b 到z 型的转变。同时，多胺是多价阳离子，在溶液中， 与聚电解质d n a 发生静电作用，会积聚包围在核酸表面，从而与磷酸盐负电荷由更 多的相互作用，从而可以诱导d n a 发生构象缩拢。由于多胺加入导致d n a 熔解温 度的升高与d n a 中的a t 含量成比例，所以除了与磷酸盐的缔合，多胺也可以通过 氢键与组成d n a 碱基的原子相结合。近年来对多胺和d n a 的相互作用主要的研究 方法和结果如下。 1 5 1 质子核磁共振 通过核磁共振法研究，w 锄m 一4 ”等发现精胺松散的与b d n a 十聚体相缔合。 b a n v i l l e 等【4 2 】的研究中发现由z - d n a 形成的六聚体减慢了多胺的运动。在以前的质 子核磁共振自扩散研究工作表明亚精胺和n 一甲基化亚精胺在与双螺旋 d ( g o a a i t c c ) 或d ( c g c g c g c g ) 相互作用中没有区别。至今为止自扩散研究仍没有 表现出二者有什么不同，也未显示碱基组成的影响。 在前人工作的基础上，l o r e n sv a l ld a m 等】主要利用质子核磁共振研究了带三个 正电荷的亚精胺与低聚核苷酸d ( m s c g ) 4 和d ( g g a a t r c c ) 的相互作用，在多胺存在 情况下，d ( m 5 c g h 为z 型，d ( g g a a t t c c ) 保持b 型构象。为了对比，作者也研究了 带四个正电荷的精胺和这两种d n a 低聚核苷酸的相互作用。研究方法是质子核极化 效应( 1 hn u c l e a ro v e r h a u s e re f f e c t ) 不同测量方法，这与w e m m e r 等和b a n v i l l e 等 4 第一章绪论 所用方法相同。多胺一d n a 的缔合对多胺再定位的影响由n o e 测量方法给出信息。 为了补充以前对亚精胺、n 一烷基化亚精胺与b d n a 相互作用的扩散研究，对这两 种多胺与d ( m 5 c g ) 4 和d ( g g a a t t c c ) 相互作用也用质子核磁共振自扩散方法进行了 研究。滴定实验( 监控自扩散系数) 对于多胺一d n a 缔合热力学程度非常敏感，并 且这些方法对n o e 结果是一种补充。另外，通过对六种不同的多胺的核磁共振测定 了诱导d ( m s c g ) 4 从b 型到z 型转变的能力大小，六种多胺分别为：精胺4 + ( s p i ，) ； 亚精胺3 + ( s p d 3 + ) ；它们的完全n 一甲基化相似物：甲基精胺( m e l o s p n 4 + ) 和甲基 亚精胺( m e s s p d 3 + ) ；1 ，3 一二胺丙烷( d a p 2 + ) ；1 ，4 一二胺丁烷( 丁二胺2 + 【p 砰+ 】) 。 i _ o r e mvd 等3 7 i 的工作表明了精胺和亚精胺与低聚核苷酸d ( m 5 c g ) 4 和 d ( g g a a t r c c ) 的相互作用中，因为二者之间的缔合，丁基链质子的可动性减少要比 丙基链质子的大。当比较b d n ad ( g g a a t t c c ) 和z - d n ad ( m 5 c g ) 4 时，也只有精胺 和亚精胺的丁基链可动性减小。由此，得到结论，当多胺与d n a 缔合时对丁基链的 影响要大于丙基链。多胺和z - d ( m 5 c g ) 4 低聚核苷酸的缔合较为坚固，表明与 d ( g g a a t r c c ) 相比，多胺与这种d n a 有更强的热力学相互作用。在同样的电荷中 和程度下，诱导d ( m 5 c g ) 4 由b 型到z 型转变能力大小依次为s p n 4 + s p d 3 + m e l o s p n 4 + m e 8 s p d 3 + 。完成同样程度的b d n a 到z - - d n a 的转变需要的丁二胺多 于1 ，3 一二胺丙烷。以上结果与圆二色谱所测结果一致【4 5 1 ，说明核磁共振在测量d n a 的构象转变上是可靠的。 a n d r e a s s o nb ，n o r d e n s k i o e l dl 等h 3 谰核磁共振脉冲场梯度自我扩散方法研究 了亚精胺和甲基亚精胺( 完全的n 一甲基化亚精胺) 与小牛胸腺d n a 的相互作用。 自扩散系数商的研究表明了两种多胺与d n a 相似的吸引力。发现不同n a c l 浓度对 自扩散系数有着很大的影响，说明盐效应对多胺d n a 缔合有较大影响。在加入l i 和n a d n a 的溶液体系中，扩散系数商没有有显著的变化，这表明了钠离子和锂离子 在与d n a 的相互作用中效果相似。与此不同的是m g d n a 的加入对扩散系数商产生 了一定影响，甲基亚精胺的缔合效果要比在n a d n a 溶液中差，因为存在着m 矛+ 、 多胺与d n a 缔合的竞争。与静电p o i s s o n - b o l t z m a n 细胞膜行为基础所作的计算相对 照结果表明：多胺与d n a 相互作用主要为静电作用，不与d n a 分子上的特殊位置 相结合。 5 中国日用化学工业研究院硕士研究生学位论文 1 5 2 小角x 光散射法、小角x 射线衍射法和圆二色谱法 b e c k e r m ，m i s s e l w i t zr 4 6 】等用小角、广角x 光散射法和圆二色谱法对精胺一d n a 复合物进行了研究。作者认为在临界离子强度情况下，缩拢复合物形成。在同样的离 子强度下，缩拢物有两种不同的超分子结构共存。缩拢物形成的方法决定了缩拢物的 结构。这些结构之间的相转变可以通过热处理诱导实现。 m u l l e rjg 4 7 等用溴乙非啶置换分析、观察聚d ( a t ) 的热变性变化、对d n a 增色 性的影响和圆二色谱法研究了类固醇多胺与d n a 的相互作用。另外，利用模拟研究 测定聚阳离子的静电表面势能。结果表明除了类固醇上的铵和胍盐与骨架磷酸盐的静 电作用外，类固醇的巨大疏水表面同样起着重要的作用。 o h i s h i h i r o f u m i 4 8 等利用小角x 射线衍射法研究了左手螺旋的z - d n a 六聚物 d ( c g ) 3 与合成多胺形成的复合物的晶体结构。在正交晶体内，该d n a 与两个 n h 3 + - ( c h 2 ) 2 n i - 1 2 + ( c h 2 h n i - 1 2 + ( c h 2 ) 2 n h 3 + p a ( 2 2 2 ) 】分子结合，并且合成的多胺 表现出双重的构象性质。一个p a ( 2 2 2 ) 分子位于z d n a 双螺旋小沟底部，含亚氨基 的集团跨越双螺旋结构连接两个磷酸盐成桥，同时，末端的氨基集团连接四个胞嘧啶 碱基的0 2 原子。该p a ( 2 2 2 ) 分子一端形成了象鱼钩一样的u 型转动，提供了一种 微环境网状物，这种d n a - 多胺复合物在0 2 年前的该研究中从未见过。具有环状末 端的多胺并未使d n a 小沟宽度明显增加，表明高的g c 碱基对堆积力使z - d n a 骨 架构象稳定；另一个p a ( 2 2 2 ) 分子结合于双螺旋z d n a 的大沟的突出外表面，该 p a ( 2 2 2 ) 分子呈现出z i g - z a g 型构象。将这一结构与其他的多胺一d n a 结构相比，可知 复合物结构可能与多胺长度相关。 蕊赞铲毋。静。：凝。 镬毋、抟警l 谚矿。搿抟 妒铲毋 热镬谚尊s 图1 - 3 多胺化学结构：( a ) 精胺；0 3 ) a o s p m ；( c ) 亚精胺；( d ) a p a p a ；( e ) a o e p u t f i g i - 3c h e m i c a ls t r u c t u r e s ：( a ) s p e r m i n e ，( b ) a o s p m ，( c ) s p e r m i d m e ，( d ) a p a p & ( e ) a o e p u t 6 第一章绪论 在目前所发展的研究多胺与d n a 的相互作用技术中，生物多胺结构相似物的合 成被看作是一种很有用的工具。氨氧基取代末端氨甲基集团得到一系列等排的和电荷 不足( 在生理学的p h ) 的相似物作为研究多胺结构特性的模型。r u i z c h i c a ，八j 等【4 9 】 利用圆二色谱法研究生物多胺氨氧基相似物与低聚核苷酸的相互作用。所用物质结构 ( 图1 3 ) ： r u i z - c h i e a , a j 等得到以下结论： 1 p h 值减少对低聚核苷酸c d 谱图的影响：在生理学p h 值，光谱显示了低聚核 苷酸b 型构象的标准特征。p h 为5 0 时两低聚核苷酸都保护了它们在生理学p h 值时 的二级结构，认为部分质子化发生在碱性位置会使得双螺旋结有一些不稳定，尤其是 g c 链。 2 对精胺氨氧基相似物a o s p m 相互作用的影响：在生理学p n ，加入a o s p m 时， d g ( c g ) 7 1 a r c ( g c ) 7 的光谱变化可以忽略。相反，a - t 低聚核苷酸在波段2 7 1 r i m 表现出椭圆率的e 耕氐。p h 为5 0 时，在a o s p m 存在下，所有d a ( t a ) 7 】, t i t ( a t ) 7 】 波段表现出缺少色性。另外，光谱显示两个i s o d i e r o i e 点，在2 3 5n i n 和2 5 9n i n 处， 表明了溶液中包含低聚核苷酸存在构象平衡。d g ( c o ) 7 】d c ( g c ) 7 1 - a o s p m 的c d 谱图在2 4 5 n m 处也存在一个i s o d i e r o i e 点。2 0 8n n l 处，正波段表现出剧烈的 增加并移动+ 8 n m ，当a o s p m 浓度到1 0 0 0 p m 时，2 2 8 n m 波段的信号由正变为负。 波段在3 0 0 n m - 2 5 0 n m 的区域与d n a 和低聚核苷酸的结构变化有关。在这一区域 的波段强度和由两个相邻碱基形成的角缠绕角( w i n d i n ga n g l e ) 成反比。所以p n 值 为7 5 ，加入a o s p m 时，d a ( 1 a ) 7 】d t ( a t ) 7 】在2 7 1 n m 处的c d 波段强度的 减少意味着低聚核苷酸缠绕角的增大。原因：从理论和实验研究来说a o s p m 分子优 先与大沟的a - t 结合i5 0 1 。对于精胺也优先与两条沟中a - t 富集的地方结合。p h 为 5 0 时，由于加入a o s p m ，c d 光谱的改变与p h 降低时相似，因此表明了a o s p m 诱导下双螺旋结构的不稳定。对于a o s p m 不同的反应与氨基集团的质子化有关。因 为它的p k a 值大约为4 5 ( p n 值为5 0 时分子电荷接近+ 4 ) ，所以它可以使d n a 分 子迅速形成固体颗粒，就象其他四价阳离子一样。 被提议的a o s p m 与g c 丰富的区域作用模型包括与d n a 两沟相似的相互作用。 另一方面，由于g c 碱基对比a - t 碱基对多一个额外的氢键，所以g c 键更为稳定。 所以在生理学p h 值，加入a o s p m ，与含有a t 碱基对的低聚核苷酸相比 d g ( c g ) 7 】d c ( g c ) 7 几乎未发生变化。在p h 5 0 时氨基多胺更大的正电荷使g c 低聚核苷酸的c d 谱图发生重要变化。i s o d i e r o i e 点的出现说明溶液中存在两种不同 7 中国日用化学t 业研究院 硕十研究生学位论文 构象。观察到的特征与三氟乙醇存在时d ( g c ) 5 十聚体的特征相同，三氟乙醇可使构 象由右手螺旋的b d n a 向左手螺旋的z d n a 二级结构转变。结果，我们假定在 a o s p m 存在的情况下，这个低聚核苷酸存在着两种构象的平衡，并由此解释前面提 到的i s o d i c r o i e 点。 与精胺氨基相似物a o e p u t 和a p a p a 相互作用的影响。氨基相似物的加入引 起光谱的变化只有在酸性p h 值时出现，也就是说当大部分氨基集团被质子化的时候。 这些特征与a o s p m d a ( t a ) 7 】d t ( a t ) 7 】溶液相似，因此表明了a o e p u t 和 a p a p a 使双螺旋结构不稳定。生理学p a 值时的光谱图表明a t 低聚核苷酸的大分 子结构没有明显的变化，以前的研究工作论证了二价阳离子不能诱导长链和短链 d n a 大分子改变，这与o h i s h i ，h i r o f u m i 4 8 1 研究结果一致。 关于d g ( c g ) 7 】d c ( g c ) 7 溶液的谱图，在2 2 8 n m 处没有表现出波段的倒置， 所以不能明确的表明d n a 是否在a o e p u t 和a p a p a 的诱导下发生了z - d n a 的构 象转变。值得指出的是加入这些氨基相似物d a ( 1 a ) 7 】d t ( a t ) 7 】在2 0 6n n l 的 负特性表现出不同行为。加入a o e p u t 波段变为正，加入a p a p a 仍为负。a o e p u t 氨氧基集团在n l 位置，a p a p a 氨氧基集团在n 8 位置。观察到现象的不同说明了， 氨氧基集团位置在生物多胺与d n a 相互作用中有着不同的贡献。 1 5 3 傅立叶变换拉曼光谱 拉曼光谱由于具有高度的灵敏性和记录水溶液光谱的可能性，适合于研究特殊的 生物分子之间的相互作用【”1 。傅立叶变换拉曼光谱进一步提高了这一方法的性能，可 以快速的记录大量的光谱。拉曼光谱被用来研究药物与d n a 相互作用时核酸的结构 变化 5 2 - 5 5 】。 r u i z c h i c a a j ，m e d i n a m a ，s a n c h e z j i m e n e z f 【5 6 】等利用傅立叶变换拉曼光谱 来研究精胺和组胺与小牛胸腺d n a 的相互作用。通过观察到的d n a 拉曼光谱变化 来讨论多胺d n a 复合物可能的结合位置。一个精胺分子对d n a 的诱导效果与两个 或更多的组胺分子一致相似。 d e n g , h o n g 5 7 等也利用了拉曼光谱来研究四种不同g c 含量的d n a 与阳离子多 胺亚精胺和精胺的相互作用。作者发现在含6 0 m m d n a 磷酸盐和1 ，5 或6 0 m m 多 胺溶液中，只有磷酸盐的拉曼波段表现出了大的光谱波动，表明了b d n a 磷酸盐是 相互作用的主要目标。磷酸盐的变化与碱基组成无关，它与非特殊阳离子结合模型一 致，该模型认为离开原位的多胺由于受到与双螺旋轴垂直的强静电势能梯度的限制而 8 第一章绪论 沿着d n a 分布，该发现为多胺诱导d n a 缩拢是由非特殊静电结合驱动的模型提供 了实验上的支持。拉曼光谱也揭示了大沟位置受多胺一d n a 相互作用的影响要比磷 酸盐小。多胺的结合适度的依靠基因组碱基顺序表明了顺序关系在认识中只起了次要 的作用。重要的是，多胺的结合对于天然b 型二级结构具有可以忽略的影响。亚精 胺或精胺与b d n a 结合或使其缩拢并没有改变d n a 本身的结构。 多胺和d n a 的直接作用在一系列试验基础上被提议，如热变性或热保护。然而 多胺和d n a 之间的结合并没有被清楚的解释。也提出了一些相互作用的模型，但是 彼此也不总是一致。r u i z c h i c a j ；m e d i n a m a 等【5 8 】又利用傅立叶变换拉曼光谱对生 物多胺丁二胺、亚精胺和精胺与d n a 之间的相互作用进行了研究。对不同多胺浓度 下小牛胸腺d n a 的拉曼光谱进行研究，以天然水和重水作为溶剂。至少在作者的实 验条件下，拉曼光谱的研究支持了相互作用中结构特征的存在。这些特性导致了丁二 胺和亚精胺优先通过d n a 的小沟与d n a 结合，而精胺通过大沟结合。另一方面， 除了与外沟的磷酸盐部分的相互作用之外，精胺与亚精胺表现出链交互的相互作用， 而丁二胺表现出链内的相互作用。与多胺的分子内部距离近似的由标准几何学参数计 算。r u i z c h i c a j 【5 8 】等提出了几种多胺一d n a 相互作用的模型。 图l - 4 丁二胺一d n a 复合物优先结合模型从小沟的同一条链磷酸盐和嘧啶- - 0 2 ：( 功从小沟 的同一条链磷酸盐和嘿呤- - n 3 ；( o 磷酸盐一磷酸盐外沟 f i g 1 - 4p r e f e r e n t i a lb i n d i n gm o d e lp r o p o s e df o rp u e - d n ac o m p l c x a t i o n 似) p h o s p h a t ea n d p y d m i d i n e - 0 2f r o mt h es a m es t r a n do f t h em i n o rg r o o v e ；) p h o s p h a t ea n dp u r i n e - n 3f r o mt h es a m e s t r a n do f t h em i n o rg r o o v e ；( c ) p h o s