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c r e b 在拟黑多刺蚁学习记忆中的作用研究 金卓明 摘要：蚂蚁是人们最熟悉和常见的昆虫之一。它们繁殖能力较强，种类多样 化。作为社会型昆虫，还存在着复杂的行为活动。拟黑多刺蚁是一种群居生活而 且分工明确的社会性昆虫，同时它也是具有极高药用价值的一类昆虫。其家族成 员主要包括雌蚁、雄蚁以及工蚁。这种明显的多态现象与分工明确的社会性生活 决定了它们具有复杂以及发达的神经系统。以蕈形体在不同昆虫脑内所占容积来 说，蚂蚁脑占1 1 7 4 ，但是鳃角金龟属( m e l o l o n t h a ) 仅有1 3 2 9 0 ，龙虱( d y t i s w s ) 仅有1 4 2 0 0 。 c r e b 是一种4 3 k d 的亮氨酸拉链型转录因子，已经发现c r e b 在海兔、果蝇和 小鼠的长时程记忆中起重要作用。本实验即以昆虫纲( c l a s s i n s e c t a ) 、膜翅目 ( h y m e n o p t e r a ) 、细腰亚目( a p o c r i t a ) 、蚁总科( f o r m i c o i d e a ) 、蚁科( f o r m i c i d a e ) 的拟黑多刺蚁( p o l y r h a c h i sy i c i n ar o g e r ) 为实验材料，以免疫组织化学技术 为手段，首次研究了c r e b 在拟黑多刺蚁不同品级中的表达情况，并且通过行为学 方法，对工蚁进行行为学训练，对拟黑多刺蚁的学习记忆能力进行了研究，并且 比较了训练前后c r e b 表达量的差异性，以期比较经过训练的拟黑多刺蚁脑部c r e b 水平是否发生了变化以及拟黑多刺蚁长时记忆过程中c r e b 的水平是否发生变化。 此外，对拟黑多刺蚁脑部连续切片的实验条件进行了摸索，并用h e 染色法对拟黑 多刺蚁脑部切片进行染色，研究其脑部结构、比较了不同品级脑部结构的差异。 实验结果显示，对于拟黑多刺蚁脑部连续切片的石蜡包埋，采用多聚- 甲醛固 定液具有较好的效果，可以在相对较短的时间内浸入脑部，起到固定的作用。而 酒精逐级脱水的时间则控制在2 h ，有较好的效果。对于石蜡包埋的透明部分，则 采用二甲苯透明。制作脑部连续切片的实验方法，对于拟黑多刺蚁脑部结构探索 以及进一步免疫组化反应是必不可少的。通过本实验，确定了一整套适宜的方法 来实现脑部连续切片。同时，对拟黑多刺蚁脑部h e 染色后进行观察，可以看到拟 黑多刺蚁的前脑、中脑和后脑。前脑由前脑叶和视叶构成，前脑叶包括蕈形体和 中央体。一对荤形体以左右对称的形式位于脑的上方。视叶为复眼的视觉中心， 与复眼相连，较大的视叶显示了它具有高度发达的视觉系统；中脑位于前脑下方， 主要包括背叶和嗅叶( 触角叶) 。其中嗅叶为主要部分，嗅叶由视嗅神经交叉与同 侧的蕈形体和中央体相联结。后脑在前脑和中脑的背面，左右各成一叶，发出围 咽神经索与咽下神经节相连。这些表明在拟黑多刺蚁中，嗅觉和视觉的重要性。 邋过c r e b 在拟黑多刺蚁不同品级的免疫组织化学反应的研究表明，在工蚁、 雌蚁、雄蚁中均有阳性颗粒的表达，但在雄蚁中璺现较弱的阳性颗粒表达。这可 能表明在拟黑多刺蚁不同品级中，雄蚁具有相对较差的学习记忆熊力。或者在雄 蚊中稃在着与王蚁、瓣蚁不同的其他辊餐来介导其学习记忆的能力。对免痰组化 切片的观察发现，雌蚁中c r e b 阳性颗粒的表达主要分布于中脑。中脑是蚂蚁的嗅 觉联络中心。这表明怼予雌蚁掰言，嗅觉的功能与视觉媚魄占有燹特殊熬选短。 而其学习记忆的方式也以嗅觉为主，即依赖嗅觉的巩固加深来达到这样的弱的。 在雄蚁中，有较弱c r e b 阳性颗粒的表达，这可能与雄蚁在蚁巢中所处的特殊品级 有关系。在工蚁的脑部，c r e b 的表达则分布在蕈形体、视叶和中脑三个部僚。 最后，通过y 迷窗实验对拟黑多刺蚁工蚁的学习记忆能力进行了训练，并且 对训练过后具肖记忆簸力的搬黑多裁蚁脑部c r e b 鹣表达进行研究发现，叛黑多裁 工蚁矮有明显的空间学习记忆能力。但怒，训练前后c r e b 量的表达差异不大。这 可女2 表骥，在这一毙力的体现中，c r e b 不是通过基础表达量的增挑嚣促进学习记 忆能力的加深，是通过对原有c r e b 水平的磷酸化而实现的。或者，在拟黑多刺工 蚁中还存在着其他的信号调控机制来进行学习记忆。不过通过这戮研究我们可以 发现，拟黑多剃蚁的嗅觉部分可能与其学习记忆能力有着重要的关系。这也与其 具有发达的嗅觉能力相关。 本文首次对叛黑多剡蚁膣黎切片条 睾进行了摸索，研究了c r e b 在幸鼗黑多刺蚁 脑部的表达情况，并首次对拟黑多刺蚁进行学习记忆方面的训练，希望可以通过 对c r e b 表达水平的差异性这一危度来揭示其学习记忆的一些枫制。 奖键词：拟黑多刺蚁：c r e b ：学习记忆：脑 i l o b s e r v a t i o no nt h ef u n c t i o no fc r e bi nl e a r n i n ga n d m e m o r yi np o l y r h a c h f sv i c i n ar o g e r j i nz h u o m i n g a b s t r a c t ：a n t sa r es o c i a li n s e c t sw i t hc l e a rd i v i s i o no fl a b o r t h e y a r ec o m p o s e do ff i v ec a s t e s ：f e m a l e s ，m a l e s ，s o l d i e r s ，b i gw o r k e r sa n ds m a l l w o r k e r s t h ep o l y m o r p h i s ma n dc l e a rd i v i s i o no fl a bl e a dt ot h e i rd e v e l o p e d n e r v es y s t e m i ti sa ni m p o r t a n tp a r ti ni n s e c tb r a i nn e r v er e s e a r c ht o a n a l y z et h e i rb r a i nn e r v es y s t e m p o l y r h a c h f sv i c j n ar o g e ri sar o b u s ta n d b l a c ka n to fa s i a ，w h i c h1 i v e si nt h ec l u m po fb u s h e so ra r b o r so nh i l i s i d e s w h e r et h em a j o rp l a n ti sp i n u ss a s s o n i a n al a m b 6 u e r c u sf a b r i ch a n c e ，a r u n d i n e 7 7 as e t o s at r i na n ds oo n ap o p u l a t i o n ，f r o my o n g k a n ，z h e j i a n go f c h i n a ，c o m p r i s e dp o l y g y n o u sc o l o n i e st h a tg e n e r a l l yh a dq u e e n s ，f e m a l e s ， m a l e s ，l a r v a e ，p u p a e ，e g g sa n dw o r k e r s ( c h e ne ta 1 ，1 9 8 9 ) t h ep o l y m o r p h i s m a n dc l e a rd i v i s i o no fl a bd e c i d et h a tt h e yh a v ec o m p l e xa n dd e v e l o p e dn e u r a l s y s t e m ，t a k et h ev o l u m eo fm u s h r o o mb o d yi nd i f f e r e n ti n s e c t sa se x a m p l e ，a n t i s1 1 7 4 ，b u tm e l o l o n t h ai so n l y1 3 2 9 0 ，a n dd y t i s w si s1 4 2 0 0 c r e b ( c a m pr e s p o n s ee l e m e n tb i n d i n gp r o t e i n ) w a sd i s c o v e r e di nt h el a t e 1 9 8 0 s c r e bw i t har e l a t i v em o l e c u l a rw e i g h t4 3 0 0 0w h o s ep e p t i d ec h a i ni s c o m p o s e do f3 4 1a m i n oa c i dr e s i d u e s i t sm o l e c u l a rs t r u c t u r ei sd i v i e d i n t ot w or e g i o n s ，t h en - t e r m i n a ld o m a i nr e g u l a t e sg e n et r a n s c r i p t i o n ，a n d t h ec t e r m i n a ld o m a i ni sap r o m o t e rd n a b i n d i n ga r e a c r e bi sam e m b e ro f t h ec r e b a t ff a m i l y ，i tc o n t a i n s8s u b t y p em o l e c u l e s c r e ba sat r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o nf a c t o ri ne u k a r y o t i cc e l lc a r r i e so u tt h ef u n c t i o nb y i t s e l fp h o s p h o r y l a t i o n p e o p l ep a yp a r t i c u l a r l ya t t e n t i o nt ot h er o l eo f c r e bi nl e a r na n dm e m o r y c r e bc a dp r o m o t et h ef o r m a t i o no fl o n gt e r mm e m o r y i nd r o s o p h i l aa n dm o u s e i nt h i ss t u d y ，w et o o k 尸v i c f n aa sm a t e r i a la n d m e t h o do fi m m u n o c h e m i s t r y ，f o rt h ef i r s tt i m e ，s t u d yt h ee x p r e s s i o no fc r e b i nd i f f e r e n ta n tc a s t e s w et r a i n e dt h ew o r ka n tt h r o u g hb e h a v i o r a lm e t h o d t os t u d yt h ea b i li t yo fl e a r n i n ga n dm e m o r yo fpv i c i n a ，a n dc o m p a i r e dt h e d i f f e r e n c eo fc r e be x p r e s s i o nb e f o r et r a i n i n gt of i n di ft h el e v e lo fc r e b c h a n g e di nt h ep r o c e s so f l t p t h i sp a p e ra l s ow a n tt ol o o k i n gf o ra 1 1 i s u i t a b l em e t h o dt ok n o wm o r ei n f o r m a t i o n ，i t sa b o u tt h es t u d yo fb r a i n s t r u c t u r ea n dn e r v ep a t h w a yo fpv i e i n ai nt h es t u d y t h er e s u l t ss h o wt h a tp o l y f o r m a l d e h y d eh a sg o o de f f e c ta sf i x a t i o n 1 i q u o ri np a r a f f i ne m b e d t h eb r a i no fa n tc a nb ei m m e r g e di nf e wt i m e ，a n d 2 hi sas u i t a b l et i m ef o rg r a d u a ld e h y d r a t i o nb ya l c o h 0 1 l u c e n c ya r eu s e d b yd i m e t h y l b e n z e n e t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h eb r a i ns t r u c t u r ea r e c o m p o s e do fa n t e r i o r ，m i d d l ea n dh i n d b r a i n ag i g a n t i cm u s h r o o mb o d yi n a n t e r i o rs h o w e dt h a tt h ea n th a st r a n s c e n d e n tc a p a b i l i t yi nl e a r n i n ga n d m e m o r y t h e r ei sb i go l f a c t o r yn e r v ef i b e rg l o b ei nm i d d l e b r a i n ，w h i c h i n d i c a t e dt h a tpv i c i n aa n th a sw e l ld e v e l o p e do l f a c t o r ys y s t e m h o w e v e r ， t h eo p t i cs y s t e m sf u n c t i o ni n1 0 0 k i n gf o rf o o d ，l e a r n i n g ，m e m o r ya n do t h e rb e h a v i o ri si n f e r i o rt oo l f a c t o r yg l o b e t h eh i n d b r a i ni sv e r y s m a l l ，a n di t sf u n c t i o ni sn o tc l e a ra sy e t t oe x p l o r et h ee x p r e s s i o no fc a m p r e s p o n s e e l e m e n t b i n d i n g p r o t e i n ( c r e b ) i nt h ea n tb r a i n ，i m m u n o h i t o c h e m i e a lt e c h n i q u ew a sp e r f o r m e d z 。od e t e c tt h ee x p r e s s i o no fc r e bi nt h eb r a i n t h er e s u l t ss h o wt h a ta p o s it iv ee x p r e s s i o no fc r e bw a so b s e r v e di nt h eo r a i no fw o r ka n t sa n dq u e e n a n t s ，b u to ni ti st h ec o n t r a r yi nt h em a l e s i tm a yi n d i c a r e dt h a td i f f e r e n t c a s t e so fpf i c i n aa s s o c i a t e dw i t hd i f f e r e n t a b i l i t yo fl e a r n i n ga n d m e m o r y t h em a l e s 7 sa b i l i t yi so fas o r to rt h e y 。h a v ea n o t h e rs i g n a l t r a n s d u c t i o np a t h w a y f r o mt h es l i c ew e c a n o b s e r v e dt h a tt h ep o s i t i v e e x p r e s s i o ni nq u e e na n ti sm a i n l ye x p r e s s e da t 。m i d d l e b r a i n m i d d l e b r a i n i st h ei n t e r n u n c i a lc e n t r eo fo l f a c t i o n ，s ot h eo l f a c t o r yf u n c t i o nh a sa s p e c i a ls t 。a t 。u sc o m p a ir e dw i t h 。v i s i o na n di t ，h a sa ni m p o r t a n tf u n c t i o ni n t h em o d eo f1 e a r n i n ga n dm e m o r y i nw o r k ：a n t s ，t h ep o s i t i v ee x p r e s s l o no f c r e bi sm a i n l yd i s t r i b u t e a tm u s h r o o mb o dy 、o p t i c s y s t e ma n d m i d d l e b r a i n ，t h ed e g r e eo fe x p r e s s i o ni st h em o s t i nt h et h r e ec a s t e s i n m a l ea n t s ，t h el o wp o s i t i v ee x p r e s s l o no fc r e bi si d i s t r i b u t ea e m i d d l e b r a i n w et r a i n e dt h ew o r ka n t so f 尸髓 c i n ab yy m a z e a n dc o m p a i r e dt h e e x p r e s s l o no fc r e bo ft h ew o r ka n t sw i t hw i t h o u tt r a i n i n gw o r k a st h er e s u l t w e i n dt h a tt h ea b i1i t yo fl e a r n i n ga n dm e m o r yi nw o r ka n t so fp 讥c i n a i so b v i o u s ，b u tt h e r eh a v en oo b v i o u sd i f f e r e n c eb e f o r ea n da f t e r t r a i n i n g i nt h ei m m u n o c h e m i s t r ys l i c e st h er e s u i t si n d i c a t e dt h a tt h e v f u n c t i o no fc r e bi st u n e dt h r o u g hp h o s p h o r y l a t i n go rt h e r e so t h e rs i g n a l p a t h w a ya b o u tl e a r n i n ga n dm e m o r y f r o mt h er e s e a r c hw ef i n dt h a to l f a c t i o n h a ss o m ei m p o r t a n tf u n c t i o ni nl e a r n i n ga n dm e m o r yf o r 尸v i c i n & i nt h i sp a p e rw ef i r s t l ys t u d yt h ec o n d i t i o no fi m m u n o c h e m i s t r yo f 尸 v i c i n a ，a n di n v e s t i g a t et h ee x p r e s s i o n o fc r e bi nd i f f e r e n ta n t c a s t e s f u r t h e rm o r ew et r a i n e dt h e 尸v i c i n a a n dc o m p a r e dt h ee x p r e s s i o n o fc r e bf o rt h es a k eo fp r o v i n gt h ef u n c t i o no fc r e bo fp v i c f n a i n l e a r n i n ga n dm e m o r y k e yw o r d s ：p o i 玎b a c b i sy i c i n ar o g e r ；c r e b ；l e a r n i n ga n dm e m o r y ； b r a i n v 学位论文独创性声明 y9 0 0 5 7 1 本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除文中已经注明弓| 罔的蠹容矫，论文中不包含其他个人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得陕西师范太学或其宦教育机构 的学饿或证书而使用过的材料。时本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 己在文中作了骥确说鲳井表示谢意。 kn 撵者签名：! 坠量亟日裳：兰堡垒! 墨 学位论文使用授权声明 本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕西师藏大 学。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西 师范大学。学校有权保留学位论文并囱虱家主管部门或其它指定规构送交论文 的电子版和纸质版：有权将学位论文用予 赢利瞄的的少疑复制并允许论文进 入学校图书馆、院系资料室被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文豹标题帮摘要汇编出舨。 作者签名：丛婆煎瑟期：叠蔓叁：是 第一章绪论 1 蚂蚁概述 1 1 蚂蚁的分布及其影响 蚂蚁是一种古老的社会性昆虫，一般体小，口器咀嚼式，上颚发达，为多态 型的社会昆虫。全世界约有90 0 0 多种，隶属3 6 0 多个属，实际种类则可能达到 1 50 0 0 多种。蚂蚁的寿命很长，工蚁可生存几星期至3 到7 年，蚊后则可存活十 几年或几十年。一个蚁巢在1 个地方可生长2 0 至3 0 年，甚至更久。此外，种类， 多、行为多样也是蚂蚁个体数量惊人的原因之一“1 。 蚂蚁是生态系统中的初级消费者，又是高级消费者。这就使得蚂蚁对其生活 的生态环境具有显著影响，比如取食行为和筑巢行为就与生态系统有着密切的关 系。大多数蚂蚁在地下筑巢并居住，通过建巢觅食的过程可使得土壤成分发生变 化。有些蚂蚁种类还是其他昆虫和小动物的捕食者，可对这些昆虫或者小动物的 种群造成一定的影响。另外，通过行为活动蚂蚁也可能对植物生长等造成一定的 影响，比如蚂蚁的觅食过程可能起到帮助植物扩散的作用。 此外，蚂蚁与许多动物存在着密切的互利共生关系，如隐翅甲、介壳虫、蚜 虫和一些鳞翅目幼虫等。这些昆虫为蚂蚁提供自己的分泌物，蚂蚁则保护这些昆 虫免遭天敌捕食，甚至搬迁或驱赶同翅目昆虫到营养丰富的部位取食，促进这些 昆虫的生长发育”3 。当然，也有一些蚂蚁成为城市害虫之一“3 。但是值得一提的是， 蚂蚁体内含有大量的人体代谢必需的微量元素和营养成分，可以调节人体免疫功 能，具有抗炎、镇痛、活血化瘀以及保肝护肝、降低谷丙转氨酶的作用以及平喘 和解痉等药理作用，而且在抗衰老方面具有突出的作用“1 。 综上所述，蚂蚁种类多，数量极大，且利大于弊，在加以保护的同时，更应 该加深对它的研究利用，以期对人类做出更大的贡献。 1 2 蚂蚁的社会生物学特性 作为社会性昆虫，品级问的不同差异表现在很多方面，如群体的大小、行为 的不同以及组群中的生殖角色等等删。 蚂蚁同一种群内的不同个体可合作照顾幼体；劳动分工明确：蚁群内至少有2 个世代重叠，且子代能在一段时间内照顾上一代，因此关于蚂蚁的社会生物学特 性是非常复杂的。 1 3 拟黑多刺蚁( p o l y r h a c h i s 妇c i n ar o g e r ) 概述 1 3 1 拟黑多刺蚁的生境 拟黑多刺蚁( 又称鼎突多刺蚁、大黑蚁) 属亚热带、热带种类，在我国以广东、 广西沿海地区分布最多。国井购主要分布于东南监、澳大举j 亚。拟黑多刺蚁多在 马尾松尖上建巢，蚁巢黑蜂窝状。通常每巢有蚁数干至数万只个体，蚁后常有多 个。 拟黑多刺蚁具有自动分窝、好斗等生物学特性，一些种类的蚂蚁与拟黑多刺 蚁有敌对关系。摇在楗上营巢的黑褐举蹉蚁( c r e m a t o g a s f e rr o g e n h o f e r j ) 勰可 能对拟黑多刺蚁的生存造成威胁。有黑褐举腹蚁的区域内拟黑多刺蚁不能形成优 势种群。 拟黑多刺蚁的食性也是影响其生存的一个重要因素。拟黑多剃蚁食性较广， 主要以多种昆虫阻及各种瓜果、蔬菜以及蚜虫蜜露和植物腺体分泌物等为食。蚂 蚁的食量缀小，每只每翻约为0 。i 毫壳食物。观察表明蚁巢瘫常裔堆积豹食物， 说明蚂蚁具有储藏食物的本能。蚂蚁出巢摄食的时间也有一定规律，一般在每天 上午9 至l l 孵襁下午3 至5 时会出现两个摄食嘉峰时间。 拟黑多刺蚁对其生活环境亦有定影响和作用。有研究表明，存在拟黑多刺 蚁的林区比无蚁区的松林被害率要降低很多。但目前对拟黑多刺蚁长期定厝所需 的条件仍不完全了解，因此在逐移后经过几个季节，种群常逐渐消失。拟黑多刺 蚁的天敌主要是鸟类，人为破坏也对其种群造成很大威胁。近几年，随着人们对 裂黑多刺毁医药方面价馕的认识逐步深入，从两辱致大量采集羧黑多刺蚁羯于制 药等方面，因而使得野生种群迅速减少。 1 3 2 接黑多刺蚁煦品级 在拟黑多刺蚁中，主要包括有雌蚁、雄蚁和工蚁3 种品级。 雌蚁亦即蚁后。个体较大，柄后节大，触角和足较短，生殖器官发达，一般 有翅，在交配赢脱落。每巢一般有3 至8 只，主要职能是繁殖产卵。 雄蚁的个体较小，有翅，触角细长，腹末端外生殖器发达、外露，与雌蚁交 配后不久便死亡。 工蚁在蚁巢内的数量和比例最大，其职能主要是觅食、喂养幼蚁、清洁蚁巢、 保卫等。无繁艇功能，无翅。魅焦发达，上颚芬发达，翼有一对落，可切断食妨 并进行战斗。工蚁可分为内勤和外勤两种，较小的工蚁做内勤，年龄长者做外勤。 1 3 。3 拟黑多刺蚁的发育 拟黑多蒯蚁巢内的卵、幼虫和蛹一直存在。其各阶段豹发育时间和外界环境 等因蘩有一定关系。每年9 月蕉1 0 月会出现有翅蚁。发育历期大致为：卵期1 5 至 7 天、幼虫勰2 3 至2 5 天、蛹期1 3 至1 6 天。完成1 个世代霈4 0 至6 0 天。掇 黑多刺蚁的活动主要集中在三到十月份，当气温较低9 左右时停止外出，气温进 一步下降时便入主丽鼹，气温憩低入土越漯。翌年春天3 月上旬开始上树营巢， 2 在较高的纬度地区，拟黑多刺蚁常在地面筑巢。 在拟黑多刺蚁的发育过程中，雌蚁刚产下的卵常常堆积在一起，呈米粒状、 卵圆形，乳白色或黄色。由负责内勤的工蚁进行孵化，经过一段时间的发育( 约4 至6 天) ，卵逐渐变为细长的椭圆形，淡白色、透明、表面光滑，此时即开始孵化。 初孵出的幼虫体长不到l 毫米，无足，呈蛆状，前端较细，常弯曲成半月形。经1 至2 天，幼虫头部外露，向内弯曲成钩状，腹部逐渐膨大，可透视腹中淡褐色内 容物。数日后腹部内容物消失，全体呈乳白色进入蛹期。此段时间( 约经2 0 至3 0 天) 内，幼虫由小长大，发育为成熟幼虫。在化蛹前，成熟幼虫停止取食，呈安静 状态，蜕去幼虫期态的皮化为蛹。初期的蛹为乳白色，头、胸、腹部分节明显， 触角、足裸露，弯曲排列于胸前；后期头、胸部及附肢变成淡黄色，腹部暗褐色。 成虫体色变黑，体长约6 至7 毫米，部分羽化为雄蚁和雌蚁。 外界环境对蚂蚁的生活史影响很大，特剐是温度，在适宣的温度范围内，温 度高，发育快；温度低，发育慢。但温度过高或过低都有可能抑制其发育或引起 死亡m 。 2c r e b 概述 探索学习记忆的分子机制一直是神经生物学的一个重要领域。其中，作为转 录因子的c a m p 反应序列结合蛋白( c a m pr e s p o n s i v ee l e m e n tb i n d i n gp r o t e i n ， c r e b ) 和c r e 调节基因( c a m pr e s p o n s i v ee l e m e n tm o d u l a t o r yg e n e ) 得到了越来 越多的关注。 c r e b 家族的转录因子调控着对多种信号通路反应的大量基因的表达，由其调 控的转录与多种生理功能相联系。研究表明，c r e b 与c a m p 等第二信号系统有着紧 密的关系，而这一信号系统在学习记忆过程中起着重要作用”3 。 c r e b 的基因序列存在着高度的保守性。它以一种转录因子的形式参与短时记 忆向长时记忆的转化o 。它具有激活型和抑制型两种，因而可以更加精细地调节记 忆的转化，在不同种属动物中已经得到证实。近年，对海兔、果蝇和小鼠的研究 确定了一些参与记忆巩固机制的基因，并且表明长时记忆的编码在非脊椎动物和 哺乳动物可能有着类似的作用机制 i 0 1o 2 1c r e b 的发现 c r e b 是m o n t m i n y 等人在研究生长抑素( s o m a t o s t a t i n ) 基因的表达与调节时 发现的。首先是1 9 8 6 ，m o n t r m i n y 等人发现许多c a m p 诱导转录的真核基因启动子 的周围都含有一致或者近乎一致的一个高度保守的8 碱基对的回文结构 5 一t g a c g t c a - 3 的d n a 片段，这一序列对于许多基因转录诱导是必需的，也是 这些基因识别c a m p 信号的重要部位，因此这一段序列被命名为c a m p 应答元件 ( c a m pr e s p o n s ee l e m e n t ) ，简称c r e “。在这之后的研究基因转录调节的过程中， m o n t m i n y 等又分离纯化到一种分子量为4 3 k d 的蛋白质，它与生长抑素基因的c r e 有着高度的亲和力，于是将它命名为c a m p 应答元件结合蛋白( c a m pr e s d o n s e e l e m e n tb i n d i n gp r o t e i n ) ，即c r e b ”“3 。 1 9 8 9 年，g o n z a l e z 通过胰蛋白酶水解从大鼠脑组织中纯化的c r e b ，得到了部 分c r e b 的序列资料，接着又成功的克隆出编码区长1 0 2 3 b p 、全长约1 5k b 的大 鼠c r e b 的c d n a 序列。将该c d n a 核苷酸序列所预示的氨基酸序列，与上述胰蛋白 酶水解片段测序结果加以比较，就得到了c r e b 一级结构的全部资料。 2 2c r e b 的分子结构 c r e b 由3 4 1 个氨基酸残基构成，n 末端为蛋氨酸，c 末端为天冬氨酸。c r e b 蛋白家族均包含碱性区( b a s i cr e g i o n ) 和亮氨酸拉链( 1 e u c i n ez i p p e r ) 区n 5 】。 根据c r e b 的一级结构对其进行分区，主要可分为谷氨酰胺富足区、激酶诱导区、 亮氨酸拉链区等。 谷氨酰胺富足区富含酸性氨基酸， 里面又具体荀分为q 1 和q 2 区。谷氨酰胺 富足区主要位于分子n 端的第l 至第2 7 6 位氨基酸残基肽段，与c r e b 发挥调节转 录功能有关。q 2 区是第4 1 位至第8 6 位氨基酸残基的肽段，q 2 区域可以与一些相 关的亚基如t f i i d 复合物、t a t a 结合蛋白相结合，在基因转录的调节中起辅助作 用1 。 ) 激酶诱导结构域位于c r e b 的第9 8 位至第。1 4 4 位氨基酸残基的肽段内，该区 也称为k i d 区，包含有许多种蛋白激酶的磷酸化位点，其中s e r l 3 3 是蛋白激酶 a ( p i ( a ) 和c a m k 的磷酸化识别位点“”。c r e b 的磷酸化有着非常重要的作用，可能因 此而引起了k i d 区的变构，这种构象的改变可能促进c r e b 的谷氨酸富集区发挥转 录的激活作用“8 “”。 亮氨酸拉链区位于分子c 端的第2 7 7 位至第3 4 1 位氨基酸残基肽段，这一区 域含有较多的碱性氨基酸。是c r e b 分子与d n a 结合的区域，其中有段约5 0 个 氨基酸残基的序列，亮氨酸周期性重复出现。这一结构具有较强的与d n a 的亲和 力，称为d n a 结合域。 此外，在c r e b 的结构中还有其他的一些区域，它们对于刺激转录以及调节转 录功能都有着重要的作用1 。 l 毪氨酰胺富集区锻酶诱导 答氨棼峰富集区 碱性匡亮氟酸拉链 。l 结构域 0 2 j ， o k 鼬e l l s p 2 , p s r r x i l n o i ：s s f i a p ”l j m 口z 、* * j 。 t c r 衄结构示意图 4 2 3c r e b 的家族及构成 c r e b 具有不同的亚型，同时它们又属于一个大的家族，因此其家族地位与其 结构特征具有重要的联系。 c r e b 基因组基因全长约4 0 k b ，包括多个外显子。由于c r e b 基因翻译起始位 点的变化以及不同的剪接方式，m r n a 稳定性的差异和翻译后修饰方式的区别等因 素的影响，使细胞内的基因表达产生了结构各异的c r e b 分子。 除c r e b 外，还有许多蛋白质具有与c r e b 相似的结构：即碱性区( b a s i cd o m a i n ) 和亮氨酸拉链区( 1 e u c i n ez i p p e r ，z i p ) ，合称b z i p 结构，与蛋白质的d n a 结合 活性密切相关。h a i 等于1 9 8 9 年通过交叉二聚体化实验及b z i p 结构上的氨基酸同 源性测定，划分出了一个c r e b a t f 的大家族，它们具有与c r e b 类似的d n a 结合 区，识别的序列也完全一致或近乎一致，但其中很多蛋白质的功能特性还不是十 分明确。在这个大家族中，c r e b 只选择性的与a t f l 和c r e m 形成异源二聚体，因 此，常把c r e b 、a t f l 和c r e m 这个亚家族称为c r e b 家族“2 。1 。 2 4c r e b 发挥作用的机制 c r e b 可能通过磷酸化的作用来产生生物学效应。目前己知，c r e b 分子是多种 蛋白激酶的磷酸化底物。其磷酸化受c a m p 通路、c a 2 + - c a m k 通路、r a s e r k 通路、 p 1 3 激酶a k t 通路、应激状态诱导的p 3 8 m a p k 通路以及磷酸酶反向调节通路等多 种信号转导通路的调控o “。 c r e b 信号转导示意图 c a m p 反应序列( c r e ) 是c a m p 信号识别的重要部位，它位于c a m p 诱导转录的 真核基因启动子周围，具有一定的进化保守性，广泛存在于真核生物许多基因启 动区。研究发现，c r e b 与c r e 的结合可以提高c r e 下游基因的转录活性。而c r e 的缺失则导致活性下降。可见，c r e b 与c r e 的结合可以使得相关的c a m p 信号通路 活化从而发挥不同的功能。5 。当c a m p 的水平发生变化时，可以使得p k a 被激活。 p k a 存在于细胞浆，由两个相同的催化亚基和两个相同的调节亚基组成。催化亚基 在核内的主要靶点是c r e b 。p k a 识别底物位点的结构特征是a r g a r g x s e r ( x 代 表任意氨基酸残基) 。c r e b 激酶诱导结构域中的s e r l 3 3 是p k a 的磷酸化位点。胞 浆c a m p 浓度升高时，两类亚基解离，游离的催化亚基首先磷酸化细胞质组分，随 后进入胞核主要对c r e b 以及其他一些核组分起磷酸化作用。“。由于c r e b 调节基 因转录的过程中需要涉及到一个催化亚基入胞核的过程，因此其调节速度比起核 外的代谢调节速度要慢”。 已经知道c a ”在细胞功能中发挥着重要的作用，并且调节许多蛋白，钙调素 便是其中之一。c a ”与钙调素结合后可以活化钙调素激酶i 、钙调素激酶i i 和钙调 素激酶。当胞浆中钙离子浓度升高时，它们便得到活化。钙调素激酶对c r e b 分 子的作用位点与p k a 的作用位点十分相近，并且两者都存在于激酶诱导结构域中。 钙调素激酶i 和钙调素激酶对c r e b 的磷酸化位点均为s e r l 3 3 ，其中钙调素激 酶在体内被c a 2 + 激活后可以对c r e b 起到调节作用啪1 。而钙调素激酶玎对c r e b 的磷酸化位点，除了s e r l 3 3 外还有s e r l 4 2 。s e r l 3 3 被磷酸化可以提高c r e b 转录 的活性，s e r l 4 2 被磷酸化则是抑制c r e b 调节转录的活性。”。有研究表明偶联的两 价钙离子还可以直接激活c r e b ，因此c a ”对c r e b 的作用和影响的角度可能是多方 面的。 包括神经营养因子在内的许多生长因子可活化酪氨酸激酶受体而激活几种信 号级联，其中特征最明确的是由多种激酶组成的r a s 细胞外反应激酶 ( e x t r a c e l l u l a rr e s p o n s ek i n a s e ，e r k ) 通道”1 。在这一通道中包括有多种激 酶及其家族成员。在对生长因子反应的细胞中，它们被活化后均可使c r e b 磷酸化 3 3 m 】 0 此外，通过酪氨酸激酶受体还可活化一种较次要的信号通路，即p i3 激酶a k t 通路。在一些情况下，p 1 3 激酶a k t 信号通路可能会影响c r e b 的活化。“。 由上所述可见，c r e b 调节转录的活性受磷酸化作用调控。磷酸化的c r e b 又可 通过磷酸酶调控失活进而起到反向调节的作用。目前已经知道至少有两种磷酸酶， 分别是p p l 和p p 2 a ，作为激活过程的反面，发挥去磷酸化作用来使c r e b 调节转录 的活性衰减。它们参与了c r e bs e r l 3 3 的去磷酸化过程。抑制了p p l 和p p 2 a 的活 性之后，可以防止由p k a 引起磷酸化的c r e b 的去磷酸化作用，从而增强其调节转 录的活性“。也有研究表明褪黑素能限制磷酸化后c r e b 调节转录的效果。通 过这些机制可以看到，不同的刺激和不同的信号通路可更为有效精确的调控c r e b 的生物学效应。 除了c r e b 自身的磷酸化以外，其发挥作用的机制还依赖其他的因素。如作用 的位点、c r e 8 结构的变化以及调节因子的作用等等。 有研究表明c r e b 在体内存在着完全磷酸化的二聚体，半磷酸化的二聚体和未 磷酸化的二聚体。c r e b 二聚体与c r e 的结合能力与单体比会有显著的提高，其中 磷酸化后的二聚体效果最强，而未磷酸化的则无效应。因此形成c r e b 二聚体可以 明显的增强转录的活性。对于c r e b 来说，其亮氨酸拉链区是形成二聚体的部位， 而钙依赖蛋白激酶p k c 对c r e b 的磷酸化则可以促进c r e b 分子的二聚化形成二聚 体。而除了c r e b 许多其他具有亮氨酸拉链结构的转录调节因子不同成员间也可 形成非活性的异型二聚体，它和c r e 结合就会对基因转录起阻遏作用。此外，有 人推测缺乏亮氨酸拉链结构的c r e m 亚型分子和c r e b 可能也起类似作用“”1 。 近年的一些研究表明，c r e b 结合蛋白( c r e bb i n d i n gp r o t e i n ，c b p ) 以及p 3 0 0 蛋白在c r e b 的作用机制中发挥着重要的用途。并不只是单纯的由于s e r l 3 3 被磷 酸化之后引起分子构象的变化从而刺激了c r e b 调节转录的活性。c