（发酵工程专业论文）液固两相高密度链霉菌s506菌剂制剂发酵条件研究.pdf

摘要 植物微生态制剂以其环境友好，作用广泛，成本低廉而广泛受到世界各国的重 视，成为当前研究与开发的热点。链霉菌( s t r e p t o m y c e s s p ) s 5 0 6 是从番茄根际土壤 中分离得到的具有防治多种根部病害，降解根系自毒物质和促生长作用的一株多功 能根际益生菌，在防治蔬菜连作障碍方面具有广泛应用前景。研制高密度、高效价 活菌制剂是将其推向实用的关键。 本研究以菌株$ 5 0 6 为材料，在摇瓶发酵水平上，对其液固两相发酵条件进行了 研究，确定了其最佳培养组成和发酵工艺参数。进行了曲盒条件下的放大试验，并 通过盆栽试验对获得的固体菌剂进行了使用效果试验。 采用单因子和正交试验方法，以种子活菌总量、种子活性、固体发酵延迟期为 指标，筛选确定了液体种子培养基配方和培养工艺参数。麸皮粉3 ，玉米粉3 ， 黄豆饼粉1 5 ，k n 0 30 6 ，k 2 1 - i p 0 40 3 ，甘油1 o ，n a c l0 4 ，c a c 0 30 3 ， f e s 0 40 0 5 ，m g s 0 40 0 5 ，自然初始p h 值，在装液量为1 0 0 m l 5 0 0 m l ，温度3 5 ， 转速1 5 0 r p m 条件下培养8 4 h 。该参数下培养得到的活菌总量为6 7 5 x 1 0 9 c f u m l 。 综合考虑发酵特性、生产成本和物料来源，以活菌与分生孢子产生量为检测指 标，优化确定了固体发酵培养基配方：麸皮l o o g ，k n 0 3o 1 9 ，m1 5 9 ，k 2 h p 0 4o 3 9 ， n a c l0 2 5 9 、c a c 0 30 8 9 ；确定的发酵培养基的培养条件为：自然p h 值，初始含水 量6 0 ，接种量1 0 ，种龄8 4 h ，温度3 0 ，发酵周期6 0 h 。在最优发酵条件下，固 体发酵活菌总量达到8 2 7 x 1 0 9 c f u g ，孢子数达到7 2 0 x 1 0 9 c f u g 。并且在该工艺参数下 生产的发酵型菌剂，其促生效价明显高于载体吸附型菌剂。 进行了曲盒条件下的固体发酵试验。优化确定了物料厚度为8 e r a ，翻曲时间为 3 0 h 。发酵7 2 h 得到活茵总量为8 4 7 x 1 0 9 c f u g ，孢子数为7 2 7 x 1 0 9 c f t l g 。对发酵产品 进行保存特性试验。在室温条件下保存8 个月后，活菌数量仍可达到6 8 9 x 1 0 9 c f - u g ， 存活率达到8 1 3 5 。结果表明产品有良好的保存特性。 获得的茵剂在设施番茄和黄瓜上进行了应用。使作物根系干重提高3 0 ，根长 增加2 0 以上；对根系病原菌的仿效达到8 0 以上。 关键词：链霉菌；液固两相；发酵；培养基；发酵条件 s t u d yo nl i q u i d s o f i df e r m e n t a t i o nt e c h n i c so f h i g hd e n s i t yp r e p a r a t i o n o fs t r e p t o m y c e s $ 5 0 6 a u t h o r ：m uy a n - k u i s u p e r v i s o r ：t i a nh o n g - t a o w a n gz h a n - w u m a j o r ：f e r m e n t a t i o ne n g i n e e r i n g a b s t r a c t t h e r e f o r et h ev e g e t a t i o nm i c r o - e c o l o g i c a li se n v i r o n m e n t a l l yf r i e n d l y , w i d ee f f e c t , l o w c o s t , i ti sw i d e l yc o n c e r n e db yt h ew o r l d , a n dh a sb e c o m ea ni n t e r e s tr e s e a r c ha r e & s t r e p t o m y c e ss p $ 5 0 6i so n eo fp g p rs w a i n si s o l a t e df r o mt o m a t or h i z o s p h e r e i tc o u l d e f f e c t i v e l yc o n t r o lr o o td i s e a s e so fm a n yv e g e t a b l e s ，a n dc o u l da l s os i g n i f i c a n t l yp r o m o t e r o o td e v e l o p m e n ta n dd e g r a d ea u t o t o x i c i t yo ft h er o o t t h es t r a i nh a dw i d ea p p l i c a t i o n p r o s p e c ti ne f f e c t i v e l yc o n t r o l l i n gc o n t i n o u sc r o p p i n yo b s t a c l e h o wt oi m p r o v ed e n s i t y a n dt i t e ro ft h eb i o g e nh a sb e e nt h ek e yf a c t o rt op u ti ti n t oa p p l i c a t i o n i nt h es t u d y , $ 5 0 6w a su s e da st e s tm a t e r i a l 1 1 1 co p t i m u ml i q u i d - s o l i dt w o p h a s e f e r m e n t a t i o np a r a m e t e r sw e r es t u d i e di nf l a s k 1 f 1 1 es c a l e u pt e s tw a ss t u d i e di nk o j it r a y , a n dt h es o l i dp r o d u c tw a so b t a i n e d n ek o j it r a ya m p l i f i c a t i o nt e s th a sb e e nd o n e ，a n d t h r o u g ht h ep o te x p e r i m e n t , a p p l i c a t i o ne f f e c tt e s th a v e b e e nc a r r i e do u tu s i n gt h eo b t a i n e d s o l i dp r o d u c t s e e da c t i v i t y , t h ea l i v ec e l l sa m o u n ta n dt h el a gp h a s eo fs o l i df e r m e n t a t i o nw e r eu s e da s t e s ti n d e x l i q u i ds e e df e r m e n t a t i o nc u l t u r em e d i u ma n dt e c h n o l o g i c a lc o n d i t i o n so f b i o g e n - s 5 0 6w e r es t u d i e db ys i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t sa n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t s n e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m u mp a r a m e t e r sw e r eo b t a i n e da sf o l l o w s ：b r a np o w d e r3 ， c o mm e a lp o w d e r3 ，s o y b e a nc a k ep o w d e r l 5 ，k n 0 3o 6 ，k 2 i - - d 0 4o 3 ，g l y c e r o l 1 0 ，n a c lo 4 ，c a c 0 3o 3 ，f e s 0 40 0 5 ，m g s 0 4o 0 5 ，n a t u y a lp h ，l i q u i dv o l u m e i n f l a s k10 0 m l 5 0 0 m l ，f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e 3 5 ，r o t a t i o ns p e e d 15 0 r p m , f e r m e n t a t i o nt i m e8 4 h u n d e rt h i sc o n d i t i o n , t h ea l i v ec e i l sa m o u n to fb i o g e n - s 5 0 6w i l l r e a c ht o6 7 5x10 9 c f u m l a l i v ec e l l sa m o u n ta n dc o n i d i t i ma m o u n tw e r eu s e da st c ：s ti n d e x b a s e do n c o m p r e h e n s i v ec o n s i d e r a t i o no ff e r m e n t a t i o nc h a r a c t e r i s t i c s ，p r o d u c t i o nc o s t sa n dm a t e r i a l s o u r c e ，t h eo p t i m u ms o l i df e r m e n t a t i o nc u l t u r em e d i u mw e r eo b t a i n e da sf o l l o w s ：b r a n10 0 舀k n 0 3o 1g ，m i n e r a lm a t t e rm 15 舀k 2 h p 0 40 3g ，n a c lo 2 5g ，c a c 0 3o 8 9 ；t h e o p t i m u mt e c h n o l o g i cp a r a m e t e rw e r e ：n a r l r a lp h , t h ei n i t i a lm o i s t u r ec o n t e n t6 0 ， i n o c u l u mv o l u m e10 ，l i q u i ds e e da g e8 4 h , f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e3 0 ，f e r m e n t a t i o n t i m e6 0 h u n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n s ，t h ea l i v ec e l l sa m o u n to fb i o g e n - s 5 0 6w i l l r e a c ht o8 2 7 x10 9 c f u g ，a n dt h en u m b e ro fc o n i d i u mi s7 2 0 x10 y c f u g t h ep r o m o t i n gp l a n t g r o w t ht i t e ro fb i o g e n $ 5 0 6p r o d u c e da tt h o s ep r o c e s sp a r a m e t e r sw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e r t h a nt h et y p eo fc a r r i e r e sa b s o r b i n g at e s tw a sm a d eo nt h ef e r m e n t a t i o np a r a m e t e ro fs o l i df e r m e n t a t i o ni nk o j it r a y 1 1 圯 o p t i m u mp a r a m e t e r sw e r eo b t a i n e da sf o l l o w s ：m a t e r i a lt h i c k n e s s8 c m ，t u r n i n gk o j ia t3 0 h , f e r m e n t a t i o nt i m e7 2 h u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s ，t h ea l i v ec e l l sa m o u n to fb i o g e n s 5 0 6w i l l r e a c ht o8 4 7 x10 y c f u g a n dt h en u m b e ro fc o n i d i u n li s7 2 7 x10 y c f u g 1 1 1 en u m b e ro fa l i v e c e l l sc a l ls t i l lr e a c ht o6 8 9 x10 ，c f u g , a n dt h es u r v i v a lm t ec a l lr e a c h81 3 5 a f t e rs o l i d b i o g e np r e s e r v e de i g h tm o n t h sl a t e ra tr o o mt e m p e r a t u r e 1 1 1 er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e p r o d u c t sh a dg o o dp r e s e r v a t i o nc h a r a c t e r i s t i c s i nt h ea p p l i c a t i o no ft h eo b t a i n e dp r o d u c ti np r o t e c t e dt o m a t oa n dc u c u m b e r , i tc o u l d i n c r e a s et h ed r yw e i g h to fr o o tc r o p sb y3 0 a n de n h a n c er o o tl e n g t ho v e r2 0 ，w h o s e c o n t r o le f f e c to nt h er o o tp a t h o g e n sw a sm o r et h a n8 0 k e y w o r d s ：s t r e p t o m y c e s ；l i q u i d - s o l i dt w o - p h a s e ；f e r m e n t a t i o n ；m e d i u m ；c u i t u r i n g c o n d i t i o n s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑皇垦盔些盘堂或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 繇穆、恕 学位论文版权使用授权书 7 莎月，日 本学位论文作者完全了解塑兰垦盔些盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑皇垦盔些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名匀鬯曙 签字日期：m 移年易月，日 电话： 邮编： 学 ，屉日一m ，。 月 穆乡 名 ? 签 m 者 玩一矽 文 期 论 日 位 字 液固两相高密度链霉菌$ 5 0 6 菌剂发酵条件研究 1 1 文献综述 1 1 1 连作障碍及其成因 1 引言 连作障碍是指在同一土壤中连续栽培同一种作物或近缘作物时，即使在正常的栽培管理情况 下也会发生长势变弱、产量和品质下降的现象。作物连作现象在世界各地普遍存在，主要以谷类 和蔬菜最为严重i l j 。 二十世纪8 0 年代以来，我国设施蔬菜栽培迅猛发展。目前，全国的设施蔬菜栽培面积已突 破2 0 0 万h m 2 ，逐步形成了以日光温室和各种类型塑料大棚为主体的设施栽培体系，对提高蔬菜 产量和产值，保证产品周年均衡供应发挥了重要作用。但是，设施蔬菜生产具有高度集约化、复 种指数高和作物种类单一等特点，随着种植年限的增加，容易引起连作障碍，导致蔬菜产量降低， 品质变劣盼川。 关于连作障碍，早在我国古代著名的齐民要术中就有记载。在日本称这类问题为忌地现 象或连作障碍【4 】。欧美国家称之为再植病害( r e p l a n td i s e a s e ) 、再植问题( r e p l a n tp r o b l e m ) 或再 植失败( r e p l a n tf a i l u r e ) 【) 。j 。 引起设施蔬菜连作障碍的原因是复杂的，是作物土壤两个系统内部诸多因素综合作用的结 果。国内外学者经过多年研究，将连作障碍的原因概括为三个方面：即土壤理化性质劣化、由根 系分泌物和残茬分解物等引起的自毒作用、以及土壤传染性病虫害。 土壤理化性质劣化：蔬菜连作影响土壤养分的分配和平衡。大棚内的连年栽培，对所需养 分年年不断吸取，土壤营养元素必然缺乏，而对其不需要或需要较少的元素则积累过多，土壤内 养分平衡必然失调；而且各种蔬菜根系分布有深有浅，年年连作根系吸收范围只固定在一定范围 内，同样会造成营养缺乏【7 】。其次，设施栽培施肥量大，密闭高温的环境中水分蒸发量大，而土 壤又不能得到雨水充分的淋洗，使土壤中的c a 2 + 、n 0 3 、s c 旷、c f 等离子大量积累，形成土壤 次生盐渍化嗍。土壤盐类积累后，造成土壤溶液浓度增加，土壤渗透势加大，作物种子的发芽、 根系的吸水、吸肥均不能正常进行。同时，随着盐浓度的升高，土壤微生物活动受到抑制，铵态 氮向硝态氮的转化速度下降，导致作物生长不良。 植物的自毒作用：某些植物可通过地上部淋溶、根系分泌和植株残茬腐解等途径来释放一 些物质对同茬或下茬同种或同科植物生长产生抑制作用，这种现象被称为自毒作用( a u t o t o x i c i t y ) 阴。自毒作用是一种发生在种内的生长抑制作用。目前，已分离出的自毒物质包括苯甲酸、肉桂 酸和水杨酸等。这些物质通过影响细胞膜通透性、细胞分裂和生长、离子吸收、水分吸收、光合 作用，蛋白质和d n a 合成等多种途径来影响植物生长。同时，植物根系分泌物的组成成分及数量 与土壤营养状况有关，营养不均衡不但直接导致作物连作障碍，而且也可通过改变根系分泌物种 类和数量从而间接地影响植物生长。 土壤生物学环境恶化：连作栽培条件下，作物根系分泌物和植株残茬腐解物给病原菌提供 了丰富的营养和寄主，长期适宜的温湿度环境，使病原菌具有良好的繁殖条件，从而使得病原菌 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 数量不断增加【1 0 l 。据吴凤芝报道，随着连作年限的增加，细菌种类和数量减少，土壤中真菌数量 减少，但有害真菌的种类和数量增加【l l 】。孙秀山等人指出，细菌型土壤向真菌型转变是连作障碍 的主要特征，根际真菌增多会显著抑制碱性磷酸酶活性【1 2 1 。 1 1 2 设施蔬菜连作障碍的防治 连作障碍的产生涉及到作物、土壤、环境等生物的、非生物的诸多复杂因素，加上这些因素 的相互影响，使得解决这一问题更加复杂，任何单一的措施或通过少数几个措施都很难收到理想 的效果。由于作物种类和栽培条件不同，作物发生连作障碍的主要原因也各有不同，而迄今为止 有关连作障碍的研究大都停留在单因子水平上，缺乏对其内在相互关系、相互影响的深入了解， 需要进行更深入、更广泛的研究和防治途经与方法的创新。目前，对于连作障碍的防治，主要采 用如下方法。 ( 1 ) 合理轮作，间作套种：不同作物间进行轮作倒茬是解决连作障碍最简单有效的方法， 包括疏菜间轮作及疏菜与水稻、对抗植物( 即具有通过释放抗菌物质来抑制病原菌功能的植物) 和净化植物( 即具有吸收土壤中过剩的盐分功能的植物) 等间的轮作。在解决蔬菜作物连作障碍 方面，轮作是目前应用比较广泛的一种方法，西瓜、辣椒、黄瓜、番茄等蔬菜作物的轮作技术已 经被广大生产者广泛应用。轮作可以有效地解决根系自毒物质问题以及作物残体所致的非土传病 害问题【1 3 】。如线辣椒实行3 5 年轮作既可有效地解决疫病问题，又可以提高产量和果实的商品性 ( 如果实较长，畸形果率下降等) 1 4 1 。但也有研究表明，轮作只能暂时缓解连作障碍，对于土传 病害、土壤盐化及酸化等连作障碍还需采取其它防治措施。 间作套种不仅可以提高土地利用率和单位面积的产出，而且可以部分解决连作障碍问题。如 在蔬菜生产中，葱蒜类与其它蔬菜作物间作，葱蒜类根系分泌物可以有效地杀灭某些有害病菌， 减少相关病害的发生。在陕西省关中地区，冬小麦与线辣椒的间作套种，可以明显减少线辣椒病 毒病发病率，同时使线辣椒整体生长量增加，产量提高，畸形果减少，缓解线辣椒连作所引起的 若干障碍：线辣椒与玉米问作套种可以部分地降低线辣椒疫病的发病机率，虽然其机理尚待进一 步探索，但其效果是显而易见的【”】。 ( 2 ) 降低土壤盐分积累：利用自然降雨淋洗和合理的灌溉技术，以水化盐，使地表积聚的 盐分稀释下淋。可通过深翻筑畦、雨水淋洗、膜下滴灌等方法改善土壤的生态环境，提高作物的 抗病性。此外可种植耐盐作物，以物除盐。不同疏菜种类具有不同的耐盐性，十字花科疏菜耐盐 性较强，果菜类较弱，根菜类中等。因此，合理地轮作一些耐盐疏菜品种，如菠菜、花椰菜等可 以减轻一定的土壤盐渍化1 1 6 j 。 在盐渍化较重的菜地，可以通过施用膨润土、石膏、硅藻土等非金属矿物质改善盐渍土壤结 构【1 7 】。张丽辉等以磷石膏作为土壤改良剂，在河套灌区杭锦后旗沙壕渠试验站进行小面积改良试 验，结果表明磷石膏改良盐碱地效果显著，具有推广应用的可行性【l 叼。王金满等的盆栽试验研究 表明施加脱硫副产物增加了出苗率，降低了碱化土壤的碱化度( e s p ) 、p i - i 、全盐量( t d s ) 和 n a + + k + c a 2 + + m 9 2 + 1 9 l 。虽然土壤改良剂见效快，但容易引入新的离子造成二次污染，且资金投入 和技术要求都很高，对大面积的土壤修复实施起来比较困难。如何降低成本，使高效的改良剂能 尽快的运用到实际中是今后有待解决的问题。 2 液固两相高密度链霉菌$ 5 0 6 菌剂发酵条件研究 ( 3 ) 科学施肥：氮磷钾化肥过多是造成设施疏菜连作障碍的原因之一，控制化肥用量、实 行测土配方施肥是减轻蔬菜连作障碍因子的关键措施。在合理施用化肥的同时，增施有机肥也是 减轻连作障碍的措施之一。总体而言，其机理主要是通过解决土壤次生盐渍化来缓解连作障碍【2 0 】。 吕卫光等研究表明，增施有机肥可以解决连作黄瓜自毒作用，主要机理是有机肥改善了土壤微生 态环境，提高了土壤中微生物的数量并增强其活力，土壤活性增强，促进了根系生长，提高了根 系活性，黄瓜根系对n 、p 、k 等养分的吸收能力增强，减轻了苯丙烯酸等自毒物质对黄瓜的自 毒作用口。 ( 4 ) 抗重茬品种的选用和嫁接栽培：不同作物及同一作物的不同品种对连作病虫害的抗性 和耐性差异较大，所以选育、选择抗( 耐) 重茬的品种也是解决蔬菜作物连作障碍的一个重要途 径。随着育种技术的发展，国内外已选育出很多对部分病虫害具有抗性的疏菜品种，如番茄的枯 萎病、黄萎病、根结线虫，甘蓝的黄萎病、黑腐病，萝卜的黄萎病，洋葱的干腐病等具有抗性的 品种。并且辣椒、西瓜等蔬菜作物的抗病害品种己经在生产上发挥了很大的作用1 1 4 1 。 利用嫁接技术防治根系病害，目前在生产上的作用也越来越重要，关于嫁接防连作障碍的机 理己部分搞清，主要是通过解决土传病害问题和蔬菜根系分泌物、残体分解自毒物等问题来解决 连作障碍。如在果菜栽培中采用抗性砧木进行嫁接栽培，可以有效地防止多种土传病虫害和线虫 的危害。嫁接已在黄瓜、甜瓜、西瓜、番茄和茄子等作物上利用，起到了很好的效果。但是培育 抗病品种存在着选育周期长、抗性资源缺乏、抗病性及优良的农艺性状难以兼得、病原小种的迅 速变异导致抗病品种出现抗性退化等缺点，在实际的生产应用中受到制约。 由于连作障碍成因的多样性，造成了上述方法在实施过程中都会遇到防治效果不稳定性、防 治成本高以及二次污染等弊端。调节植物根际微生态防治土传病害以其成本低、无毒无害、不产 生抗药性等优点，成为目前国内外研究的热点。 ( 5 ) 微生态调控：微生态调控主要是把大量活的拮抗微生物菌体施入土壤中，通过调节环 境、寄主和正常微生物种群的生态平衡，将病原物生物种群数量及危害程度控制在经济、社会、 生态效益允许范围之内田l 。目前研究和应用较多的微生物包括木霉、芽孢杆菌、荧光假单胞菌、 放线菌等属的一些种。木霉菌在自然界分布较广泛，易分离和培养，对许多病原真菌和病原细菌 有拮抗作用，其防病机制包括重寄生、抗生和空间竞争等瞄】。荧光性假单胞菌是植物促生菌的典 型代表，在用于土传病害防治方面己有较多的研究报道瞄】。芽孢杆菌具有广谱抗菌活性和极强的 抗逆能力，并能在真菌性病原菌丝体表而繁衍定殖，可有效抑制病菌生长，并能促进植株生长， 提高作物产量瞄2 6 】。放线菌是人们研究最早并应用到生产中的生防微生物，经过4 0 多年的不断 探索，己筛选出了能产生井岗霉素、内疗素、多效霉素和农抗1 2 0 等抗生素的链霉菌菌株。近几 年的研究1 2 7 2 3 】表明，链霉菌活菌体在防治根部病害、线虫侵染和促进根系生长方面具有广阔的应 用前景。 随着绿色环保理念的提出，我国在2 0 0 1 年农业“十五一规划和2 0 1 0 年远景规划纲要中，提 出了发展生态农业的战略，并把新型生物肥料、生物农药的研究列入“规划”和“纲要”。植物 微生态制剂完全适应现代农业生产中绿色农业、生态农业发展的需要。目前西方国家植物微生态 制剂的发展迅速，使用量己占到化肥使用总量的4 0 以上，如果我国植物微生态制剂的用量占化 肥总用量的1 0 ，其市场容量将达到1 4 0 0 万吨。可见，植物微生态制剂在今后我国的农业发展 中有着广阔的应用前景。 3 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 1 1 3 植物微生态调控及其研究进展 ( 一) 微生态学 微生态学( m i c r o e x ：o l o g y ) 概念最早由德国学者v o l k 盯r u s h 于1 9 7 7 年提出，并提出了定义， “微生态学是细胞水平或分子水平的生态学”。即是说，微生态学是生态学的微观层次。我国微生 态学奠基人康白1 9 8 8 年对微生态学的定义是：研究正常微生物群与其宿主相互关系的生命科学 分支”啷】。在此基础上，梅汝鸿又提出另外的一个微生态学的定义：即“生物个体是由细胞组织 和其体内微生物组成的复合体，研究生物体内微生物组成、功能、演替：微生物与微生物关系； 微生物与个体微环境关系的生命学科分支”。并指出生物个体内( 含体表) ，细胞壁、细胞膜以 外的生态环境为微环境。 微生态学主要是研究和揭示微生物系统与环境系统( 包括动植物) 间的相互作用及其功能表 达规律性，研究微生物之间及其与环境之间的关系和功能，以及微生物与动植物等宿主之间的相 互关系和功能等p o 3 1 1 。微生态学的形成和发展起源于医学界长期滥用抗生素而致使病原菌的抗药 菌株激增和对肠道正常菌丛的伤害和破坏，导致肠道菌丛失调或称生态失调。人们试图借助于有 益菌调节肠道菌丛的失调，恢复肠道微生态平衡，实现疾病的治疗。 实施微生态调控的物化载体是微生态制剂。微生态制剂( m i c r o e c o l o g i c s ) 又称为微生态调节 剂，是在微生态等理论指导下，运用微生态学原理，利用对宿主有益的微生物及其促生长物质经 特殊工艺制成的制剂。医学界于8 0 年代初开始推出双歧菌和乳酸菌等活菌制剂，开创了微生态 调节剂类型生物制品的先河。受医学微生态调节剂的启发，人们研制出了植物微生态制剂。北京 农业大学已故教授陈延熙先生及植物生态工程研究所的唐文华教授、梅汝鸿教授等科研人员研制 出了第一个植物微生态制剂一“增产菌”【3 2 1 ，开拓了农学研究的新领域，标志我国植物微生态学的 确立。 ( 二) 植物微生态调控菌株的选育 植物微生态环境中的微生物与植物存在共生关系，与植物的生长发育、营养物质的吸收、病 害控制等关系密切，通过调整植物微生态环境中的有益微生物数量，以实现作物的优质、高产。 目前，有关微生物制剂的研究与应用非常活跃，主要涉及促进植物生长和防治病害两方面。应用 于植物微生态制剂的菌株主要是从植物体内、体表处筛选获得。 促进植物生长的菌株主要是从植物微生态环境中筛选出具有固氮功能或可以代谢产生植物 生长调节物质的微生物。生物固氮作用存在于一些原核生物中，已经鉴定有固氮作用的微生物已 近5 0 个属，包括细菌、蓝藻、放线菌，其中与上述微生物共生，有固氮作用的豆科植物有6 0 多 个属，非豆科植物约1 3 个属。从细菌方面讲，被证实能参与联合固氮的细菌已达1 6 属3 0 种以 上。而植物内生固氮菌是指那些定殖在植物内部与植物宿主联合固氮的固氮菌。b a l d a m 等 3 3 1 将 内生固氮茵划分为专性内生固氮和兼性内生固氮菌。兼性内生固氮菌主要包括固氮螺菌 ( a z o s p i r i l l u ms p p ) 、成团肠杆菌( e n t e r o b a c t e ra g g l o m e r a n s ) 1 3 4 、阴沟肠杆菌( e n t e r o b a c t e rc l o a c a e ) 例 和粪产碱菌( a l c a l i g e n e sf a e c a t i s ) t 3 6 】等：专性内生联合固氮菌主要包括固氮醋酸杆菌( a c e t o b a c t e r d i a z o t r o p h i c u s ) 、草螺菌( h e r b a s p i r i l l u ms p p ) 、固氮弧菌( 4 z o a r c u ss p p ) 等。 4 液固两相高密度链霉菌$ 5 0 6 菌剂发酵条件研究 防治病害的微生态调控菌株是从植物微生态环境中筛选出的具有产生拮抗活性物质的微生 物。目前，国内外研究者主要筛选在根际有定殖能力的菌系，如根际促生菌( p g p r ) 等1 37 1 。此 外，在植物体内还存在着大量对病害具有良好防效的内生茵，这些菌定殖于植物体内，不易受外 界环境影响，可长期持续作用【3 8 】。在黄瓜、番茄、辣椒等多种蔬菜体内已分离筛选到具有防病或 诱导抗病作用的内生菌 3 9 1 。研究最广泛的真菌是木霉菌，其作用机理主要是竞争、抗生及重寄生 作用1 4 0 。比较重要的木霉种类有哈茨木霉( t r i c h o d e r m ah a r z i a n u ) 、绿色木霉亿v i r i d e ) 、康氏木霉 仃k o n i n g i i ) 、钩状木霉仃h a m a t u m ) 等1 4 种【4 l j ，但目前商业化的产品主要是哈茨木霉菌株和少量 绿色木霉菌株。有1 8 个属的细菌在植物土传病害的防治方面具有潜力，其抑茵机制主要包括对 营养基质的竞争、生态位点的排斥以及产生嗜铁素或抗生素等。目前，筛选得到具有抗病原真菌 活性的细菌主要为假单胞菌和芽孢杆菌属的一些菌株，除此之外根瘤菌( r h i z o b i u m ) 、固氮螺菌 ( a z o s p i r i l l u m ) 、节杆菌( a r t h r o b a c t e r ) 、土壤杆菌( a g r o b a c t e r l u ms p ) e 2 6 菌株等均对作物有一定的 抗病促生作用。用放线菌制成的活细胞制剂具有无毒、无残留、不伤害非靶标微生物、与环境兼 容性好、防病持效期长等优点。由灰绿链霉菌( s t r e p t o m y c e sg r i s e a v i d i s ) 的孢子和菌丝所制成的制 剂，可用来抑制一些常见土传病原菌，如腐霉菌( p y t h i u ms p p ) 、镰刀菌俾u s a r u ms p p ) 、疫霉菌 ( p h y t o p h t h o r as p p ) 、丝核菌( r h i z o c t o n i as p p ) 等。通过种子处理、土壤喷洒或灌根，可以使其在 植物根部定殖、生长和繁殖，阻止病原菌侵入，产生激素类物质，促进植物生长，但对植物本身 没有任何毒性哗j ( 三) 植物微生态制剂的作用机理 植物微生态制剂可以通过直接和间接两方面对作物起作用。直接作用即促生作用，指的是某 些植物促生菌可合成某些对作物生长发育有直接作用的物质( 如生长素等) 和( 或) 改变土壤中 某些无效元素的形态，使之有效化而利于作物吸收( 如固氮、解磷等) 。间接作用即防病抗病作 用，指的是某些植物微生态制剂能抑制或减轻某些植物病害对作物生长发育和产量的不良影响。 ( 1 ) 促进植物生长 促进植物根系生长是植物促生菌的一个主要特征。许多根际微生物可产生生长素、乙烯、细 胞分裂素、维生素及其他植物生长物质7 1 。在假单胞菌、枯草杆菌等5 0 个种中发现有4 0 多个种 产生植物生长激素，2 9 个种产生赤霉素，4 5 个种产生激动素。荧光假单胞杆菌产赤霉素、青霉 素、部分吲哚乙酸，维生素。恶臭假单胞茵分泌吲哚3 乙酸、吲哚3 乳酸、赤霉素等【4 3 卜1 4 6 1 。根 际益生菌产生的这些物质可以有效地促进植物根部生长，增大根的表面积，从而提高植物对土壤 有效成分的利用率1 4 7 】。 其次，降解农田污染物，促进作物营养吸收。研究表明，根际促生细菌对三氯乙烯、芳香族 化合物及除草剂有降解作用，如谷胱甘肽转移酶在革兰氏阴性菌若干属中存在，尤其在肠杆菌科 和假单胞菌属中的一些种，通过谷胱甘肽的结合作用除去除草剂中的氯；除此之外有利于土壤中 难溶性物质的分解，一些细菌能产生固氮酶，可在一定程度上固定空气中的氮素。在植物根际生 存繁衍的植物促生菌可将少量的固定的氮素供给植物，增加植物的生物固氮量，提高植物蛋白质 含量和植物产量【4 8 h s o i ；一些根际芽孢杆菌、黄单胞杆菌、假单胞菌等可生产大量的有机酸，使 土壤中不溶性磷溶解，从而加速土壤中无效磷的有效化，增加土壤中磷对作物的供应，增加作物 的养分m 5 2 1 。 5 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 ( 2 ) 防病抗病 植物促生菌并非专门对付某种病原微生物。然而，绝大多数促生菌在植物根系周围繁衍从而 具备保护植物免受或减轻病原微生物侵袭的功能。 竞争和定殖优势微生物之间的竞争作用包括两个方面，即营养竞争和位点竞争。在作物 根系表面存在一些分泌物较多，水分湿度大，适合细菌生长和繁殖的有利位点，根际益生菌可以 抢先占领这些位点，有效地利用根围营养和分泌物，减少了病原菌所必需的营养物质：或者占据 生态位点阻止和降低了有害菌在这些位点地建立【5 3 5 4 1 。h o w i e 等提出，p g p r 的菌株在根际的定 殖过程分为两阶段：1 活菌接触根部并随伸长的根尖被转运；2 活菌局部繁殖并在与原有的微生 物竞争的小生境范围内增殖并存活。通过比较对小麦全蚀病具有拮抗作用的荧光假单胞杆菌及其 抗生素缺失突变体对小麦全蚀病的抑制作用，研究表明单纯抗生素起的作用很小，营养和位点竞 争是发挥生防作用的关键瞄l 。 铁载体( s i d e r o p h o r e s ) 的作用铁是生命的基本物质，但土壤中能够直接被植物和微生物 利用的铁却有限，土壤中铁主要以状态存在f e 3 + ，一般无法满足土壤微生物繁衍和植物生长发育 的需要。然而，某些细菌和植物能分泌一种专门结合铁的小分子蛋白铁载体，可从土壤中收集铁 离子，形成铁嗜铁素复合体。促生菌和植物因都可接受利用铁嗜铁素复合体获得更多的铁元素， 在与不能产生或产生较少铁载体的有害微生物竞争铁元素养分时占有优势，进而抑制有害微生物 在根际的生长和繁殖并表现出生防作用m 。7 1 。 抗生作用从自然界中筛选具有抗生作用的菌株一直都是生物防治的重点内容，目前报道 的拮抗菌株主要集中在芽孢杆菌、假单胞菌、链霉菌等属中【5 8 】巾1 1 ，这些菌体能够分泌蛋白类抗 菌物质或者非蛋白类抗菌物质如吩嗪、2 ，4 - 二乙酰腾黄酚、硝吡咯菌素等，而且生长迅速，适应 性强，能够利用自然界中广泛存在的各种有机物，具有广阔的应用前景1 6 2 6 3 1 。 诱导系统抗性( i s r )许多植物本身具备一定的系统抗病性能，对多种病害具有一定的 抵抗能力。然而，某此植物的这种系统抗病能力需要一定的环境或微生物条件的诱导才能形成有 效的抗病机制。近年来，对于p g p r 的作用机理的深入研究逐渐表明，除了竞争作用和拮抗作 用以外，p g p r 诱导产生的系统抗性是又一重要方面。i s r 就是利用生物或者非生物因子处理植 物，使之形成的物理的或者化学的防御障碍，从而产生的抗性。例如，一些芽孢杆菌可以分泌低 分子量的丁二醇类物质从而诱导植物高表达量产生茉莉酸及水杨酸类物质，从而有效降低由欧文 氏菌引起的软腐病【鲫，t a n u j as i i l 曲等利用荧光假单胞茵诱导c h i c k p e a 对c h a r c o a lr o t 的抗性进行 生物防澍蛔，2 0 0 3 年r y u 报道了细菌产生的挥发性有机物( v o l a t i l eo r g a n i cc o m p o u n d s ，v o c s ) 可 刺激a r a b i d o p s i s 的生长，并诱导对e r w i n i as p p 的i s r 6 7 1 。利用p g p r 诱导植物抗性的提高，或 激活植物防卫基因的表达，从而达到生防效果的提高，是生物防治策略的一个进步，使得生防技 术摆脱以往单纯依靠定殖与拮抗作用的局面，因而对环境更加友好。 ( 3 ) 其他机制 提高植物的抗逆性有些植物微生态制剂的特殊微生物可提高宿主的抗早性、抗盐碱性、 抗极端温度、湿度和p h 值、抗重金属毒害等能力，提高宿主植物的逆境生存能力。如a m 真菌 肥料有一定抗旱能力，不同菌株之间的抗旱能力有明显差异，并已筛选出抗旱菌株。林先贵等利 用a m 真菌菌种接种白三叶草( t r i f o l i u mr e p e n s ) 的研究结果表明，在相当于日间持水量2 0 的土 壤水分条件下，虽然三叶草总生长量有所下降，但接种处理的植物其地上部分干重仍然高于对照， 6 液固两相高密度链霉菌$ 5 0 6 茵剂发酵条件研究 增幅达2 5 - - 3 3 。王幼珊等在土壤含盐量高达4 9 k g 的情况下，筛选到的摩西球囊霉菌( g l o m c e s m o s s e a e ) 9 3 a m 菌株对植物有较好的促生效果，不仅植物生长量比对照高2 2 ，植物含磷量也比 对照增加3 7 1 。 对农作物产品品质的改善有试验证实某些微生态制剂能通过一些目前还不十分了解的 作用机理，如降低作物体内硝酸盐的积累达到改善产品品质的效果。 综合作用降低化肥用量的效应这在很多微生物肥料的实际使用中都已得到证实，其具体 的机理还须进一步研究 1 1 4 植物微生态制剂的发酵工艺 对于植物微生态制剂的发酵工艺，国内外许多工作者进行了长期不懈的探索，先后经历了液 体深层发酵、固态发酵和液固两相发酵几个阶段。 ( 一) 液体深层发酵( s u b m e r g ef e r m e n t a f i o i l s m f ) 将活化的菌种接种到发酵罐，进行深层液体培养，经过滤、浓缩或载体吸附、干燥，制得菌 剂。液态发酵有如下优点：液体悬浮状态是许多微生物的最适生长环境：液态环境利于菌体、底 物、产物的扩散，使发酵在均质条件下进行，便于检测、控制，易扩大生产规模：液体输送方便， 易于机械化操作。液态发酵设备和发酵控制系统在生产中逐渐完善，目前已经广泛应用于医药、 化工、食品等行业。 但对于生产植物微生态制剂而言，液态发酵的产品存在孢子数量少、活力低，孢子耐受力差、 不易保存等缺陷【6 8 j ，而且液体发酵设备投资大，产品制作成本高，菌体的代谢产物不能有效地利 用，不仅污染环境还降低了使用效果。所以该法不适用于植物微生态制剂的规模化生产。 ( - - ) 固态发酵( s o f i ds t a t ef e r m e n t a t i o n , s s f ) 该方法是指利用麸皮、米糠、稻壳等农作物纤维素颗粒做碳源及能源，或利用聚氨酯等惰性 固体颗粒做支持物( i n e r ts u p p o r t ) ，在没有或基本上没有游离水的固态基质上的发酵过程【6 明。 其主要特点是发酵体系没有游离水存在，微生物在有足够湿度的固态基质，从固体颗粒中汲取水 分，微生物的生长及所形成的产物均处于基质表面。固体基质不仅起到一个提供碳源、氮源、水 分