（环境科学专业论文）高温菌株生理生化及有机物降解性质研究.pdf

m a y , 2 0 1 0 华东师范大学学位论文原创性声明 郑重声明：本人呈交的学位论文高岫梢0 谒蜥物群简懈氏窥易，是在华 东师范大学攻读碜生博士( 请勾选) 学位期间，在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名：盈建日期：o 年6 月2 日 华东师范大学学位论文著作权使用声明 高语龋糨星勿啪切髀解情压乡防系本人在华东师范大学攻读学位期 间在导师指导下完成的 驻博士( 请勾选) 学位论文，本论文的研究成果归华东师范大学所 有。本人同意华东师范大学根据相关规定保留和使用此学位论文，并向主管部门和相关机构如 国家图书馆、中信所和“知网”送交学位论文的印刷版和电子版；允许学位论文进入华东师范 大学图书馆及数据库被查阅、借阅；同意学校将学位论文加入全国博士、硕士学位论文共建单 位数据库进行检索，将学位论文的标题和摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复 制学位论文。 本学位论文属于( 请勾选) () 1 经华东师范大学相关部门审查核定的“内部或“涉密”学位论文木， 于年月 日解密，解密后适用上述授权。 ( y2 不保密，适用上述授权。 导师签名移矽 了 触 黼 粥 张慧硕士学位论文答辩委员会成员、评阅人名单 姓名职称单位备注 华东师范大学环境 史家棵教授主席 科学系 中国科学院上海生 周志华教授命科学院植物生理 生态研究所 华东师范大学河口 陆健健教授 海岸所 华东师范大学环境 黄民生 教授 科学系 复旦大学环境科学 张士成副教授 系 华东师范大学生命 朱文杰教授 评阅人 科学学院 华东师范大学环境 谢冰副教授 评阅人 科学系 华东师范大学2 0 1 0 届硕士学位论文高温菌株生理生化及有机物降解性质研究 摘要 高温菌具有独特的基因类型和生理机制，高温菌降解酶具有代谢效率高，耐 高温、酸、碱、有毒有害物质等性质，受到广泛关注。但由于对高温菌生物转化 及代谢调控理论研究的不足，限制了高温菌对餐厨垃圾降解转化效率的提高和技 术的完善。本文以课题组自行分离的高温菌株为研究对象，主要研究4 株具有广 谱性降解功能的高温菌株及4 株高温纤维素降解菌株的生理生化性质及有机物 降解性能，初步构建了具有广谱性降解功能的高温菌复合系，以期进一步研究复 合菌株间协同产酶机制及代谢调控。结论如下： ( 1 ) 对分离自6 5 具有广谱降解性能的4 株菌株y 5 、y 6 、l 3 和l 5 进行 生理生化性质研究。结果表明，y 5 、l 3 株菌为杆菌，无运动性，兼性厌氧，有 荚膜，革兰氏阴性，有芽孢；y 6 、l 5 株菌为杆菌，无运动性，兼性厌氧，有荚 膜，革兰氏阳性，有芽孢；y 5 、y 6 、l 3 能产生接触酶，不能产生氧化酶，l 5 能产生接触酶和氧化酶，适温度范围6 0 一6 5 ，最适p h 范围为6 0 9 0 ，均可 利用葡萄糖、果糖、海藻糖以及可溶性淀粉，不可利用c m c n a 、乳糖、甘露醇。 其中y 5 、l 3 、l 5 能利用蔗糖而y 6 不能利用蔗糖。经1 6 s r d n a 序列分析，将 这4 株菌株初步鉴定为地芽孢杆菌属( g e o b a c i l l u ss p 1 。 ( 2 ) 研究从7 0 下分离得到的4 株纤维素降解菌株c 1 、c 2 、c 3 和c 4 的 生理生化性质。菌株c 1 、c 2 、c 3 和c a 分别为g 一杆菌( 有芽孢) 、g + 杆菌( 有 芽孢) 、g + 杆菌( 有芽孢) 、g + 无芽孢杆菌。四株菌均为不运动、好氧、能产生 接触酶、能产生氧化酶。其中，c 1 和c 2 的接触酶活性大于c 3 和c 4 。四株菌 都能产生纤维素酶，c 3 和c a 分解纤维的能力相对c 1 和c 2 较强。c 1 与c 2 之 间，c 1 与c 3 之间，c 1 、c 2 和c 3 之间以及4 菌株之间都具有协同作用。c 3 分 解纤维素的延时期相对其他三株菌长，但其在以纤维素为唯一碳源的液体培养基 中生存能力最强。 ( 3 ) 初步进行了广谱性嗜热菌复合系的构建，主要设置a 、b 、c 、d 、e 、 f 、g 及a - 1 共8 组。通过前期驯化，各组的淀粉降解效果：f 组 e 组 a 组 a - 1 组；滤纸降解效果：f 组 e 组 a 1 组 a 组；蛋白质降解效果：e 组 f 组 a 组 a 1 组，其中e 组蛋白质降解效率最高。而油脂在高温条件下乳化使得 测定的吸光度值不减反而增加，对复合系油脂降解能力的评价造成很大影响。关 h 华东师范人学2 0 1 0 届硕1 ：学位论文 高温菌株生理生化及有机物降解性质研究 a b s t r a c t t h e r m o p h i l i cb a c t e r i ah a v eg a i n e dm u c ha t t e n t i o nf o ri t su n i q u eg e n e t i ct y p e s a n dp h y s i o l o g i c a lm e c h a n i s ma n di t sm e t a b o l i ce n z y m e sh a v eg o o da c i da n d a l k a l i - r e s i s t a n t ，h e a tr e s i s t a n ta n dh a r m f u ls u b s t a n c er e s i s t a n tp r o p e r t i e s h o w e v e r , s t u d i e so nb i o t r a n s f o r m a t i o na n dm e t a b o l i s mc o n t r o lo ft h e r m o p h i l e sa r ed e f i c i e n t ， w h i c hh i n d e rp r o m o t i o no fb i o d e g r a d a t i o na n dt e c h n o l o g i c a la d v a n c e m e n to ff o o d w a s t e i nt h i ss t u d y , f o u rt h e r m o p h i l i cb a c t e r i ad e g r a d i n gw i d er a n g eo fo r g a n i c s u b s t r a t e sa n df o u r c e l l u l o s e d e c o m p o s i n gt h e r m o p h i l e s w e r ei n v e s t i g a t e df o r p h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n dt h e i rc a p a b i l i t yo fo r g a n i cd e g r a d a t i o n c o m p o s i t e m i c r o b i a ls y s t e md e c o m p o s i n gw i d er a n g eo fo r g a n i cs u b s t r a t e sw a sa l s oe s t a b l i s h e d i n i t i a l l yi no r d e rt op a v et h ew a y o fr e s e a r c ho nc o l l a b o r a t i v ee n z y m ep r o d u c t i o n m e c h a n i s ma n dm e t a b o l i s mc o n t r o lo fm i c r o b i a ls y s t e mt o p r o m o t em i c r o b i a l d e g r a d a t i o no ff o o dw a s t e s r e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) f o u rt h e r m o p h i l i cb a c t e r i ay 5 ，y 6 ，l 3a n dl 5i s o l a t e da t6 5 cw i t hw i d e d e g r a d i n gr a n g eo fo r g a n i c s u b s t r a t e sw e r es t u d i e df o rt h e i r p h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s r e s u l t ss h o w e dt h a ty 5a n dl 3w i t hc a p s u l eb u tn om o t i l i t yw e r e g r a m - n e g a t i v ef a c u l t a t i v ea n a e r o b e s ，a n dy 6a n dl 5w i t hc a p s u l eb u tn om o t i l i t yw e r e g r a m - p o s i t i v ef a c u l t a t i v ea n a e r o b e s t h e s es t r a i n sy 5 ，y 6 ，l 3c a n n o tg e n e r a t eo x i d a s e b u tc a t a l a s e o n l yl 5c a ng e n e r a t eo x i d a s ea n dc a t a l a s e f o rg r o w t ho ft h ef o u rs t r a i n s ， o p t i m u mt e m p e r a t u r er a n g ew a s6 0 0 c 一6 5 ca n do p t i m u mr a n g eo fp hv a l u ew a s 6 0 - 9 0 t h e ya l l c a l lu t i l i z eaw i d er a n g eo fc a r b o h y d r a t e sa sc a r b o ns o u r c e ， i n c l u d i n gg l u c o s e ，f r u c t o s e ，t r e h a l o s ea n ds o l u b l es t a r c h ，b u tc a n n o tu s ec m c - n a ， l a c t o s ea n dm a n n i t 0 1 a n ds u c r o s ec a nb eu t i l i z e db yy 5 ，l 3a n dl 5 a c c o r d i n gt o 1 6 sr d n a s e q u e n c ea n a l y s i s ，t h e yb e l o n g e dt og e o b a c i l l u ss p ( 2 ) p h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so ff o u rc e l l u l o s e d e c o m p o s i n gt h e r m o p h i l e s ( c 1 、c 2 、c 3a n dc 4 ) i s o l a t e da t7 0 cw e r ei n v e s t i g a t e d r e s u l t ss h o w e dt h a tc 1 、 c 2a n dc 3h a dc a p s u l ew h i l ec 4h a dn oc a p s u l e t h ef o u rs t r a i n sw e r ea l la e r o b i c r o d s h a p e db a c t e r i a ，a n dc a np r o d u c eo x i d a s ea n dc a t a l a s e c a t a l a s ea c t i v i t yo fc 1 a n dc 2w e r eh i g h e rt h a nt h a to ft h eo t h e rt w os t r a i n s t h ef o u rs t r a i n sc a ng e n e r a t e i i i 华东师范大学2 0 1 0 届硕上学位论文高温菌株生理生化及有机物降解性质研究 c e l l u l a s e c 3a n dc 4h a db e t t e rc a p a b i l i t yo fc e l l u l o s ed e g r a d a t i o nt h a nc 1a n dc 2 s y n e r g yh a db e e nf o u n db e t w e e nc 1a n dc 2 ，c 1a n dc 3 ，a n dc 1 、c 2a n dc 3 c e l l u l o s ed e g r a d a t i o nb yc 3s t a r t e dm o r es l o w l yt h a nt h a tb yt h eo t h e rt h r e es t a i n s h o w e v e r , c 3g r e wb e t t e rt h a nt h eo t h e r si nt h el i q u i dm e d i u m w i t hc e l l u l o s ea sas o l e c a r b o ns o u r c e ( 3 ) c o m p o s i t em i c r o b i a ls y s t e md e c o m p o s i n gw i d er a n g eo fo r g a n i cs u b s t r a t e s w a sa l s oc o n d u c t e di n i t i a l l yb ye i g h tg r o u p sf r o m 舡ga n da 1 a f t e rd o m e s t i c a t i o n ， t h ed e g r a d a t i o ne f f i c i e n c yo r d e ro fs o l u b l es t a r c hw a sf e a a - 1 ，t h ed e g r a d a t i o n e f f i c i e n c yo r d e ro ff i l t e rp a p e rw a sf e a - 1 八a n d t h ed e g r a d a t i o ne f f i c i e n c y o r d e ro fp r o t e i nw a se f a a 一1 g r o u peh a db e s td e g r a d a t i o no fp r o t e i n t h eo d o ff a ti n c r e a s e di n s t e a do fd e c r e a s es i n c ef a te m u l s i f i e da th i g ht e m p e r a t u r e t h i s o b s t r u c t e dt h ee v a l u a t i o no fa b i l i t yo ff a td e g r a d a t i o nb yc o m p o s i t em i c r o b i a ls y s t e m a n dm u c hr e s e a r c hw a sn e e d e do nt h ee f f e c to fh i g l lt e m p e r a t u r eo nf a td e g r a d a t i o n k e y w o r d s ：t h e r m o p h i l i cb a c t e r i a ；p h y s i o l o g i c a l a n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ； t h e r m o p h i l i ce n z y m e ；d e g r a t i o np r o p e r t i e s 2 2 高温菌的耐热机制6 2 3 高温i 笥嗜热酶8 2 3 1 嗜热淀粉水解酶一9 2 3 2 嗜热蛋白酶。1 1 2 3 3 嗜热脂肪酶1 2 2 3 4 嗜热纤维素酶1 4 2 3 5 嗜热木聚糖酶。1 5 2 3 6 嗜热几丁质酶1 8 2 3 7 嗜热d n a 聚合酶1 9 2 4 高温菌的应用2 0 2 5 利用高温菌降解有机污染物2 1 2 5 1 高温菌在有机污染物降解中的应用2 1 2 5 2 嗜热纤维素分解i 巍及其应用。2 1 2 5 3 高温菌复合系2 4 第三章四株广谱性高温菌株生物学性质研究 3 1 材料与方法。2 6 3 1 1 菌株的分离纯化2 6 3 1 2 细菌形态观察2 6 3 1 3 运动性及需氧性测定2 7 3 1 4 生长曲线的测定2 8 3 1 5 适宜生长条件分析2 8 3 1 6 降解酶活性测定2 9 3 1 7 碳源利用情况测定2 9 3 1 8 菌株降解性质测定2 9 v 华东师范 3 2 3 3 小结4 3 第四章四株嗜热纤维素降解菌及其性质研究 4 1 材料与方法4 5 4 1 1 菌株的分离纯化。4 5 4 1 2 菌株形态观察。4 5 4 1 3 运动性及需氧性测定。4 6 4 1 4 降解酶活性测定。4 6 4 1 5 纤维素降解能力研究。4 6 4 2 结果与讨论4 7 4 2 1 菌株形态特征4 7 4 2 2 运动性及需氧性。4 8 4 2 3 降解酶活性。4 9 4 2 4 纤维素降解能力。5 1 4 3 ，j 、结! ；2 第五章广谱降解性高温菌复合系的初步构建 5 1 材料与方法。5 4 5 1 1 培养基5 4 5 1 2 大分子物质降解测定方法5 5 5 1 2 1 蛋白质浓度测定5 5 5 1 2 2 淀粉浓度测定5 6 5 1 2 3 油脂浓度测定5 7 5 1 2 4 滤纸重量法5 8 5 1 3 复合系的初步建立5 8 5 1 3 1 复合系菌株初筛5 8 5 1 3 2 复合系初步构建5 9 5 2 结果与讨论5 9 5 2 1 菌种初筛。5 9 5 2 2 复合系驯化。6 1 5 2 3 复合系的降解效率。6 4 5 3 爿、结。6 6 第六章结论与展望 6 7 6 1 结论6 7 6 2 论文创新点6 8 v i v n 华东师范人学2 0 1 0 届硕1 ：学位论文 高温菌株生理生化及有机物降解性质研究 1 1 课题来源 第一章绪论 本课题在上海市自然科学基金( n o 1 0 z r l 4 0 9 9 0 0 ) ，上海市2 0 0 6 年红双喜联 盟计划( n o 3 1 ) 1 撇助下，开展高温菌生物学及其应用研究。 1 2 研究背景 随着城市化进程加剧和人口增加，餐厨垃圾的产生数量也在突飞猛进。餐厨 垃圾主要成分有蛋白质、淀粉和脂肪等易腐性物质及纤维素、半纤维素、木质素 等难降解有机物。虽然餐厨垃圾对环境的危害不如工业污染物严重，但由于它含 水率高、油分高、容易腐败等特点，如收集、处理处置不当也会对环境造成很大 危害。目前，餐厨垃圾的处理处置方法包括物理处理法和生物处理法等。其中， 生物法更有利于实现餐厨垃圾的资源化、无害化和稳定化。 餐厨垃圾的处理较为常见的方法是堆肥处理，它具有操作简便、经济实用等 优点，且经堆肥处置后的物料可以循环利用而不会污染环境。但如果进行直接堆 肥处理也会给环境带来极大的危害，如腐臭的气味，污染物浸出液对地表造成污 染等。高效菌剂的应用能加速堆肥升温，促进发酵腐熟过型，对于加速堆肥进 程有很大意义。 高温堆肥能利用大量微生物的作用，释放出能量，形成高温环境，从 而达到分解有机污染物，杀死致病微生物的目的。高温堆肥对于促进农作 物茎秆、人畜粪尿、杂草、垃圾污泥等堆积物的腐熟，以及杀灭其中的病 菌、虫卵和杂草种子等，具有一定的作用。 在餐厨垃圾好氧发酵过程中，接种高温菌较接种常温菌相比有着许多的优 势。高温菌较常温菌具有更高的活性和更快的代谢速率，可以加快有机物质的降 解速率，缩短发酵时间。能更有效地杀灭病原微生物。高温菌在高温条件下能产 生具有热稳定性的降解酶，可以降解有机污染物。高温菌降解污染物的过程中， 能产生热量，将发酵温度维持在比较高的状态，更加有效地杀死病原微生物，达 华东师范大学2 0 1 0 届硕十学位论文高温菌株生理生化及有机物降解性质研究 到卫生化的要求，且反应效率高，污染少。同时，高温菌酶还能极大程度地耐受 不良化学环境，抵抗有毒害作用的污染物或代谢产物的抑制作用。高温微生物的 应用可为有机垃圾的处理更好地实现卫生化、无害化、稳定化，并为有机垃圾资 源化利用的工业化生产创造有利条件。鉴于高温菌这些特性，研究和利用高温菌 降解有机污染物的性质调控机制具有一定的意义。 1 3 研究内容和研究意义 1 3 1 研究内容 论文在课题组前期所分离的大量高温菌株的基础上开展以下研究： ( 1 ) 广谱性高温菌生物学性质研究 选取实验室已获得的广谱性高温菌作为研究对象，进行生理生化性质和降解 性质研究。生理生化性质包括表型特征、适宜生长条件、菌的酶活性、运动性及 需氧性，碳源利用情况和有机物降解性质等。 ( 2 ) 高温纤维素分解菌降解性质研究 研究筛选出的高温纤维素菌株的生理生化性质和纤维降解性质。 ( 3 ) 广谱性高温菌复合系的初步构建 采用限定式微生物联合培养路线，利用广谱性高温菌在混合培养条件下所具 有的独特的有机物降解特性，初步构建降解能力高，菌种稳定的复合系。 1 3 2 研究意义 高温菌能够代谢的有机物的范围广，可以将多种形式氮素高效转化为微生物 蛋白，从而将低品质的废弃生物物质( 如餐厨垃圾) 高效转化为高品质的微生物 蛋白，同时过程的高温可以有效杀灭病原微生物，其生产过程中不易出现染菌现 象。而且高温过程使得各种有毒的化合物得到快速降解，对食品安全具有重要意 义。因此高温菌在废弃生物物质微生物转化领域具有巨大的经济效益和潜能。 国内外关于高温菌降解有机污染物的研究开展得相对较少，本文从高温堆肥 中分离筛选具有广谱降解性能的高温菌株，这些菌株同时具有降解二种以上大分 子有机物的能力( 淀粉，纤维素，油脂和蛋白质等) ，在对其生理生化性质研究 2 图1 - 1 技术路线 f i g 1 1t e c h n i c a lr o u t e 3 华东师范人学2 0 1 0 届硕士学位论文 高温菌株生理生化及有机物降解性质研究 第二章高温菌生物学及其应用研究进展 2 1 高温菌概述 高温菌( t h e r m o p h i l e ) 也称嗜热菌，广泛存在于自然界之中，具有耐热、嗜热 的特性。其在高温下能发酵糖类、分解纤维素、耐受原油等有毒有机化合物，并 能高效降解多环芳烃有机物，日益受到关注。 1 8 7 9 年米奎尔( p m i q u e l ) 从法国塞纳河中分离到能在7 0 环境中生长的杆 菌。这可能是有关高温菌的最早报道。美国人t h o m a sb r o c k 于1 9 6 9 年从美国黄 石国家公园分离出第一个严格意义的水生栖热菌( t h e r m u sa q u a t i c u s ) ，真正揭开 了高温生境中生命研究的高潮。 2 1 1 高温菌的界定 普遍认为高温菌是一类能在4 5 c 以上极端环境生长和繁殖的微生物【2 卅。从 微生物进化角度，高温菌可分为古菌、细菌和真菌三类。系统进化地位越低级可 耐受温度越蒯引，如古菌可耐受的上限温度为1 1 3 。c ，细菌为9 0 c ，真菌为6 0 c 6 2 c 。根据生长温度来界定高温菌，有两类观点 2 1 ：一类是根据菌株的耐受温度； 另一类是根据其生活的最适温度或培养温度。高温菌的生长温度跨度一般为 4 0 1 0 0 ，由于跨度较大，且培养条件不同而会导致同一菌株的适宜生长温 度发生变化。k a r lo s t e t t e r 在1 9 8 2 年发现嗜热微生物最高最适生长温度为1 0 5 c 5 l 后，又于1 9 9 7 年将此温度上限提高至u 1 0 6 c 。烟栖火叶( p r o l o b u s 肛m 口州) 可在1 1 3 。c 下生长，但该菌在1 2 1 的高温高压条件下，l d , 时内仍可以存活。因此高温菌界 定分类方法尚无统一标准。 一般将能在5 5 v 以上环境中生长的菌叫高温菌；在3 7 环境以及3 7 ( 2 环境 以下也能生长的高温菌称为兼性高温菌，而在这一温度范围内不能生长的高温菌 称专性高温菌【酬。 而另外一种是将其划分为3 类 7 1 ：( 1 ) 兼性高温菌，最高生长温度在4 0 c - - - 5 0 c 之间，但最适生长温度仍在中温范围内；( 2 ) 专性高温菌，最适生长温度在4 0 c 以上，4 0 c 以下则生长很差，甚至不能生长；( 3 ) 极端高温菌，最适生长温度在 6 5 以上，最低生长温度在4 0 以上。 4 华东师范大学2 0 1 0 届硕士学位论文 高温菌株生理生化及有机物降解性质研究 也有资料【2 】认为最适生长温度在4 5 。c 8 0 c 之间的高温菌为中度高温菌，最 适生长温度大于8 0 的微生物为超温菌( h y p e r t h e r m o p h i l e s ) ，包括处于系统进化 树底部的部分细菌和古菌。 2 1 2 高温菌的生境多样性 高温菌在地球上是广泛分布的，不仅存在于地热环境中，在人工高温环境、 地下油层甚至空气中都曾发现有高温菌的存在。但通常分布在陆地温泉、海底热 泉、地壳内部、酸性硫磺区等自然高温环境中及高温堆肥、烟囱、热水器、热污 染河流等人工高温环境中。也有学者在常温环境中分离到具有应用前景的高温菌 株。 随着分子生态学技术的不断发展，研究高温菌生物生境多样性的途径更加广 泛。针对不同环境样品，提取d n a 进行1 6 sr d n a 扩增。通过扩增结果构建系 统进化树( 图2 1 ) ，发现纯培养技术获得的高温菌很少，还存在大量已知但不可 培养的高温菌。事实上，目前已知的高温菌仅占了高温生境中高温菌的极小一部 分。因此，研究高温菌的一个重要难点就是不断探索新的分离方法【剐。1 9 9 5 年 h u b e r 等采用光钳技术与r n a 原位杂交成功分离到一株新的超高温斟9 1 。 图2 - 1 生命三域1 6 sr d n a 系统进化树。高温菌与超高温菌用粗体表示【3 】 f i g 2 - 1p h y l o g e n e t i ct r e eo ft h r e el i f ek i n d o m sb a s e do n l 6 sr d n as e q u e n c e s 1 t h e r m o a n a e r o b a c t e rs p p 2 t h e r m o t o g as p p 3 d e s u l f u r o c o c c u s 4 s u l f o l o b u s , s p e5 t h e r m o p h i l u ms p p 6 t h e r m o p r o t e u ss p p 7 a q u i f e xs p p 8 m e t h a n o p y r u ss p p 9 m e t h a n o c o c c u s j a n n a s c h i i 1 0 t h e r m o c o c c u ss p p 5 华东师范大学2 0 1 0 届硕上学位论文高温菌株生理生化及有机物降解性质研究 2 2 高温菌的耐热机制 高温菌耐热性现在普遍认为与组成生命体生物分子的热稳定性有关【2 | 。热稳 定性是指物质在不同温度下，保持其自身既定结构的稳定和功能正常运行的一种 能力。目前，认为有以下几方面原因： ( 1 ) 高温菌膜脂的作用 膜脂是高温菌细胞的基本组成成分，在维持膜的流动性，跨膜运输，维持跨 膜化学渗透势和膜蛋白的稳定性等方面起重要作用。膜必须具有耐受环境温度变 化的能力，同时也必须能够耐受其它极端环境因素，如高温条件等。 随着环境温度升高，高温菌的细胞膜通过改变膜脂脂肪酸的组成、增加磷脂 酰烷基链的长度、增加异构化支链的比率、或增加脂肪酸饱和度等方式使高温菌 的细胞耐受高温，从而增加膜的热稳定性。对于嗜热古菌来说，细胞膜上的双层 类脂进行了共价交联，成为两面都是亲水基的单层脂，并且保持了完整的疏水内 层，这种结构极大地增强了耐热性。嗜热栖热菌h b 8 的球状体在用蒸馏水洗涤 后，仍然没有破裂的球状体出现。这可能与细胞膜的物理稳定性相判。 ( 2 ) d n a 分子的热稳定性 d n a 分子的热稳定性的影响因素有胞内k + 浓度、d n a 反向螺旋酶、组蛋白 及其它d n a 结合蛋白等。在某些超高温菌细胞内k + 浓度可高达1 m ，能够阻止 d n a 分子在高温条件下脱膘呤。在大多数的超高温菌细胞内有反向d n a 螺旋 酶，它能够向超高温菌的d n a 分子中引入正超螺旋，形成闭合环状的d n a 超 螺旋分子。而常温菌中的d n a 螺旋酶向d n a 分子中引入负超螺旋。由于不同 的原因，正超螺旋比负超螺旋更能抵抗热变性作用。 ( 3 ) g + c 含量 在w a s t o n c r i c k 碱基配对中，g c 碱基对之间具有3 个氢键，a - t 碱基对之 间有两个氢键，因此g c 碱基对比a t 碱基对在能量上更稳定。1 9 6 9 年b r o c k 在美国黄石国家公园发现能在7 0 c 以上生长的高温菌( t h e r m u s ) ，其基因组g + c 含量高达6 7 。人们设想高温菌基因组g + c 含量可能与高温菌耐热性有判4 1 。 但随着高温菌研究的不断深入，特别是超高温菌的不断发现，人们相继提出 不同的观点。一些超高温菌最适生长温度可达1 0 0 c 以上，但其基因组g + c 含 量却相对较低，如e y r o b a c u l u mo r g a n o t r 的最适生长温度为1 0 2 ，基因组g + c 含量为4 6 ；e r o c o c c u sf u r i o s u s 的最适生长温度为1 0 0 ，基因组g + c 含量仅 6 华东师范大学2 0 1 0 届硕十学位论文高温菌株生理生化及有机物降解性质研究 有3 8 3 ；而迄今为止耐受温度最高的菌株p y r o l o b u sf u m a r i i 的最高生长温度可 达1 1 3 ，其基因组g + c 含量只有5 3 1 1 1 j 。 通过比较芽孢杆菌属好热菌和好温菌的d n a 的热稳定性，发现好热菌的 d n a 熔点( ) 比较高【6 l 。如好温芽孢杆菌的d n a 熔点为8 7 80 c - 8 8 6 0 c ，而好热 芽孢杆菌嗜热脂肪芽孢杆菌的d n a 熔点为9 0 7 。 酸水解d n a 产物的碱基和d n a 溴化等化学分析表明，d n a 熔点的差异取 决于g + c 的含量差异。芽孢杆菌属的好温菌和高温菌的d n a 的g + c 的含量分 别是为4 5 和5 3 。在芽孢杆菌属中生长温度较低的菌种，如蜡状芽孢杆菌 ( b a c i l l u sc e r e u s 踮) 、蜂房芽孢杆菌( b a c i l l u s a l v e i 跚) 、巨大芽孢杆菌等细菌的 d n a 中g + c 含量较低，只有3 3 - 3 8 。在极度高温菌的d n a 中，g + c 含量 为6 0 - 7 0 ，t m 值达到9 5 5 曲8 。随着细菌嗜热性的提高，其d n a 的 值也相应有所提高，熔点提高与d n a 中g + c 含量存在一定的关系。 也有研究表明高温菌耐热性与基因组g + c 含量之间没有直接关系，而与1 6 s r r n ag + c 含量之间明显存在正相关。郭春雷等人1 1 1 l 对已有效发表的8 0 多种超 高温菌的基因组和1 6 sr r n a 的g + c 含量进行统计分析。结果表明，1 6 sr r n a g + c 含量与最适生长温度呈现出一定程度的j 下相关，如图2 2 b 所示。而由图2 2 a 可见，基因组g + c 与最适生长温度并无一定关系。 零 芎 善 粤 宅 磊 菩 图2 - 2 基因组g + c 含量、1 6 sr r n ag + c 含量与高温菌最适生长温度关系 f i g 2 - 2r e l a t i o n s h i pa m o n gg + cc o n t e n t , 1 6 sr r n ag + c c o n t e n ta n dh i g ht e m p e r a t u r eo ft h e o p t i m a lg r o w t h 7 华东师范人学2 0 1 0 届硕l 学位论文高温菌株生理生化及有机物降解性质研究 ( 4 ) 蛋白质的热稳定性 蛋白质的热稳定性通常由氢键、离子对、范氏力等非共价的相互作用来维持。 通过比较常温菌与高温菌的同源蛋白，发现影响蛋白质稳定性的内在因素有蛋白 质核心非极性程度，表面体积、小分子中的甘氨酸及大量的离子间相互作用等。 影响蛋白质分子稳定性的外在因素有：一些分子能够与变性的分子结合，阻止这 些变性分子聚集，并使其重新折叠恢复活性。 卢柏松等人【1 2 】通过分子生物学序列数据库“e n t r e z ”得到1 1 0 条嗜热蛋白 质相关的序列。选择相似性最大的嗜常温微生物( 最适生长温度 3 0k d a ) 的e x s1 0 和拥有较低分子量( 3 0k d a ) 的 e x s1 1 。其中e x1 0 类的木聚糖酶具有更高的耐热性。e x s1 1 类的酶则由于能 够增强牛皮纸浆的漂白效果而受到更多的欢迎【2 引。 人们以细菌和真菌为分离源分离到大量的耐热木聚糖酶( 表2 5 ) 。据报道， b a c i l l u ss p ，s t r e p t o m y c e ss p ，t h e r m o a s c u sa u r a n t i a c u s 和f u s a r i u mp r o l i f e r a m m 的菌株能够产生在5 0 。c 8 0 ( 2 的条件下具有活性的木聚糖酶。而d i c t y o g l o m u ss p 则能够产生最适温度为9 0 的木聚糖酶。许多t h e r m o t o g a l e ss p 的菌株能够分泌 在更高温度条件下发挥功能的耐热木聚糖酶。最近也有报道关于从 t h e r m o a c t i n o m y c e st h a l o p h i l u s 亚群c 分离出最适温度为6 5 的嗜碱无纤维素木 聚糖酶，以及从c f r 7 0 2 ( c l o s t r i d i u ma b u s o n u m ) 分离出无纤维素木聚糖酶。 另外也从t h e r m o t o g as p 中分离出来一种能够在1 1 5 时具有活性的酶。也可以 利用固态发酵来生产木聚糖酶，由于培养时间的减少和基础培养基浓度的增加， 其产量可以得到较大的改善。从经济学的角度来看，这方面具有很大的发展潜力 1 2 9 。 1 6 t e h e r o m y c e sl a n u g i n o s u s ( w 硼a n dm u t a n t ) t h e r m o t o g am a r i t i m am s b 8 t h e r m o t o g am a r i t i m am s b 8 t h e r m o t o g as p s t r a i nf j s s 3 - b 1 t h e r m o t o g as p s t r a i n 巧s s 3 一b 1 t h e r m o t o g as p s t r a i nf j s s 3 - b 1 6 6 6 5 - 3 7 0 ，6 7 6 5 5 6 2 6 0 - 7 5 6 2 6 5 5 5 5 7 6 8 - 7 8 5 3 6 6 1 7 0 5 枷 耋| 酊 ；宝 邮 唧 卯 s ! 够 巧 鳄 龉 詈| 舳 刍 3 刍 华东师范大学2 0 1 0 届硕士学位论文高温菌株生理生化及有机物降解性质研究 制浆造纸工业是当今发展最迅速的产业之一，而耐热木聚糖酶则由于其带来 的全球环境效益而备受青睐。然而，从不同微生物所分离出来的酶的产量仍然不 能完全满足当今工业的需要。值得一提的是，现在发现的能够分泌木聚糖酶的超 高温菌数量相当少。因此，对拥有高产量且具有理想特性的高温菌的探索仍然是 当前的一个主要挑战。 2 3 6 嗜热几丁质酶 几丁质又名甲壳素、甲壳质，其有效成分是几丁聚糖( 壳聚糖) 。在自然界 中，几丁质存在于低等植物菌类、藻类的细胞，甲壳动物虾、蟹、昆虫的外壳， 高等植物的细胞壁等，是除纤维素以外的又一重要高分子多糖类物质。由n 乙酰 葡糖胺通过夕1 ，4 糖苷键相连而成。脱乙酰几丁质的主要用途包括废水处理、化 妆品制造、造纸、纺织业、摄影产品、水泥、重金属螯合剂以及医学和兽医等方 面的用趔2 9 州。 利用几丁质来生产脱乙酰几丁质需要在4 0 的氢氧化钠溶液中通过脱乙酰 反应来完成。这些具有高度腐蚀性的溶液非常难于控制。因此现在已经开始进行 一些使用甲壳素脱乙酰酶来完成这一转化的尝试。或许一种耐热的脱乙酰酶可以 促使酶产量和转化率的提高，并可以实现酶的回收使用。 能够对几丁质起降解作用的酶包括内切几丁质酶a 、外切几丁质酶b 和n 乙酰葡萄糖转苷酶。然而，几丁质酶和脱乙酰酶并不