（材料学专业论文）共沉淀共混两步法制备羟基磷灰石丝素蛋白复合支架材料的研究.pdf

浙江理i ：人学硕十学位论文 摘要 羟基磷灰石( h a ) 丝素蛋白( s f ) 复合材料由于具有较好的力学性能、生物相容性 及骨传导活性，且h a 在结构和组成上与骨基质相似，与骨骼具有很强的键合能力，是一 类较有前途的骨科固定和修复材料。但由于无机纳米粒子和有机高分子单纯物理共混，存 在着无机有机两相问界面结合差，材料力学性能尚不能满足骨科固定和修复需要，材料降 解速率与骨组织生长速度不匹配等缺陷。 为了克服以上缺陷，我们采用共沉淀共混两步法研制了纳米羟基磷灰石与丝素蛋白多 孔复合材料。本文首先通过共沉淀法在分子水平上制备了丝素蛋白与h a 的纳米针状复合 物，即s h a ，再将其与丝素蛋白共混，通过冷冻干燥制成复合支架材料s h a s f 。用x 射 线粉末衍射仪( x r d ) 、扫描电子显微镜( s e m ) 、透射电子显微镜( t e m ) 、傅立叶变换 红外光谱仪( f t i r ) 、热重分析仪( t g a ) 、万能压力试验机等分析了复合材料的晶相组成、 微观形貌、化学结构、热稳定性，降解性能和机械性能。最后，通过细胞培养评价了复合 支架材料的生物相容性。主要从以下几个方面开展工作： 1 在超声波辅助作用下，采用共沉淀法将s f 分子与h a 纳米粒子进行复合，并研究 丝素蛋白含量和离子浓度对羟基磷灰石晶体结构及形貌等影响，确定了制备s h a 的工艺 条件。在s h a 复合粉末中，s f 蛋白与纳米h a 结合稳定，s h a 为分散均匀的针状晶体。 2 采用共混法将s h a 与s f 蛋白复合，通过冷冻干燥制成复合多孔支架材料s h a s f 。 x r d 和f t i r 分析结果表明：复合支架材料中s f 具有热力学稳定性及力学性能良好的d 一 折叠构象；通过对复合支架微观结构的观察发现，三维支架材料具有良好的贯通性，孔隙 分布均匀，孔径均一，为1 0 0 2 0 0g m 左右；s h a 颗粒在s f 基体中具有更均一的分散性， 而且针状的s h a 提高了复合支架材料的力学强度，支架材料的压缩模量和压缩强度分别 达到3 1 2m p a 和3 5 0k p a 。同时，支架材料具有较高的空隙率，良好的持水性和一定的生 物降解性能。 3 本研究通过在复合支架材料上种植人成骨细胞m g - 6 3 ，进一步研究了复合材料的 生物相容性。培养3d 、5d 、7d 后，观察细胞的增殖，测定了其生物学特性。细胞支架 复合体的体外细胞培养实验表明：m g 6 3 细胞在s h a s f 复合支架上粘附铺展良好，并分 泌细胞外基质。s h a s f 支架材料有利于细胞的黏附，增殖和生长，可以促进细胞碱性磷 酸酶( a l p ) 活性的表达，并且可以诱导骨钙素( o c ) 分泌增加，促进细胞成骨性能的表 浙江理工大学硕士学位论文 达，是一种理想的复合生物材料。 综上所述，复合支架材料s h a s f 具有良好的生物相容性，提高了其细胞黏附和增殖 性能，针状的s h a 复合物提高了复合材料两相间界面结合力，增强了材料的分散性和稳 定性。孔径均匀的s h a s f 复合多孔材料可以用作骨组织工程的支架材料，从而为组织工 程多孔支架材料的制备提供了新的思路和方法。 关键词：纳米羟基磷灰石 丝素蛋白纳米复合材料组织工程支架生物相容性 i i 浙江理t 大学硕十学位论文 a b s t r a c t t h eb i o d e g r a d a b l em a t e r i a lo fh y d r o x y a p a t i t ea n ds i l kf i b r o i n ( h a s f ) p o s s e s s e sg o o d b i o c o m p a t i b i l i t ya n do s t e o c o n d u c t i v i t y b e c a u s eo fs i m i l a rc o n s t i t u t e st ob o n em a t r i x ，t h e c o m p o s i t ep o s s e s s e sg r e a tb o n e - b o n d i n gp r o p e r t i e s i ti sak i n do fp r o m i s i n gm a t e r i a lf o rb o n e f i x a t i o na n dr e p a i r h o w e v e r , o r g a n i cm a c r o m o l a c u l ea n di n o r g a n i cn a n o p a r t i c l e so ft h e c o m p o s i t ea r eb l e n d e dp h y s i c a l l y ，a n dt h ep o o ri n t e r f a c ea d h e s i o no ft w op h a s e s ( h aa n ds f ) r e s u l t si ni l ls t r e n g t hp r o p e r t yu n s u i t e df o rb o n ef i x a t i o na n dr e p a i r m o r e o v e r ，t h ed e g r a d a t i o n p e r i o do fm a t e r i a li su n e q u a lt ob o n eg r o w t hs p e e d i no r d e rt oo v e r c o m et h ed i s a d v a n t a g e s ，t h en o v e lc o m p o s i t eo fn a n o h aa n ds fw a s p r e p a r e db yc h e m i c a lc o p r e c i p i t a t i o nm e t h o da n ds o l u t i o nm i x i n g n a n o h as u r f a c ew a sg r a f t e d b ys ft op r e p a r en e e d l e - l i k en a n o h a s fc o m p o s i t e ( s h a ) ，t h e nb l e n d e dw i t hs ft og e tt h e c o m p o s i t e s s - h a s f b y m e a n so f f r e e z e d r y i n g t h ec o m p r e h e n s i v e e v a l u a t i o no f p h y s i c o - c h e m i c a lp r o p e r t y , m e c h a n i c a ls t r e n g t ha n db i o c o m p a t i b i l i t yw e r ep e r f o r m e db ys e m ， x r d ，f t i r ，t g a ，c e l lc u l t u r e ，e t c as e r i e so fe x p e r i m e n t sh a db e e nd e s i g n e da sf o l l o w s ： 1 w i t ht h eh e l po fa nu l t r a s o n i c ，t h eh a s f ( s h a ) c o m p o s i t ew a sp r e p a r e db yc h e m i c a l c o p r e c i p i t a t i o nm e t h o d t h ee f f e c to fm a n yc o n d i t i o n ss u c ha ss fc o n t e n ta n di o nc o n c e n t r a t i o n w e r es t u d i e d ，a n dt h eo p t i m a le x p e r i m e n tc o n d i t i o nw a sd e c i d e d t h en h ao ft h es - h a c o m p o s i t ee x h i b i t e d n os e r i o u sa g g r e g a t i o n ，a n dw a si na na p p r o x i m a t eh o m o g e n e o u s n e e d l e - l i k em i c r o s t r u c t u r e 2 t h ea s p r e p a r e dh y d r o x y a p a t i t e ( s - h a ) s i l kf i b r o i n ( s f ) c o m p o s i t es c a f f o l d sw e r e p r e p a r e db ys o l u t i o nm i x i n g t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h es i l kf i b r o i nw e r ei ni b - s h e e ts t r u c t u r e ， r e s u l t i n gi nt h eh i g ht h e r m a ls t a b i l i t ya n dm e c h a n i c a lp r o p e r t i e so fs c a f f o l d s t h ea s - p r e p a r e d s - h a s fs c a f f o l d ss h o w e dh i g h l yi n t e r c o n n e c t e da n dp o r o u ss t r u c t u r e t h eg e n e r a ls i z eo f p o r e s o b s e r v e dw a su n i f o r m ，w i t had i a m e t e ro fa r o u n d10 0 - - - 2 0 0p , m m o d i f i e dh a p a r t i c l e sh a dg o o d u n i f o r md i s p e r s i o ni ns f s fo ns - h as u r f a c ec o u l de x t e n di n t os fm a t r i xa n de n h a n e 宅t h e i n t e r f a c ea d h e s i o nb e t w e e nt h et w op h a s e s t h ec o m p r e s s i v em o d u l u sa n ds t r e n g t ho ft h e m a t e r i a lw a si n c r e a s e dt o3 1 2m p aa n d3 5 0k p a i na d d i t i o n , t h es - h a s fs c a f f o l d ss h o w e d h i g hp o r o s i t y , i n t e r c o n n e c t e dp o r e s ，a n db i o c o m p a t i b i l i t y , w h i c hc o n f o r m e dt ot h er e q u e s to ft h e s c a f f o l d s 浙江理1 ：人学硕+ 学位论文 3 t h eb i o c o m p a t i b i l i t yo ft h ec o m p o s i t es c a f f o l d sw a sa s s e s s e d b ye x a m i n i n gt h e m o r p h o l o g y , p r o l i f e r a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o no fo s t e o b l a s tm g - 6 3c e l l s a f t e r3 d ，5 d ，7 d c u l t u t i v a t i o n m t fr e s u l t ss h o wt h a tt h es - h a s fi sb e t t e rb e n e f i tt om g 6 3t h a nn o r m a lh a s f i ti sb e n e f i tt om g 6 3a d h e s i o nd i f f e r e n t i a t i o na n dp r o l i f e r a t i o n a tt h es a m et i m et h er e s u l t so f a l pa n do ci n d i c a t e dt h a tt h es h a s fc a l lp r o m o t et h ea l pe x p r e s sa n di n d u c et h eo c p e r s p i r e s ot h es - h a s fb i o m a t e r i a lw a s as a t i s f i e db i o m a t e r i a l b a s e do nt h ee v i d e n c e sf r o mt h ee x p e r i m e n t s ，t h en e wb o n er e p a i rm a t e r i a lo fs - h a s f s h o w ss a t i s f a c t o r yb i o c o m p a t i b i l i t ya n dg o o da b i l i t yo fc e l la d h e r e n c ea n dp r o l i f e r a t i o n t h e n e e d l e l i k es - h ac o u l de n h a n c et h ei n t e r f a c ea d h e s i o nb e t w e e nt w op h a s e s ，a n dt h ed i s p e r s i v e c a p a c i t ya sw e l la st h es t a b l ea b i l i t yc o u l da l s ob ei m p r o v e d t h e s ep o r o u ss c a f f o l d sw o u l db e p r o m i s i n gm a t e r i a l si nb o n et i s s u ee n g i n e e r i n g k e y w o r d s ：n a n o - h y d r o x y a p a t i t e ；s i l kf i b r o i n ；n a n o - c o m p o s i t e ；s c a f f o l df o rt i s s u ee n g i n e e r i n g ； b i o c o m p a t i b i l i t y l i 浙江理工大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师 的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰 写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：衣 ! ) 金炎 同期： 2 一1 7 年 1 月j 毕日 浙江理工大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保密、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权浙江理工 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在年解密后使用本版权书。 不保密团 。 学位论文作者签名： 函) 金炙 r 期： 2 口口1 年1 月i ￥日 指导老师签名：砌当面，f 1 刍 嗍：节月，巾 浙江理下大学硕士学位论文 第一章绪论 天然骨是由生物大分子构成的连续相和弥散于其基质中的羟基磷灰石纳米晶粒 ( n h a ) 所组成的具有优异力学性能的生物复合体。羟基磷灰石( h y d r o x y a p a t i t e ，h a ， 【c a l o ( p 0 4 ) 6 ( o h ) 2 】) 是天然骨无机相的主要成分，约占天然骨总重量的6 0 7 0 ，在天然骨 中呈细针状结晶，尺寸小于1 0 0 n m ，大多沉积在胶原纤维中，结晶衔接成链状，沿纤维轴 向平行排列，使骨硬挺坚实；天然骨中的生物大分子主要是以纤维状态存在的胶原蛋白 ( 9 0 为i 型胶原) 。骨纤维主要是由胶原蛋白构成的，骨胶原纤维有规则地分层排列，构 成骨支架，赋予骨弹性及韧性，晶体在其构成的三维网络中生长，每层的纤维和基质呈板 状结构即骨板，骨细胞夹在骨板之间。 有研究表明胶原网络结构在维持天然骨的柔韧性方面起了重要作用，从材料科学的角 度出发，天然骨可被看作是一种弹性高分子聚合物增韧的羟基磷灰石基复合材料【1 3 】。 1 1 组织工程与骨修复材料 1 1 1 组织工程概念 组织工程( t i s s u ee n g i n e e r i n g ) 一词最早是1 9 8 7 年美国科学基金会( n s f ) 在华盛顿 举办的生物工程小组会议上提出的。1 9 8 8 年，n s f 的一个专f q d , 组对组织工程的内涵做了 这样的定义：“应用工程科学和生命科学的原理和方法，来认识哺乳动物正常或病理状态 下组织与器官的结构一功能关系，并开发具有生物活性的人工替代产物，以达到恢复、维 持或改善组织、器官的功能”【3 】。 组织工程学的基本原理和方法是将在体外培养、扩增的正常组织细胞种植到具有良好 生物相容性且在体内可逐步降解吸收的组织工程多孔支架上，形成细胞支架复合物，细胞 在支架上增殖、分化，然后将此复合物植入机体组织病损部位，在体内继续增殖并分泌细 胞外基质，伴随着材料的逐步降解，形成新的与自身功能和形态相适应的组织或器官，从 而达到修复病损组织或器官的目的【4 1 。 1 1 2 组织工程多孔支架 在组织工程学中，种子细胞依赖于支架材料细胞外基质的存在才能发挥功能。因此， 种子细胞的支架材料的选择十分重要。骨组织工程材料不仅影响种子细胞的生物学特性和 培养效率，而且决定移植后能否与受体很好地适应并结合在一起，从而发挥其修复骨缺损 的作用。因此，在组织工程研究中，细胞支架材料起中心作用，它不仅为特定的细胞提供 浙江理【人学硕十学位论文 结构支撑作用，而且还起到模板作用，引导组织冉生和控制组织结构。 1 1 2 1 组织工程多孔支架应具备的条件 组织工程技术的关键是建立由细胞和生物材料构成的三维空问复合体( 如图11 所 示) ，然后植入体内以修复和替代病损组织和( 或) 器官】。多孔三维支架是一种能够为 组织工程提供细胞基质，维持细胞增殖、保持其分化功能，提供暂时的力学支撑，满足组 织修复和重建要求的材料，随着其不断降解和细胞的繁殖，形成新的其有与自身功能和形 态相应的组织或器官：这种具有生命力的活体组纵或器官能对病损组织或器宫进行结构、 形态和功能的重建，并达到永久替代。因此，获得一种理想的生物相容性支架材料是骨组 织工程中一个十分重要而紧迫的任务，也是组织工程化骨组织能否血用于临床的关键因素 之一。 圆? 十 t ! j m 胞支架村荆1 纛1 瓣 删l _ 1 细胞和生物材辩构成的三维空间复台体 近年来的研究表明 7 ，”，选择和设计组织工程细胞外支架材料必须满足下列条件： 1 ) 有良好的生物相容性：除满足生物材料的一般要求，如无毒、不致畸之外，还要利 于种子细胞粘附、增殖，降解产物对细胞无毒害作用，不引起炎症反应，利于细胞生长和 分化。 2 ) 具有一定的孔径和互相沟通的三维立体多孔结构：支架材料应具有三维立体结构， 合适的孔尺寸和高的孔隙率，具有较高的面积体积比。这种结构可提供宽大的表面积和空 问- 利于细胞粘附生长、细胞外基质沉积、营养和氧气进入及代谢产物的排出，也有利于 皿管和神经长入。 3 ) 良好的可生物降解性：支架材料在完成支架作用后应能降解，井最终能被机体代谢 和吸收，且其降解产物不对细胞繁殖产生小利的影响，降解率应与组织细胞生长率相适应 降解时间应能根据组织生长特性作人为调控。 嚏一 浙江理丁人学硕+ 学位论文 4 ) 一定的柔韧性：能使之既能同机体组织缝合并贴合，又不会对机体组织造成机械损 伤等。 5 ) 良好的材料一细胞界面：材料应能提供良好的材料细胞作用界面，利于细胞粘附、 生长，更重要的是能激活细胞特异基因表达，维持正常细胞表型表达。 6 ) 可塑性和一定的机械强度：支架材料具有良好的可塑性，可预先制成特定的三维形 状，并具有一定的机械强度，为新生组织提供支撑，并保持一定时间直到新生组织具有自 身生物力学特性。 1 1 2 2 组织工程支架的制备方法 组织工程多孔支架材料主要分人工技术加工合成支架和天然生物衍生支架材料两类， 它们的孔形态主要有纤维网络，多孔海绵或泡沫，以及相连管状结构三种。目前，通常所 说的支架材料主要是天然生物衍生材料，其形状大多是具备高孔隙率、高比表面积的多孔 海绵，其制备方法很多，常用的有化学发泡，冷冻干燥，颗粒沥滤，热诱导相分离以及最 新的多孔支架一体化制备( 快速成型法) 等 9 - 1 5 】。这些采用不同理化技术制备的天然生物 衍生材料，其抗原性较弱，并有良好的组织亲和性和结合力，其天然的孔隙结构大小形状 规则，为细胞的粘附、增殖、分化、成骨提供了天然的三维空间结构。这些材料来源丰富， 制作简便，并在功能适应性、组织相容性、理化性能、生物降解性、造价等方面优于人工 合成材料。， l 、化学发泡法 将聚合物溶液与碳酸氢铵粒子混合至粘糊状后加入到模具内，待溶剂部分挥发后浸入 热水中发泡，使氨和c 0 2 挥发，最后经冷冻干燥可得到高孔隙率和互相连通的多孔支架【1 3 l 。 2 、相分离乳化 包括液液相分离和乳化冷冻干燥【1 6 1 。液液相分离是聚合物溶液在低于溶剂的熔点下 冷却，真空干燥使溶剂挥发，采用该法得到的泡沫孔隙率达9 0 ，孔直径约为1 0 0p , m 。该 技术也使用有机溶剂，但可操作性好。相分离冷冻干燥法是指聚合物溶液、乳液或水凝胶 在低温冷冻过程中发生相分离，形成富溶剂相和富聚合物相，然后经真空冷冻干燥去除溶 剂而形成多孔结构的方法【1 7 1 。按体系形态的不同可分为乳液冷冻干燥法、溶液冷冻干燥法 和水凝胶冷冻干燥法。其优点是：1 ) 避免了高温，有利于生物活性分子如蛋白质或生长 因子的引入以及控制释放；2 ) 孔比表面积大，易操作；3 ) 通过调整油水比、聚合物分子 量来控制孔结构。支架孔隙率可达9 0 - - , 9 5 ，孔径范围在0 0 1 , - , 2 0 0 岬f 1 8 】。 3 、静电纺丝 3 浙江理一r 人学硕+ 学位论文 静电纺丝是一种简便易行的新型组织工程多孔支架制备方法。电纺的原理是利用外加 电场力使聚合物溶液或熔体克服表面张力在纺丝喷头毛细管尖端形成射流，聚合物射流沿 不稳定的螺旋轨迹弯曲运动，随溶剂挥发，射流固化形成亚微米至纳米级超细纤维。目前 已有超过1 0 0 多种高分材料被成功地电纺成纳米纤维，所得单根纤维的直径从4 0 2 0 0n m ， 并用于组织工程研究【1 9 】。由于电纺丝的孑l 尺寸较小，一般在1 0 0 岬以下，甚至更小，细 胞很难进入支架内。而且，电纺丝的热稳定性和力学支撑性均较差。因此，人们正在尝试 新的纺丝方法，以使其适合组织工程的需要，如将聚合物与水溶性高分子同时进行电纺丝 制备复合支架，以求获得更大的孔径。 4 、热致凝胶法 聚合物溶液经过热致凝胶化、溶剂交换和冷冻干燥等步骤制备细胞外基质骨架，高凝 胶化温度得到片晶状结构，低凝胶化温度得到纳米级结构【2 0 2 。采用该技术制备的骨架的 孔隙率高达9 8 5 ，孔径在5 0 , - - 5 0 0l a m 。纳米级纤维基质的表面体积比高出粒子沥滤技术 制备的跑沫约2 3 个数量级。此新技术制备的高度多孔结构因同时具备生物可降解性和细 胞外基质的纳米结构而更类似于天然细胞外基质。 5 、计算机辅助的快速成型方法 快速成型技术指首先经计算机辅助设计获得三维模型，然后根据工艺要求进行分层， 将三维模型分割为连续的二维截面图像，通过不断重复堆积和逐层加工，一步获得同时具 有预先设计的孔结构和外形的三维多孔支架。包括层压技术、立体平板印刷、熔融堆积成 型法、激光烧结和三维打印技术等。通过这些技术，可以获得类似人体组织结构和器官外 形的支架材料，并可以实现组织工程器官支架制备的个性化2 2 1 。例如，对某一骨缺损患者， 可先行x 线或c t 扫描，获得缺损部位的影像，经计算机c a d 软件设计出三维骨模型， 通过打印技术制备出特定尺寸和外形的骨支架，用于患者的骨缺损修复。 6 、超临界c 0 2 气体发泡法 超临界c 0 2 气体发泡法，是指将聚合物挤压成型，浸泡在高压c 0 2 中直至饱和，甚至 超临界状态，然后迅速降至常压，气体的热力学不稳定性导致气泡成核和增长，形成多孔 支架。该方法的优点是避免了在制备过程使用有机溶剂，而且还避免高温，有利于在温和 的条件下引入生长因子。 7 、颗粒沥滤法 颗粒沥滤法利用的是组织工程材料和致孔剂粒子之间的溶解性或是挥发性的差别，去 除致孔剂粒子后，其所占空间便成孔隙，氯化钠、酒石酸钠、柠檬酸钠等水溶性无机盐是 4 浙江理工人学硕士学位论文 常用的致孔剂粒子，也可用石腊粒子或是冰晶粒子，并可通过改变致孔剂粒子的大小来改 变多孔支架的孔径大小【2 3 1 。 1 1 3 骨修复材料 在骨科领域，由于严重创伤、骨肿瘤、骨髓炎等多种原因所致的骨缺损十分常见，采 取何种材料、以何种方式进行骨移植术，直是人类几个世纪以来不断深入研究的重要课 题。目前常用的骨修复材料包括自体骨和金属假体。自体骨虽然是理想的骨缺损修复材料， 但自体取骨增加了患者的创伤和痛苦，并且供骨的来源有限，难以满足大段骨移植的要求； 金属假体存在松动、断裂、组织相容性差、不可降解等问题。因此，研制理想的人工骨替 代材料移植修复骨缺损，成为医学和生物材料学领域的研究重点。人们现在已经开发了纳 米人工骨、珊瑚羟基磷灰石人工骨、磷酸钙骨水泥人工骨、陶瓷人工骨等，这些不同的骨 替代材料具有不同的材料学特性、生物相容性及其在骨缺损修复中的应用特点【2 4 1 。 近年来，材料科学、组织工程学和纳米技术的快速发展使各种复合材料人工骨、组 织工程构建人工骨相继研制成功。一般临床对人工骨的要求包括： 1 ) 生物相容性好，无毒副作用。 2 ) 有良好的韧性、强度、刚度、抗疲劳性、长期稳定性。 3 ) 便于消毒而不变形、不变性、不变质；轻便、价廉、易于加工、可塑形。 然而单一材料人工骨虽然具有良好的生物相容性和生物活性，能够和自然骨组织形成 牢固的生物性键合，且有高的强度和耐磨、耐蚀性、化学稳定性等，但材料的抗弯强度低、 脆性大，在生理环境中的抗疲劳与抗破坏强度不高。 在过去的几十年里，越来越多的兴趣被放在无机有机复合生物材料的发展上，以模仿 天然材料骨骼，软骨等的组成和结构。在许多天然材料中，无机矿物质和有机分子以一种 组织良好的方式共存。利用不同性质的无机和有机材料复合而形成的复合生物材料人工 骨，不仅可兼具组分材料人工骨的性质，而且可以得到很多单组分材料不具备的新性能。 目前用于骨组织工程的材料有羟基磷灰石、胶原、壳聚糖、丝素、聚乳酸、氧化铝和聚己 酸内酯等【2 5 刁。其中羟基磷灰石、丝素、胶原和壳聚糖因为具有良好的生物相容性和良好 的成骨能力而被大量应用骨组织工程材料的研究，它们对细胞有良好的吸附能力并且有利 于细胞增殖。 众所周知，天然骨骼是一种复合材料，含有约7 0 的矿物相，主要是羟基磷灰石( h a ) ， 还有3 0 的有机母质。正是无机与有机相的这种独特的和谐揭示了均相多孔微结构，同时 赋予天然骨足够的机械韧性和弹性，使其可以作为脊椎动物身体的支架。从仿生学角度出 浙江理t 大学硕f 学位论文 发，羟基磷扶石成为制备人工骨替代材料首选的无机相材料。 1 2 羟基磷灰石研究概况 对于病变组织的修复与替换，临床上主要采用生物材料进行治疗。随着材料科学技术 和临床医疗技术的发展，生物材料的研究和应用越来越深入和广泛，其市场需求量也愈来 愈大。例如硬组织替换，随着人口老龄化的现象越来越严重，老年人群中常见的骨质疏松 所带柬的骨折等并发症，运动和交通运输增加随之带束的创伤；各种骨科疾病，如肿瘤、 骨髓炎及骨关节病等疾病带来的骨组织的病变或缺损等，以及治疗其它疾病的药物所带来 的副作用，均需要应用骨替换或填充材料。目前骨缺损的组织和功能修复主要依赖于自体 骨和同种异体骨，但由于自体骨来源有限，同种异体骨存在来源有限、免疫原性的问题， 两种材料均不能满足临床应用的需求。为了解决临床上骨替换材料需求各种人工台成生 物材料应运而生，用以替换受损或者需要修复的硬组织部位。目前已广泛应用于临床的人 工合成的旨替换材料中，由于磷酸钙生物材料具有与自然骨组纵无机质相似的成分，具有 优良的4 e 物相容性和生物活性因此临床使用的骨替换材料6 0 是磷酸钙基生物材料【删。 钙磷生物陶瓷而世己经有8 0 多年的历史，钙磷生物活性陶瓷如羟基磷扶石( h a ) 、磷 酸三钙( t c p ) 及羟基磷扶右磷酸：钙复合材料( h a t c p ) 等由于原料易得，成分和结 构与旨相似，牛物相容性好，很早就被用作骨修复，替换材料。其中羟基磷扶石作为自然骨 的组成成分，具有报高的生物活性和生物相容性，与骨组织的键合能力强，是良好的骨组 纵缺损填充材料，凼而引起了人们的极大的研究热情，是日前研究较多的一种生物活性材 料。 1 2 1 羟基磷灰石的晶体结构 图1 2 羟基碡灰石的晶体结构 0 0 0 0 浙江理t 大学硕十学位论文 羟基磷灰石属于六方结构，晶胞常数为a ：b = 9 4 3a ，c = 6 8 8a ，c a p 原子比为1 6 7 ， 晶体结构如图1 2 所示【3 0 , 3 1 】。从图中可以看到，o h 。位于晶胞的四个项点上，l o 个c a 2 + 分 别占据两种位置，4 个c a 2 + 分别占据z = 0 和z = l 2 位置，另外6 个分别占据z = l 4 和z = 3 4 位置，6 个p 0 4 3 。分别位于z = l 4 和z = 3 4 位置【3 2 l 。但是事实上自然界中的羟基磷灰石晶体 结构不完善，结合有少量的碳酸根、氟、镁、钠及柠檬酸等离子。 1 2 2 羟基磷灰石的表面性能 羟基磷灰石表面主要存在两种吸附位置：当o h 位于晶体表面时，该位置连着两c a 2 + 离子，在水溶液中，这个表面的o h 。至少在某一瞬间空缺，由于c a 2 + 离子带两个正电，形 成一个吸附位置，称为c 位置，c 位置能吸附p 0 4 孓、大分子的磷酸根基团或羟基。当c a 2 + 位于晶体表面时，一部分这种位置连着六个带负电的o 原子，另一部分这种位置连着三个 带负电的o 原子，在水溶液中，表面至少在某一瞬间空缺，连着六个原子的c a 2 + 位置就形 成了一个较强的吸附位置，称为p 位置，p 位置能吸附s r 2 + 、l ( + 等阳离子以及蛋白质上的 官能团。而连着三个原子的c a 2 + 则形成一个较弱的吸附位置【3 3 1 。 羟基磷灰石的表面水化层通过氢键与水相有很好的相容性，因此h a 在水中表面能较 低，能长时间保持细小的分散状态。 h a 的表面电荷主要是c a 2 + 和o h 。，这主要是由于在所有定势离子中h a 对这两种离 子吸附能力最强【3 4 1 ，其表面能够和人体组织通过键合被吸收和取代因此具有骨传导作用， 与组织形成骨性结合。 1 2 3 羟基磷灰石的制备方法 自从2 0 世纪7 0 年代r 本学者a o k ih 和美国学者j a r c h om 相继合成羟基磷灰石后， 各国都对羟基磷灰石材料进行了大量的基础研究和临床应用研究。纳米h a 粉体的制备方 法很多，大致可以分为干法合成( 固相反应法) 和湿法合成( 溶液反应法) 两大类。 l 、干法合成 已有文献报道【3 5 3 6 c a o 与c a h p 0 4 在乙醇中研磨生成h a ；c a 2 p 2 0 7 与c a c 0 3 在丙酮 和水中研磨生成h a 。也有文献报道【3 7 1 ，不需要乙醇、酮和水做溶剂，c a h p 0 4 和c a c 0 3 研磨6 0h 可生成2 2 3 9n m 的h a 粉体。 目前通常采用的方法是c a 3 ( p 0 4 ) 2 或c a c 0 3 和c a 4 p 2 0 9 在1 2 0 0 。c 的高温下通入水蒸气， 通过固相反应合成h a 。该法的优点是可以得到无晶格缺陷和结晶程度高的h a 晶体。缺 点是原料粉末需要长时间混磨，易污染，反应速度慢，产物粒径大，产物的活性较差。故 般不用干法合成纳米级别的h a 粉体。 7 浙江理1 ：人学硕十学位论文 2 、湿法合成 1 ) 水热合成法，其基本原理是：在较高的压力和温度下，将钙盐和磷酸盐按钙磷比 1 6 7 混合均匀，放入特制密闭的高压锅内，加入蒸馏水。按一定加热速度升至不同温度， 在指定温度下进行水热反应，从而使 o h 加入品格中生成h a 。其反应式如下所示： c a h p 0 4 十h 2 0型二竺竺- h a p 该法最大的优点是产物直接为晶态，无须烧结晶化，避免了烧结过程中的团聚问题。 粒度均匀、形态比较规则；而且改变反应条件可以得到不同晶体结构和结晶形态的产物。 随着水热合成温度的提高和时间的延长，晶粒发育越完整、粒度越大。寥其龙等【3 8 】采用 c a c 0 3 和c a h p 0 4 2 h 2 0 的混合物为前驱物，在2 0 0 。c 下经8h 的水热反应，合成了晶粒尺 寸和组成与人骨相似的h a 纳米晶体。但此法对设备要求较高，需要耐高温、高压的密闭 容器。一般情况下，通过该法可以得到高纯度、高有序度、结晶较好、粒径大于o 1 m m 的 h a 晶体粉末。产物可在荧光、激光材料、催化剂载体等方面得到应用。 2 ) 沉淀法，其基本原理是：一般采用c a ( n 0 3 ) 2 和( n h 4 ) 2 h p 0 4 在p h 值一定的条件下 在常温或加热条件下进行滴定，反应生成h a 。 沉淀法生成的h a 颗粒尺寸分布范围宽，且颗粒分散度低。用添加剂改性或冷冻干燥 可以减少颗粒尺寸及改善颗粒分散度。江听【3 9 1 等利用十二烷基硫酸钠作添加剂制备出粒径 为8 0n m 的h a 。沈翔等【删选用聚g _ , - - 醇、六偏磷酸钠等分散剂对化学沉淀法制备的h a 进行水中分散性试验研究，实验结果表明，选用合适的分散剂可以有效消除h a 的团聚现 象，得到分布均匀的纳米颗粒。 3 ) 微乳液法，其基本原理是：利用两种互不相溶的溶剂在表面活性剂的作用下形成 一个均匀的乳液，从乳液中析出固相。朱敏鹰等【4 1 1 以c a c l 2 和( n h 4 ) 2 h p 0 4 为原料，采用水 溶液( w ) 环己烷( o ) t d t o nx - 1 0 0 ( s ) 正戊醇( a ) 反相微乳液体系制备出粒径为2 0 - - 6 0n t n 的 球状羟基磷灰石颗粒。 微乳液法由于其制备的粉体粒度分布窄，且容易控制而日益受到重视。 4 ) 溶胶凝胶法，其基本原理是：利用金属无机盐或金属醇盐在溶液中的水解或醇解 生成溶胶，经脱水或干燥转变为凝胶，然后经焙烧得到所需粉体。郭海峰等【4 2 】用硝酸钙醇 溶液和五氧化二磷醇溶液，以溶胶凝胶法制备出了尺寸分布十分均匀的纳米羟基磷灰石球 状颗粒。 该方法工艺过程简单，产物组成容易控制且无需大型设备。但合成h a 过程中，所得 8 浙江理r 火学硕十学位论文 胶体的重复性低、胶体不均匀、颗粒尺寸分布较宽，成本较高。 以上简单介绍了目前制备纳米羟基磷灰石的几种常用方法。具体工艺方法应依据设 备、成本及产品用途而定。化学沉淀法制备纳米羟基磷灰石具有以下优点：( a ) 反应温度 较低，一般为室温或稍高温度；( b ) 制备粉体颗粒较小、均匀，各组分化学计量比容易控 制；( c ) 可以保证最终产品的纯度：( d ) 工艺简单，操作简便，对实验设备要求不高。故本 研究在超声波处理辅助下采用化学沉淀法制备纳米针状羟基磷灰石晶体。 1 2 4 纳米羟基磷灰石高分子复合材料 随着纳米材料与技术的发展，纳米磷灰石粒子增强聚合物复合材料正在引起人们的重 视。为克服h a 多孔陶瓷的脆性大、韧性不足及力学性能差和不可降解等缺陷，人们考虑 将h a 超细粉末与聚合物进行复合，并通过干法水热法、沉淀法、溶胶凝胶法( s 0 1 g e l ) 和微乳液法等多种合成方法实现了微米、亚微米或纳米h a 的制备。合成方法获得的h a 纳米粒子，无论从尺寸、结构和组成都与人体中骨骼中的磷灰石微晶相似。将h a 纳米粒 子与力学性能好的可降解聚合物复合制备的纳米复合材料，具有超出常规生物材料的一些 特殊性能： 1 ) 尺度小，比表面积大，结晶度低，更有利于其体内的吸收利用； 2 ) 改善了加工性能，强度高，韧性可调； 3 ) 与骨组织的生物相容性和力学相容性好，能与自然骨组织形成生物性键合，呈现 引导骨组织生长的特性，显示出良好的骨科应用前景。 由于单一类型材料难以满足骨组织工程细胞外基质材料的要求，将几种单一材料进行 适当组合，结合有机材料与无机材料的优缺点，合成羟基磷灰石可降解高分子复合材料， 在实际应用中取得良好效果。n h a 可降解高分子复合材料的构想源于天然组织，从材料 学的角度来看，自然骨就是由尺寸小于1 0 0a m 的h a 晶体紧密地嵌入胶原基体中构成的 n h a 胶原复合材料。h a 赋予骨压缩强度，胶原纤维赋予骨拉伸强度和弯曲强度【4 3 1 。从成 骨的生物矿化过程来看，自然骨可以看作是由有机高分子引导n h a 定向沉积而形成。 1 2 4 1 常见的羟基磷灰石纳米复合材料 l 、纳米羟基磷灰石( n h a ) 胶原( c 0 1 ) 复合材料 目前，已经有研究人员利用仿生自组装的方法制备出了n h a 和胶原的复合材料。 t a m p i c r i 掣删制备出仿生n h a c o l 复合骨支架材料，与普通的微米h a c o l 复合材料相比， 具有骨修复能力强、生物可降解性高、生物活性与生物相容性好等优点。w u 等【4 5 】制备n h a 胶原微球用于骨修复，复合材料具有诱导和促进骨生长的功能，并最终能被吸收。崔福斋 9 浙江理= 人学硕十学位论文 掣4 6 , 4 n n 备的n h a 胶原复合骨材料，胶原蛋白占总质量的3 5 ，与天然骨成分接近。该材 料修复家兔颅骨缺损实验中发现明显促进了骨愈合的过程，新骨生成活跃，l o 周时有骨岛 形成，1 2 周时达到骨性连接，空白对照组仅在有少量新骨形成，新骨形成不活跃。 研究表明，n h a 胶原仿生骨材料具有生物相容性好，能有效促进骨组织的再生、加快 骨创伤愈合等特性，是一种有前途的骨缺损修复材料。但目前的n h a 胶原复合材料力学强 度较低，溶胀度高，体内生物降解太快，不能满足临床对骨修复材料的要求。 2 、纳米羟基磷灰石( n h a ) 壳聚糖( c t s ) 复合材料 壳聚糖是n 乙酞基葡糖胺残基组成的黏多糖，其结构类似于细胞外基质( e c m s ) 中 的糖胺聚糖( g a g s ) 。壳聚糖生物相容性好，能促进创伤愈合，并有抗菌性和黏附性。脱 乙酰化度适宜的壳聚糖利于细胞黏附与增殖。 为了提高h a 陶瓷的机械性能，制备了h a c t s 多孔复合材料，x u 等【4 8 】对复合材料 的力学性能和生物行为进行了深入的研究。当复合材料中c t s 含量为1 5 时材料的弯曲强 度达到了2 5m p a 左右，两倍于纯h a 陶瓷的弯曲强度。生物活性实验结果表明，鼠成骨 细胞( m c 3 t 3 e 1 ) 可以黏附到h a c t 多孔支架上并在其表面延伸和增殖，而且可以渗透 到多孔支架的孔隙当中。此外，高的力学性能和良好可模压性能，使该材料有可能应用于 一些大型承重骨的修复上。所以，h a c t s 复合材料作为一种骨组织工程材料具有很大的 应用潜力。 3 、纳米羟基磷灰石( n h a ) 聚乳酸( p l a ) 复合材料 在二十世纪九十年代初，人们已经开始了h a p l a 骨折内固定材料方面的研究【4 9 一， 最近几年研究相当活跃，研究内容涉及该复合材料的制备、机械性能、界面组织结构、生 物相容性及生物降解行为等方面。实验结果初步表明h a p l a 复合材料具有良好的生物相 容性和骨传导能力，而骨传导能力这一特点是自增强聚乳酸( s r p l a ) 和纯p l a 等骨折 内固定材料所没有的而且h a 与p l a 复合后，h a 可从三维方向均匀增强材料强度，又可 减慢p l 的降解速度。研究结果表明，经特殊设计模具成型的h