（应用化学专业论文）利用膜生物反应器微生物转化丙烯酰胺的研究.pdf

哈尔滨理t 大学t 学硕卜学位论文 利用膜生物反应器微生物转化丙烯酰胺的研究 摘要 丙烯酰胺是一种用途广泛的精细化学产品，相对传统的固定化细胞批式 反应工艺而言，游离细胞膜生物反应器工艺具有工艺简单，成本低，菌体利 用率高，无污染等优点。 本文前期探讨了高效腈水合酶产生菌r h o d o c o c c u ss p h u s t - 2 培养条件 的优化，然后设计和应用了一种新的游离细胞膜生物反应器的工艺，来取代 传统的生产工艺，期待实现工业化应用。 首先，通过研究菌体发酵过程中产酶的规律，提出了调节p h 值，补 加葡萄糖和诱导剂的菌体优化培养方案。使发酵液腈水合酶的活力提高到 4 0 0 0 u m l 以上，比酶活达到2 2 4 7 u m g ( d c w ) 左右，大大高于现有工业生 产中的酶活。 然后，通过对膜材料的截留性能、膜通量、膜抗污染性能和膜抗溶胀性 能等方面性能评价，选择聚砜中空纤维超滤膜作为膜组件的膜材料。并采用 反应器和中空纤维膜组件串联的膜生物反应器形式，它具有操作方便，结构 简单合理，易于清洗等优点。还从水力学的角度对膜组件工作状态建立了数 学模型和优化设计，这对工业化过程中膜组件的设计有重要的指导意义。 最后在膜生物反应器工艺平台上开发设计了单级非稳态工艺和单级拟稳 态工艺两种工艺过程，并进行了可行性研究。实验结果表明：这两种工艺过 程各有特点，在生产效率和菌体利用率等方面都优于现有的固定化细胞生产 方式。 在单级非稳态工艺过程中，根据对产品浓度要求不同的情况。开发和验 证了三个不同反应批次单级非稳态工艺过程。生产效率均在0 0 2 m o l l m i n 以上，6 批次反应菌体利用率最高为0 7g a m m g 。从生产效率和菌体利用 率来看，应用单级非稳态过程的膜生物反应器比现有的固定化细胞催化生产 方式更有优势。该工艺过程路线简洁，操作简单应该是日后丙烯酰胺小型工 业化生产理想的选择。 在单级拟稳态工艺过程中，从反应温度和菌体加入方式两个方面对单级 拟稳态工艺过程进行了优化设计。结果发现单级拟稳态工艺过程在2 0 c 下 哈尔滨理工大学t 学硕士学位论文 操作，菌体悬液以滴加的方式进入反应体系，会使生产效率和菌体利用率有 较大程度的提高。最后还进行了单级拟稳态工艺的生产应用，整个生产过程 持续了2 0 小时，反应速率稳定，产品浓度为3 1 3 1g l 。该工艺过程很适 合丙烯酰胺大型工业化生产的要求。 关键词丙烯酰胺；腈水合酶；反应条件优化；膜生物反应器 i i 哈尔滨理工大学t 学硕 ：学位论文 m e m b r a n eb i o r e a c t o ru s e di n b i o c o n v e r s i o nf o r a c r y l a m i d e b l 0 c 0 n v e r s l o nc r y l a m i d e a b s t r a c t a c r y l a m i d ei saf i n ec h e m i c a lp r o d u c tw h i c hw a sw i d e l yu s e d c o m p a r e d w i t ht h et r a d i t i o n a li m m o b i l i z e dc e l l sb i o c o n v e r s i o np r o c e s s ，t h en e w t e c h n o l o g y o fb i o c o n v e r s i o n c o u p l e dw i t h t h em e m b r a n es e p a r a t i o nh a d p o s s e s s e dm a n ya d v a n t a g e sa sf o l l o w ：p r o c e s ss i m p l i f i c a t i o n ，l o wc o s t ，h i g h u t i l i z a t i o nr a t i oo fc e l l sa n df r e ef r o mc o n t a m i n a t i o ne t c t of u r t h e rp r o m o t et h ei n d u s t r i a lp r o d u c t i v i t yo fa c r y l a m i d e ，t h ec u l t u r e t e c h n i q u e so fr h o d o c o c c u ss p h u s t - 2s t r a i nw e r ei m p r o v e di nt h ep r i o rp e r i o d o fo u rs t u d y ，a n dan e wt e c h n o l o g yo fb i o c o n v e r s i o nc o u p l e dw i t ht h e u l t r a f i l t r a t i o nm e m b r a n e s e p a r a t i o n ，i nw h i c h ah o l l o w f i b e rm e m b r a n e b i o r e a c t o rw a sd e s i g n e da n dt h ef r e ec e l l sw e r eu s e da sb i o c a t a l y s t si nt h e m i c r o b i a lb i o c o n v e r s i o no fa c r y l o n i t r i l et oa c r y l a m i d e ，w a sp r e s e n t e dt or e p l a c e t h et r a d i t i o n a lt e c h n o l o g y f i r s t l y ，b yi n v e s t i g a t i n g t h e d i s c i p l i n a r i a n o fe n z y m e p r o d u c t i o n i n f e r m e n t a t i o np r o c e d u r e s ，t h ec u l t u r a lc o n d i t i o n sf o rt h eg r o w t ho fr h o d o c o c c u s c e l l sw e r eo p t i m i z e d ，i n c l u d i n gt h ec o n t r o l l i n go fp hv a l u ea n dt h ed e s i g n i n go f s u p p l e m e n t a ls c h e m eo fg l u c o s ea n di n d u c e r b yt h ea b o v ei m p r o v e m e n tt h e a c t i v i t yo fn i t r i l eh y d r a t a s e ( n h a s e ) r e a c h e do v e r4 0 0 0u m l ，a n dt h es p e c i a l e n z y m ea c t i v i t yo fn h a s e r e a c h e d2 2 4 7 u m g ( d c w ) ，w h i c hw e r em u c hh i g h e r t h a nt h a ti nt o d a y si n d u s t r y t h e n ，a f t e rt h ep e r f o r m a n c et e s ta n de v a l u a t i o no fm e m b r a n em a t e r i a l ， w h i c hi n c l u d e di n t e r c e p t i o n ，m e m b r a n ef l u x ， a n t i - p o l l u t i o n a n da n t i - s w e l l i n g ，t h ep o l y s u l f o n eh o l l o w - f i b e ru l t r a f i l t r a t i o nm e m b r a n ew a sc h o s e nt o b et h em a t e r i a lo fm e m b r a n em o d u l e t h em e m b r a n em o d u l ew a ss e r i a l l y c o n n e c t e dt ot h eb i o r e a c t o r ，i tw a sp r o v e dt h a tt h en e wp r o c e s sh a sm a n y a d v a n t a g e s s u c h a s e a s yo p e r a t i o n ，s i m p l ec o m p o s i t i o n a n d e a s y i i i 哈尔滨理工大学工学硕 ：学位论文 c l e a n i n g m a t h e m a t i cm o d u l e ，o p t i m i z a t i o nd e s i g n a n dc a l c u l a t i o nw e r e c a r r i e do u tf o rt h em e m b r a n em o d u l ef r o mt h ep o i n to fv i e wo fh y d r a u l i c s ，t h i s h a ss h o w nd i r e c t i v es i g n i f i c a n c eo fm e m b r a n ed e s i g ni ni n d u s t r i a lp r o d u c t i o n p r o c e s s f i n a l l y ，t w od i f f e r e n to p e r a t i o nm o d e s w e r es i m u l t a n e o u s l yd e v e l o p e d , i e s i n g l e s t a g ea n s t e a d yo p e r a t i o n ，s i n g l e s t a g ef a l s e s t e a d yo p e r a t i o n ，b a s e do n t h en e wt e c h n o l o g yp l a t f o r mo fb i o c o n v e r s i o ns y s t e mc o u p l i n gw i t h t h e m e m b r a n es e p a r a t i o na n dt h ef e a s i b i l i t yo ft h e s eo p e r a t i o nm o d e s w e r e c o n f i r m e di nl a b s c a l e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h et w oo p e r a t i o nm o d e sh a d t h e i rr e s p e c t i v ec h a r a c t e r i s t i c sa n dh a dp o s s e s s e dm a n ya d v a n t a g e sc o m p a r e d w i t ht h et r a d i t i o n a lo p e r a t i o nm o d e si np r o d u c t i v i t ye f f e c ta n du t i l i z a t i o nr a t i oo f c e l l se t c i ns i n g l e s t a g eo n s t e a d yp r o c e s s ，w ed e v e l o p e da n dd e s i g n e dt h r e ek i n d s o fd i f f e r e n tr e a c t i o nb a t c hs i n g l e - - s t a g eb n - s t e a d yp r o c e s s e sa c c o r d i n gt od i f f e r e n t d e m a n d so fp r o d u c tc o n c e n t r a t i o n a l lt h ep r o d u c t i v i t ye f f e c t sh a de x c e e d e d 0 0 2 m o l l m i na n dt h eh i g h e s tu t i l i z a t i o nr a t i oo fc e l l sw a s0 7g a m m gi nt h e p r o c e s so f6 - b a t c h e sr e a c t i o n t h i ss i n g l e - s t a g el m - s t e a d yp r o c e s sw i l l b et h e i d e a lc h o i c ei nm i n i a t u r ei n d u s t r i a lp r o d u c t i o no fa c r y l a r n i d eb yr i g h to fi t s s u c c i n c tt e c h n o l o g ya n dc o n v e n i e n to p e r a t i o n i ns i n g l e s t a g ef a l s e s t e a d yp r o c e s s ，o p t i m i z a t i o nd e s i g n sw e r ec a r r i e do u t f o rt h ep r o c e s si nt w ow a y so fr e a c t i o nt e m p e r a t u r ea n dt h ea d d i n gm o d eo f c e l l s w ef o u n dt h a tp r o d u c t i v i t ye f f e c ta n du t i l i z a t i o nr a t i oo fc e l l sh a dr a i s e d t r e m e n d o u s l y ，i ft h ep r o c e s sw a sp e r f o r m e dt a t2 0 a n dt h es u s p e n s i o nw a s a d d e di n t ot h er e a c t i o ns y s t e mb yk e e p i n gc o n t i n u o u s f l o wa d d i n gm o d e a t l a s t ，t h i ss i n g l e s t a g ef a l s e s t e a d yp r o c e s sw a st a k e ni n t oa p p l i c a t i o n ，t h e w h o l ep r o c e s sh a dl a s t e do v e r2 0h o u r s ，r e a c t i o nr a t ew a sk e p ts t e a d ya n dah i g h p r o d u c tc o n c e n t r a t i o no f3 13 1g lc o u l db ea c h i e v e d t h i sk i n do fp r o c e s sw i l l b ef i tf o rt h el a r g es c a l ei n d u s t r i a lp r o d u c t i o no fa c r y l a m i d e k e y w o r d sa c r y l a m i d e ，n i t r i l eh y d r a t a s e ，o p t i m i z a t i o no fr e a c t i o nc o n d i t o n s ， m e m b r a n eb i o r e a c t o r i v - 哈尔滨理工大学硕士学位论文原创性声明 本人郑重声明：此处所提交的硕士学位论文利用膜生物反应器微生物 转化丙烯酰胺的研究，是本人在导师指导下，在哈尔滨理工大学攻读硕士 学位期间独立进行研究工作所取得的成果。据本人所知，论文中除已注明部 分外不包含他人已发表或撰写过的研究成果。对本文研究工作做出贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式注明。本声明的法律结果将完全由本人承 担。 作者签名：考侈云天 日期：二彦年华月i 日 哈尔滨理工大学硕士学位论文使用授权书 利用膜生物反应器微生物转化丙烯酰胺的研究系本人在哈尔滨理工 大学攻读硕士学位期间在导师指导下完成的硕士学位论文。本论文的研究成 果归哈尔滨理工大学所有，本论文的研究内容不得以其它单位的名义发表。 本人完全了解哈尔滨理工大学关于保存、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向有关部门提交论文和电子版本，允许论文被查阅和借阅。本人授权哈 尔滨理工大学可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文，可以公布论文 的全部或部分内容。 本学位论文属于 保密口在年解密后适用授权书。 不保密四 ( 请在以上相应方框内打4 ) 作者签名： 导师签名： z 投翕是 隶智 日期二k 口a 年争月日 i l ：l 期：力舻印月1 日 哈尔滨理t 人学丁学硕士学位论文 1 1 丙烯酰胺概述 第1 章绪论 1 1 1 丙烯酰胺的物化性质 丙烯酰胺的分子式为h 2 c = c h c o n h 2 物理性质：分子量7 1 0 9 ，无色透明片状晶体，无臭，有毒，密度 1 1 2 2 9 m l ，熔点8 4 , - - , 8 5 ，沸点1 2 5 ，溶于水，甲醇，丙酮，乙醇，微溶 于苯，甲苯，其聚合物或共聚物可作为化学灌浆物，土壤改良剂，絮凝剂，纤 维改性剂，增稠剂，涂料等。 化学性质：丙烯酰胺中的两个官能团双键和酰胺基团处于共轭状态， 使得其双键相比于其它烯烃的碳碳双键具有缺电子的特性，易受亲核试剂的攻 击，并可进行1 ，4 加成。但其应用最广的是聚合反应，当丙烯酰胺加热到熔 点以上易发生激烈的聚合反应并放热，因此保存时必须加入少量阻聚剂以防止 丙烯酰胺聚合n 一1 。 毒性：丙烯酰胺是一种累积性的神经毒物，主要损害神经系统。并在一些 试验中己经发现丙烯酰胺有致畸性，国际癌研究组织已将丙烯酰胺列入2 b 组 “可能对人体致癌”，其聚合物为无毒物质阻引。 1 1 2 丙烯酰胺的用途及其市场前景 1 1 2 1 丙烯酰胺的用途丙烯酰胺是一大类单体的母体化合物，它的应用主要 有以下三方面： 1 大量用于制造水溶性聚合物聚丙烯酰胺( p a m ) 类共聚物。我国目前 9 0 丙烯酰胺单体用于生产聚丙烯酰胺类共聚物。 2 少量用于使亲油性聚合物形成透水的亲水中心，以增加粘合力，增加树 脂的软化点和抗溶剂性。 3 少部分用作乙烯基聚合物的交联剂。 1 1 2 2 聚丙烯酰胺的用途由上可知丙烯酰胺主要是用于聚丙烯酰胺及其系列 产品的生产，其下游产品聚丙烯酰胺系列产品是一种用途极广的“百业助 哈尔滨理j t 大学工学硕士学位论文 剂一，主要具有以下用途： 1 在石油工业的应用聚丙烯酰胺的增稠、絮凝和对流体流变性的调节作 用，在钻井、堵水、酸化、压裂、洗井、固井、减阻、防垢及二次采油、三次 采油中都有广泛的应用。特别是随着世界石油资源日益紧张，提高采油率的新 技高分子量聚合物驱油技术得到广泛的应用。按增产一桶原油约需聚合物 0 4 5 - - 1 3 5 k g 计，聚合物驱油每年需丙烯酰胺为5 5 1 0 5 万吨( 增产l 亿吨 年) 。这也是目前国内丙烯酰胺的主要需求。 2 在水处理中的应用聚丙烯酰胺作为水处理剂，主要用作絮凝剂和污泥 脱水剂。许多化工生产都要进行溶液澄清和过滤，加入聚丙烯酰胺能提高澄清 或过滤的速度和效率。 3 在造纸工业中的应用聚丙烯酰胺用作造纸助剂，因它的分子量及所带 电荷不同而用途不同。分子量在1 0 0 0 1 0 0 0 0 的p a m 用作分散剂；分子量在 5 0 万1 0 0 万的用作干增强剂：在1 0 0 万 - - 2 5 0 0 万的用作助留剂、助滤剂、分 散剂、水处理剂等。聚丙烯酰胺与其它造纸化学品相比，其特点是用量少，效 果显著。 除此之外，聚丙烯酰胺还广泛应用于洗煤、冶金、采矿、食品、纺织等领 域哺一1 。由于聚丙烯酰胺在以上各领域的市场潜力日趋凸现，特别是环保产业 的逐步兴起，将会对聚丙烯酰胺有更大的需求，必定会需求更多的丙烯酰胺单 体，故丙烯酰胺行业有着广阔的开拓前景，这个领域的发展也将大有作为。然 而目前我国丙烯酰胺很大程度上有赖于进口，国内产量远不能满足各行业的需 要，特别是不能满足高纯度聚丙烯酰胺的需求，故此产品的进一步开发将显示 出更为广阔的市场前景嵋1 。 1 2 生物法生产丙烯酰胺的历程 世界工业化生产丙烯酰胺都是以丙烯腈为原料，通过催化水合制得，按所 使用的催化剂的不同，可分为硫酸水合法、铜催化水合法和微生物催化水合法 等三种方法旧1 。 1 2 1 硫酸水合法 1 9 世纪末由丙烯酰氯与氨首次合成了丙烯酰胺。1 9 5 4 年美国c y a n a m i d 公 司采用丙烯腈硫酸水合法实现了工业化生产并被各国广泛应用。 该法是将丙烯腈与9 8 硫酸在9 0 - 一1 0 0 。c 下进行水解反应，生成硫酸丙烯 哈尔滨理t 大学工学硕 ：学位论文 酰胺，然后用氨中和反应产物，在4 0 , 、5 0 。c 析出硫酸铵，经过滤分离出副产物 硫酸铵。将反应物冷却形成丙烯酰胺结晶，经分离、干燥得到结晶单体。母液 循环使用，单体用重结晶蒸馏提纯精制。该法易得结晶单体，但工艺复杂，消 耗大量的硫酸和氨，设备腐蚀和环境污染严重，生产成本高，7 0 年代中期，铜 系催化剂问世后，该法被淘汰。 1 2 2 铜催化水合法 7 0 年代中期，发明了铜催化水合法，根据工艺过程不同可分为固定床催化 水合法和悬浮床催化水合法n “3 。 1 2 2 1 固定床催化水合法固定床催化水合法以美国道化学公司为代表，采用 c u - c r 催化剂。该法用n 2 首先吹出7 丙烯腈溶液中的氧气，而后进入三级反 应系统，丙烯腈催化水合成丙烯酰胺，经过滤、真空蒸发、活性炭处理、离子 交换获得成品。该法具有催化剂易活化、易再生的特点，丙烯腈转化率为 9 9 8 9 9 9 ，系统全封闭。 1 2 2 2 悬浮床催化水合法悬浮床催化水合法以日本三井东压公司和三菱化成 公司为代表，采用c u - n i 催化剂，产品为5 0 丙烯酰胺溶液。该法以无离子水 和丙烯腈以2 ：l 的重量比，在悬浮的r a n e y c u 催化剂存在下于1 2 0 、单级 上流反应器中反应，停留时间为2 5 h ，反应产物为含2 2 的丙烯酰胺和1 7 的 丙烯腈水溶液：经真空蒸馏回收丙烯腈，并把丙烯酰胺溶液浓缩到3 0 ，将此 溶液用活性炭处理除去齐聚物和共聚物后，再经离子交换，产品浓缩至5 0 即 得成品。该法催化剂可连续再生、连续补充，反应稳定，但工艺流程长、设备 结构复杂。 1 9 9 5 年我国大庆油田化学助剂厂引进日本三菱化学株式会社的悬浮床连续 催化工业生产技术，建成生产能力为5 万吨年丙烯酰胺装置。该套装置是世 界上最大的丙烯酰胺单体生产装置，产品规模和质量可满足生产较高分子量聚 丙烯酰胺的原料要求。 1 2 3 腈水合酶生物转化法 、1 2 3 1 丙烯酰胺生产菌株及其工业应用进展腈水合酶生物转化法是将微生物 细胞产生的腈水合酶作为催化剂，催化丙烯腈生成丙烯酰胺。1 9 7 3 年，法国研 究者g - a l z y 及其研究组发现了一种能催化丙烯腈水合停留在丙烯酰胺的微生物 b r e v b a c t e r i u mr 3 1 2 ，从而开始了用微生物生产丙烯酰胺的研究。 哈尔滨理工大学工学硕卜学位论文 1 9 8 5 年，日本日东化学公司首先在横滨建立了4 0 0 0 吨年的工业性试验装 置，采用了r h o d e c o c c u ss p 7 7 4 菌种，经过一系列的菌种选育及培养条件的研 究，抑制了酰胺酶的合成，提高了腈水合酶的合成，酶活力达3 6 3 单位。这是 第一代生产菌株。1 9 8 2 年，京都大学山田秀明研究组发现了p s e u d o m o n a s c h l o r o r a p h i sb 2 3 ，经过一系列的研究，1 9 8 8 年替代了s p7 7 4 ，成为第二代工 业性生产菌种，酶活力达到1 2 6 0 单位。1 9 8 8 年，山田秀明等又发现了一种性 能更好的丙烯腈水合酶产生菌r h o d o c o c c u sr h o d o c h p o l l sj 1 ，经过一系列的研 究，酶活力达到1 6 3 0 单位，并于1 9 9 1 年替代了p s e u d o m o n a sc h l o r o r a p h i s b 2 3 ，成了横滨微生物生产丙烯酰胺的第三代生产茵。从1 9 8 5 年日本建设第一 个工业性试验装置起，6 年时间生产实现了三个飞跃，1 9 9 1 年在原来4 0 0 0 吨 年规模的装置上，实现了年产2 0 0 0 0 吨年生产规模。 我国从1 9 8 4 年开始进行微生物法生产丙烯酰胺的研究工作，主要研究单 位有化工部上海生物化学工程研究中心( 即上海农药研究所) 、中国科学院微生 物研究所、上海交通大学、北京石油化工研究院。李文忠等在1 9 9 0 年第l 期 微生物学报上报导了棒状杆菌z b b 2 1 腈水合酶在f e 2 + 及诱导物正丁腈存 在下比活可达2 3 4 m g m l ，总酶活力为1 9 2 单位。1 9 9 1 年在全国生物化工学会 年会上，石油化工研究院曾云峰等报导了r 3 4 和r 3 1 0 菌株的丙烯腈水合酶活 性，经过培养条件的研究，r 3 1 0 的总酶活单位可达3 4 2 7 8 单位。化工部上海 生物化学研究中心1 9 8 6 年在泰山的土壤中找到了n o r c a r d i as p 8 6 1 6 3 菌株。 经多年来的菌种选育和发酵条件的研究，产酶活性可达2 8 5 7 单位，和日本 1 9 9 1 年用于工业生产的r h o d o c o c c u sr h o d o c h r o u sj 1 的产酶水平在同一水平。 我国应用微生物法工业化生产丙烯酰胺最早于1 9 9 4 年实现，1 9 9 4 年江苏 如桌化肥厂利用原化工部生物化学工程研究中心技术成果建立了第l 套1 0 0 0 吨年微生物法生产丙烯酰胺装置。近年胜利油田长安聚合物有限公司、北京 市恒聚油田化学剂有限公司先后建成3 万吨年微生物法丙烯酰胺和超高分子 量聚丙烯酰胺装置，其丙烯腈转化率、丙烯腈单耗、工业发酵产酶能力等均超 过目前国际先进水平。现如今国内一共有十多家丙烯酰胺生产企业，全部采用 微生物法，总产能约3 5 万吨年，2 0 0 4 年实际总产量将近2 0 万吨。主要生产 企业是北京市恒聚油田化学剂有限公司、中国石油大庆炼化分公司、东营胜利 油田聚合物有限公司、爱森( 中国) 絮凝剂有限公司、山东淄博张店东方化学股 份有限公司、安徽天润化学工业股份有限公司、河南焦作多生多化工有限公 司、江西昌九生物化工股份有限公司、盘锦兴建助剂有限公司等n 2 一引。 与国外大规模生产相比，我国的丙烯酰胺生产还比较落后，与我们的需求 哈尔滨理丁大学t 学硕士学位论文 还不相适应，正要建立新的生产装置，因此在这方面有比较大的发展优势。 1 2 3 2 微生物转化法的优点丙烯酰胺的生产经历了三个阶段：硫酸水合法、 铜催化法和腈水合酶生物转化法。 其中硫酸水合法工艺过程复杂，环境污染严重，并且有较多的副产物生 成，早已被淘汰。目前大部分国产聚丙烯酰胺主要是通过铜催化法获得。这一 工艺主要缺点有：( 1 ) 反应温度高；( 2 ) 产物中含有来自催化剂的铜、镍等金 属；( 3 ) 产物中有残留的反应物丙烯腈；( 4 ) 产物中有副产物羟基丙腈。这样导 致产品的分离和精制比较困难，致使生产出来的丙烯酰胺难以合成适用于“三 次采油”的超高分子量的聚丙烯酰胺。很明显，优质丙烯酰胺的国产化成为一 项急待解决的问题。 微生物转化法与上述化学法相比有明显的优势。其优点是：最经济的丙烯 酰胺生产工艺。其特点是：( 1 ) 在常温常压下反应，装置结构设计容易，操作简 单、安全、生产成本低、无污染等；( 2 ) 单程转化率高达9 8 5 以上，无需分离 回收未反应的丙烯腈；( 3 ) 酶性能使选择性极高，无副反应；( 4 ) 产品中不含铜 离子、纯度高，其主要反应物丙烯腈反应完全，无副产物、无机盐及残留等杂 质，适合于生产“三次采油”用的超高分子量聚丙烯酰胺；( 5 ) 失活的酶催化剂 排出系统外的量 产品的0 1 ；( 6 ) 只需离子交换处理，使分离精制操作大为 简化；( 7 ) 产品浓度高，无需提浓操作n 钔。 从以上可以看出微生物法有化学法无可比拟的优势，因此从化学法过渡到 微生物法是丙烯酰胺生产的必然趋势。 1 3 腈水合酶研究简介 1 3 1 腈水合酶的种类和分布 腈化合物一般属于高毒性化合物，然而一些微生物能利用此类化合物作为它 们生长所必需的碳源和氮源，能将腈类化合物水解为酰胺类或羧酸类化合物。 目前已知能产生腈水合酶的微生物有红球菌、诺卡氏菌、假诺卡氏菌、棒状杆 菌、假单胞菌、产碱杆菌、短杆菌等，由此可见产腈水合酶菌的分布是相当广 泛的“瑚1 。 虽然产腈水合酶菌的种类不同，但所有产腈水合酶菌却有一共同点一酶的 活性部位都螯合有金属离子作为辅助因子。按其所含的金属离子的不同，可将 其分为两类：钴型腈水合酶和铁型腈水合酶。如m y r o t h e c i u mv e r r u c a r i a 中的 哈尔滨理工大学t 学硕七学位论文 腈水合酶含有锌，r h o d o c o c c u sr h o d o c h r o u sn 7 71 、p s e u d o m o n a sc h l o r o r a p h i s b 2 3 和r h o d o c o c c u sr 31 2 中的腈水合酶都含有被羟硫基螯合的3 价铁，而 r h o d o c o c c u sr h o d o c h r o u sj 1 和p s e u d o m o n a sp u t i d a18 6 6 8 中的腈水合酶包含有 非类咕啉钴。其中最常见的辅助因子是非血红素铁( n o n - h e m e i r o n ) 和非类咕啉 钴( n o n - c o r r i n i o d c o b a l t ) ，分别称为铁型和钴型腈水合酶幢卜列1 。 1 3 2 腈水合酶的结构特点 产腈水合酶菌的代谢具有多样性，但所有腈水合酶均为胞内酶。腈水合酶 的产生取决于培养基中的碳源、氮源、金属离子及酶表达所需诱导剂等。如需 将腈转化为酰胺时，可在培养基中添加脂肪族腈作为诱导剂以诱导腈水合酶的 表达；当需要羧酸时，可在培养基中添加芳香族腈以诱导水解酶的表达。 依据分子量可将腈水合酶分为高分子量腈水合酶( h n h a s e ) 和低分子量腈 水合酶( l - n h a s e ) 。菌株r h o d o c o c c u sr h o d o c h r o u sj 1 可同时产生h n h a s e ( 5 2 0 k d a ) 幢5 1 和l - n h a s e ( 1 3 0 k d a ) 泌堋。虽然这两种酶都可催化腈水解， 但它们的亚单位、生物合成调节及基因表达差异甚大，因而呈现出不同的物理 化学特性和底物专一性，如h - n h a s e 对脂肪族腈有较好的专一性，而l n h a s e 对芳香族脂有极高的转化性。 钴型腈水合酶与铁型腈水合酶具有相似性，用x 射线衍射分析腈水合酶 亚单位的结构，显示出金属离子为辅助因子，其中金属离子钴与2 个n 原子和 3 个s 原子形成5 价配位键，n 来自主链上的酰胺基团，s 来自酶蛋白中的半 胱氨酸硫醇盐，酶分子中的吡咯喹啉锟为氧化还原反应的辅酶，如图1 1 所 示挣3 。 1 3 3 腈水合酶的反应机理 丙烯腈的水合反应的终产物为丙烯酸，反应机理如图1 2 所示。 目前工业上使用的产腈水合酶菌是一种酰胺酶和腈水解酶突变菌株，这从 根本上解决了酰胺酶和腈水解酶引起的副产物丙烯酸的生成，使产物丙烯酰胺 得到积累，转化液中产物浓度最高可达6 0 0 9 l 恤1 。 下面以一钴型腈水合酶为例描述催化反应历程，如图1 3 所示。 腈水合酶中的钴离子起到l e w i s 酸的作用潞矧。首先，钴离子与腈及周围 的水分子结合，激活腈基中的三键，并在辅酶p q q 的共同作用下发生水合反 哈尔滨理工大学t 学硕 ：学位论文 雩撬玉 0 图1 - 1 腈水合酶亚单位的结构图 f i g 1 - 1t h es t r u c t u r eo fn i t r i l eh y d r a t a s es u b u n i t to +n h ， h 图l - 2 腈水合酶的反应机理 f i g 1 - 2t h er e a c t i o nm e c h a n i s mo fn i t r i l eh y d r a t a s e 应。一腈基靠近o h ( 或者一个与金属离子形成共价键的水分子) ，然后，o h 或 者水分子( 象广义上的碱一样被活化) 攻击腈基中的碳负离子，形成一个亚酰胺 ( r - c ( o h ) = n h ) ，最后，亚酰胺异构化生成酰胺，正是由于这种独特的催化机 理，使腈水合酶能有效地催化腈类化合物的水解。 宁- h缈 缈 ，抽一嚣) 一o h o h h b 一- o 。6 h h b 掣一瑕夕一i h b 一f 1r c 墨nr c = n h r 一芒一n h 2 哈尔滨理工大学1 二学硕士学位论文 h f 鼍舳 -删h o ；h 弋b - h f n 舳一r 一塞n h 、一r c 邕 k c 4 2 n i t 图i - 3 腈水合酶的反应历程 f i g 1 3t h er e a c t i o nc d u r s eo fn i t r i l eh y d r a t a s e 1 4 传统微生物法工艺过程 1 4 1 细胞的固定化 目前，应用的传统微生物工艺过程大都采用细胞固定化技术。用于固定化 细胞的材料可以分为醋酸纤维酯，海藻酸钡，海藻酸钙，聚丙烯酰胺凝胶，卡 拉胶等。细胞固定化的形式主要有液滴造粒和凝胶切块两种。在日本主要应用 聚丙烯酰胺凝胶包埋切块的方式，在我国一般应用海藻酸钡液滴造粒的方法。 1 4 2 固定化细胞批式反应工艺流程 国内生产主要采用上海农药研究所的工艺汹1 ，利用细胞固定化技术，采用 批式反应进行丙烯酰胺生产： 1 发酵 菌种经种子罐培养后进入发酵罐，在2 8 下通气并搅拌培养4 5 小时。发 酵液打入储罐，在4 8 下冷藏。 2 造粒 按发酵液量加入2 一2 2 ( 训：) 的海藻酸钠，并调p h 6 5 7 5 ，以齿轮 泵循环打浆3 4 小时后，进入造粒机。成型后进入固化、清洗罐，完成固化和 固定化粒子清洗的工作( 温度4 8 ) ，最后控制固定化细胞悬浮液的电导率在 3 0i ls c m 以下，之后放料到固定化粒子贮罐。 3 水合 在水合釜中加入适量固定化粒子和水，并流加丙烯腈。丙烯腈事先经蒸馏 精制，除去其中的挥发性杂质。通过控制流加速率来控制丙烯腈在反应体系中 的浓度低于2 5 ，并用夹套的冷盐水控制水合温度在2 0 一2 2 ；水合时p h 哈尔滨理t 大学工学硕七学位论文 为6 5 7 5 。出料控制丙烯腈残留小于0 1 ，产品中丙烯酰胺含量平均为2 5 ( 硼：) 。粒子的一次水合反应通常在7 - 9 小时结束。 4 精制 水合得到的丙烯酰胺溶液中包含有固定化粒子中溶解或渗漏出的各种杂 质。溶液首先经过活性炭过滤，再经阴、阳离子交换后进入精丙烯酰胺储罐。 要求精制后溶液的电导低于3 0 0us c m 。另外，来自结晶工段的结晶母液也经 活性炭过滤后，与上述水合液一起通过离子交换精制。 5 浓缩 精制后的丙烯酰胺浓度约2 8 一3 0 ，加入微量阻聚剂后，经套管换热器 加热，在9 0 1 2 下进入筛板塔，在塔内与经塔底鼓入的空气接触、蒸发水分，最 终浓缩至6 1 。其中，空气一方面带走水蒸汽，另一方面可起到阻聚作用。 自塔里出来的空气经旋风分离、换热器换热后排空。蒸汽冷凝水回锅炉回收利 用。 6 结晶离心 浓缩液经滤布过滤器进入结晶釜，经一次水、9 水和一9 水逐级冷却结 晶。经3 _ 4 小时，釜内物料温度降到2 4 ，即可放料进行离心。离心母液循 环至精制工段，晶体进入干燥工段。离心干燥采用密闭流程。 7 干燥 晶体经传送带和螺旋加料机送入气流干燥管，经热空气干燥、旋风分离后 包装。 1 4 3 传统微生物法中需要解决的问题 1 在反应过程中，酶的稳定性较差。酶活在常温下下降得很快，一批固定 化的细胞通常只能用- n 两批水合反应。如果这一问题能得到较好的解决，将 为丙烯酰胺的生产带来巨大的经济效益。现有的生产菌株对底物的耐受性比较 差，底物抑制在较低浓度( o 4 m o v l ) 时就开始出现m 1 ，丙烯腈的浓度只能控制 在2 - 5 以下。另外产物抑制也是酶反应稳定性差的一个重要原因。 2 腈水合酶，属于胞内酶陋4 1 1 ，采用固定化细胞的方式延长了底物和产物 扩散路程和阻力，同时细胞固定化以后酶的活性损失较大。细胞固定化的目的 主要是提高细胞中酶的反应稳定性，同时也易于将生物催化剂和反应体系分 离。而对丙烯酰胺的微生物转化来说，细胞固定化对于酶细胞的稳定性并没有 明显的提高。另外，在固定化阶段加入固化剂，会给产物中带来一些金属离 哈尔滨理t 犬学t 学硕1 j 学位论文 子。而丙烯酰胺的超高分子量聚合需要很纯的丙烯酰胺，所以在工艺中还有用 离子交换以去除部分杂质的步骤。由于离子交换的处理能力比较小，使这一步 成为生产中的瓶颈。 3 现有的工艺过程是采用固定化细胞批式操作的反应方式，存在生产效率 不高、反应过程和产品质量不稳定、产物的浓度不高等不足。如果能够应用全 新的生产工艺，实现连续化反应，提高产物的浓度，提高生产能力，则可以进 一步推动微生物法工业的发展。 1 5 膜生物反应器技术的研究进展 1 5 1 生物反应分离耦合技术 生物反应分离耦合过程，即在生物反应发生的同时，选择一种合适的分离 方法及时地将对生物反应有抑制或毒害作用的产物或副产物选择性地从生产性 细胞或生物催化剂周围原位移走。 生物反应与分离耦合的关键是选择一种合适的分离技术来实现产物或副产 物的原位移走。分离技术的选择应综合考虑以下4 方面： 1 分离技术应具备生物相容性。即合适的分离技术应对生物催化剂不造成 负面影响，不会造成生物催化剂或细胞的失活、变性和死亡，也不会改变生物 反应的代谢和调节机制。 2 充分考虑产物或副产物的理化特性和生物学特性，选择最佳的分离技 术。 3 耦合过程环境的流体特性必需关注，因为流体力学性质决定并影响了分 离过程的传质，从而分离的容量和速度会受到极大的影响，如高粘度的非牛顿 型流体就不适合用膜分离技术。 4 工程及经济因素。理想的分离技术应是操作费用低、性能稳定、工程上 易实现、寿命长的技术。 1 5 2 膜生物反应器 膜生物反应器是反应与分离耦合的装置，集产品分离、纯化和酶( 或细胞) 的回收利用于一体。膜反应器最早应用于微生物培养方面，1 9 5 8 年s t e r n 用透 析培养装置培养出了牛痘苗细胞，1 9 6 8 年b l a t t 首次提出膜反应器的概念。 哈尔滨理工大学下学硕士学位论文 1 9 9 8 年m c a n t a r e l l a 等人报道了采用超滤膜生物反应器进行丙烯酰胺微生 物转化过程的研究m 棚1 。m c a n t a r e l l a 等人的研究也仅仅局限于将膜生物反应 器作为研究腈水合酶活力和活力稳定性的一种实验方法，同时对于膜生物反应 器在丙烯酰胺微生物转化生产过程中应用的可能性进行了一定的探索。清华大 学孙旭东等人对多级连续化中空纤维膜生物反应工艺在丙烯酰胺微生物转化中 的应用也有相当详细的报道和开创性的研究5 。并将游离细胞膜生物催化反 应工艺进行了工业化实际应用，反应器规模达到6 0 0 0 l ，膜面积达到1 6 0 m 2 ， 生产规模为6 0 0 0 吨年。 1 5 3 游离细胞膜生物器工艺的优点 对比传统的细胞固定化生产丙烯酰胺的工艺，可以总结游离细胞膜生物反 应器工艺的一些优点： 1 游离细胞酶活利用率提高。由于在反应过程中初始酶活较高，反应时间