（环境工程专业论文）木质素的生物分离净化.pdf

摘要 木质素是一种芳香类生物聚合物，广泛存在于羊齿类及更高等的植物中。它具有资源 丰富、可再生等优点，是一种可持续发展的资源。木质素成本较低，木质素及其衍生物具 有多种功能性，其应用前景十分广阔。如可作为分散剂、吸附剂、解吸剂、石油回收助剂、 沥青乳化剂，木质素对人类可持续发展最为重大贡献就在于提供稳定、持续的有机物质来 源。但基于木质素中存在大量的l c c 复合体结构，影响其利用，因此研究木质素提纯意义 重大。 本论文以此为立题依据，用微生物发酵处理具有l c c 结构的工业粗木质素原料，纯化 木质素。采用透明圈法于实验室分离筛选出细菌一株( x l 1 ) 及霉菌两株( m 卜i 、m 3 2 ) ，3 株菌均能产生明显透明圈，具有较高的半纤维素酶活力，x 卜1 酶活力为1 3 4 5 7u m l 一， m 1 1 、m 3 2 酶活力分别为6 2 5 0u m l 1 、1 8 5 0 0u m l 一。同时，实验证明，此3 株均对 半纤维素的利用具有较高的选择性，它们基本不利用木质素但是对半纤维素的利用效果明 显。 3 株菌产生的半纤维素酶性质为：m 3 2 产生的酶最适温度为4 5 c ，m 1 - 1 产生的酶最适 温度为5 0 ，x l - i 产生的酶最适温度为为5 5 c ；m 3 2 、m 3 1 产生的酶最适p h 值均为5 、 x i - i 产生的酶最适p h 值为6 ；m 3 2 在5 5 ( 2 以下比较稳定，m 3 一l 在6 0 以下稳定，而x 1 - 1 在5 5 以下稳定。 工业木质素原料进行发酵处理后，从各个方面检验处理效果，通过测定发酵液中总糖 含量、发酵液中单糖含量、样品碳氢元素变化，并采用红外吸收、紫外吸收等测量手段对 处理前后的木质素进行测定。实验结果显示，处理前后发酵液中总糖含量及单糖含量均发 生变化，同时处理后原料中木质素含量有所增加，纯度有所提高。例如，表征木质素结构 的紫丁香环在1 1 2 9 2 9 c m - 1 处的吸收值增加了0 2 6 5 4 ，1 6 0 3 9 1 c m 1 处，芳香环( 骨架振动) 振动吸收值增加了0 4 5 6 5 ；1 5 1 4 o o c m d 芳香环( 骨架振动) 振动吸收值增加了0 4 1 5 0 。 关键词：木质素，l c c 复合体，半纤维素，半纤维素酶，透明圈，发酵 s t u d yo n t h ep u r i f i c a t i o no fl i g n i nf r o m p u l p i n g b l a c kl i q u o rb y b i o l o g i c a lm e t h o d s u a u n o x y ac l a s so fa r o m a t i cc o m p o u n d s ，l i g n i n ，f o u n dw i d e l yi np l a n t ss u c h a s g i g a n t o p t e r i d e sa n do t h e rh i g h e r p l a n t s i tisa b u n d a n t ，r e n e w a b 上e s u s t a i n a b l ea n dc h e a p l i g n i n a n do ri t sd e r i v a t i v eh ，a v em a n yf u n c t i o n s , t h i so p e n e du pb r o a dp o s s i b i l i t i e sf o r u s ei nm a n ys p h e r e ，s u c h a s d i s p e r s a n t ， s o r b e n t ， s t r i p p a n t ， as u b s t a n c et oh e l pr e c l a i mp e t r o l e u m ， a s d h a i te m u l s i f i e ra 1 t h e m o s ti m p o r t a n tc o n t r i b u t i o no fli g n i nt o s u s t a i n a b l ed e v e l o p m e n t o ft h ew o r l dist h a ti tc a np r o v l d eo r g a n l c s u b s t a n c es t e a d i l y a n dp e r s i s t e n t l y b u t ，l o t s o fl c c ( l i g n i n c a r b o h y d r a t ec o m p l e x e s ) i nl i g n i nl i m i tt h eu s er a n g eo f1 1 9 n l n ，s oi t i ss i g n i f i c a n tt or e s e a r c ht h ep u r i f i c a t i o no f l i g n l n t h i sp a p e ri sb a s e do nt h e s ep o i n t s w ef e r m e n t e dl i g n i nf r o mi n d u s t r y w i t ht h es t r u c t u r eo fl c cu s i n gm i c r o o r g a n i s mt o p u r i f yl i g n i n u s i n g am e t h o dc a l l e dt r a n s p a r e n tc i r c l e ，t h r e e s t r a i n s ，x l l ，m 1 1a n dm 3 2 w i t hh i g hc a p a c i t yf o rd e g r a d i n gh e m i c e l l u l o s e w e r es c r e e n e d t h et h r e e s t r a i n so fm i c r o o r g a n i s ma l lc a np r o d u c eo b v i o u st r a n s p a r e n tc i r c j - ea n d t h e va 1 1h a v eh i g ha c t i v i t i e s o fh e m i c e l l u l a s e ，t h ea c t i v i t i e s o f h e m i c e l l u l a s eo f x l 一1w a sa sh i g ha s1 3 4 5 7u 。m l ，a n d m 1 1 ，i d 3 2w a s 6 2 5 0u m l 一1 、1 8 5 0 0u m l 一1s e p a r a t e l y a t t h es a m et i m e ，e x p e r l m e n t s i n d i c a t e dt h a tt h et h r e es t r a i n so fm i c r o o r g a n i s m c a nc h o o s et od e g r a d e h e m i c e l l u l o s es e l e c t i v e l y ，b u tt oal a r g ee x t e n tt h e yd on o tm a k eu s e o f l i g n i n t h ef 0 1 1 0 w i n gw ew i l l i n t r o d u c et h ep r o p e r t i e so f h e m i c e l l u l a s e p r o d u c e df r o mt h et h r e es t r a i n so fm i c r o o r g a n i s m t h eo p t i m a lt e m p r e t u r e f o rm 3 2 ，m 1 1a n dx l 一1w e r e4 5 。c ，5 0 。c a n d5 5 cr e s p e c t i v e l y ，a n dt h e o p t i m a lp hw e r ep h5 ，p h5a n dp n6r e s p e c t i v e l y w h e nt h et e m p r e t u r e i sb e l o w5 5 c ，t h ea c t i v i t i e so f a c t i v i t i e so fh e m i c e l l u l o s eo f h e m i c e l l u l a s eo fm 3 2i ss t a b l e b u tt h e m 3 1a n dx 1 1 i ss t a b l eo n l yw h e nt h e t e m p r e t u r eisb e l o w6 0 。c a f t e rb e i n gf e r m e n t e d ，t h ee f f e c t so ft r e a t m e n tw i l lb ed e t e r m i n e d i nv a r i o u s m e a n s t h r o u g h t h ed e t e r m i n a t i o n o ft o t a ls u g a r ，m o n o s a c c h a r i d e s ，t h em o l er a t i oo fc ：ha n dt h ec o n t e n to fl i g n i n ( b yu va n d f t i rs t u d i e s ) ，t h e r e s u l t i n d i c a t e dt h a t t h ec o n t e n t o ft o t a l s u g a r ，m o n o s a c c h a r i d e s a n dt h em o l er a t i oo f c ：hh a dc h a n g e da f t e r f e r m e n t i n g b e s i d e s ，t h er e s e a r c h s h o w e dt h a t t h ec o n c e n t r a t i o no f l i g n i ni n c r e a s e d ，t h a ti st os a yt h ef e r m e n t e di g n i ni s m o r ep u r e 卜o r e x 锄p l e ，t h eb a n d a t1 1 2 9 2 9 c m - 1 ，s y r i n g y ，c h a r a c t e r i s t i c o f1 1 9 n l n s t r u c t u r e，it s a b s o r b a n c eh a d i n c r e a s e d0 2 6 5 4 ， a n dt h eb a n d a t 1 6 0 3 9 1 c m - 1 a n d 1 5 1 4 o o c m - 1 ，i n d i c a t i v e o f a r o m a t i c s k e l e t a l v i b r a t i o n ，t h ea b s o r b k e yw o r d s ：l i g n i n ， a n c e l i h a si n c r e a s e d0 4 5 6 5a n d0 4 1 5 0r e s p e c t i v e l y g n i n c a r b o h y d r a t e c o m p l e x e s ，h e m i c e ll u l o s e ， h e m i c e l l u l a s e ，t r a n s p a r e n tc i r c l e ，f e r m e n t 第一章绪论 1 1 造纸黑液污染问题 i 1 1 全球环境问题 2 0 世纪飞速发展的工业经济给人类带来了高度发达的物质文明，但人类也处在重重矛 盾之中，环境问题已经从局部的小范围发展成地区性的甚至是全球性的了，显然其影响也 更广泛更深远了。当今世界正面l 临着以下十大环境问题：全球气候变暖、臭氧层破坏、生 物多样性减少、酸雨蔓延、森林锐减、土地荒漠化、资源短缺、水环境污染严重、大气污 染肆虐、固体废弃物成灾。 众所周知，除了空气以外，水最贴近我们的生活、与我们息息相关。水是生命的源泉， 是维持生命的要素，是人类社会不可缺少的物质，也是一切生物赖以生存的物质基础。水 是国民经济的命脉。农业用水占人类消耗淡水总量的2 3 以上，随着工业的发达和人民生 活水平的提高，工业用水和生活用水也急剧增长。但人口膨胀和工业发展所制造出来的越 来越多的污水废水终于超过了天然水体的承受极限，于是本来是清澈的水体变黑发臭细 菌滋生，鱼类死亡，藻类疯长，更为严重的是，本来足以滋养人体的水，常因含有有毒物 质而使人染病，甚至致人于死地。水污染问题相当严重! 1 1 2 造纸业水污染问题 当前，我国水体污染物仍然以无机污染物为主( 任南琪等，2 0 0 2 ) ，有机物的主要来源 是工业排放，其中造纸业是一个重要的污染源。 造纸业是一个以国民经济及社会建设息息相关的重要产业部门，其发展水平已经成为 衡量一个国家经济发展和社会发展水平的重要标志。另一个方面，造纸业也是一个重要污 染源，在美国，造纸工业被列为环境污染的六大公害之一( 钢铁、炼油、电力、石油化工、 矿山和有色金属、造纸) 。日本也将造纸工业被列为环境污染的五大公害之一( 钢铁、电力、 石油化工、矿山和有色金属、造纸) 。据近年统计资料介绍。我国制浆造纸工艺废水排放量 约占全国废水总排放量的1 0 1 2 ，居第三位；排放废水中化学耗氧量( c o d ) 全国总 排放量的4 0 4 5 ，居世界第一位( 任南琪等，2 0 0 2 ) 。 制浆和造纸厂的废水主要来源于三个方面，制浆废液( 黑液、黄液或红液等) 、中段水 ( 包括洗浆水和漂白水) 和纸机自水等。其中，污水主要来源于制浆段( 黑液、黄液或红 液) ，约占总污染物发生量的9 0 。造纸业的污染程度不可低估，据统计，每生产i t 纸浆 需2 3 t 纤维原料、3 0 0 k g 碱和l o t 水，若不考虑废液中的资源回收则将有1 5 t 左右的原 材料( 包含4 0 0 v g 木质素，3 0 0 k g 碱) 成为环境污染物，形成江河污染的主要污染源( 任 南琪等，2 0 0 2 ) 。 其中，黑液对环境的污染最大，黑液中的c o d , , 通常在2 0 0 0 0 5 0 0 0 0 m g l ，且p h 值 在1 0 1 2 之间( 徐常新等，2 0 0 1 ) ，其有机污染负量占全部有机污染负荷的9 0 以上( 秦 毅红等，1 9 9 8 ) 。 1 1 3 黑液成分 黑液成分分有机物和无机物两大类。 有机物占6 5 舻7 0 ，主要成分是木质素、半纤维素、纤维素及有机酸等。其中，木 质索是主要成分，占3 0 4 0 ，木质素含量最低的是稻草半料浆黑液，只占1 2 * 左右。 有机物中挥发性有机酸含量一般占1 0 1 7 ，而在红松浆黑液中只占8 左右。有机物 中包含少量的悬浮小纤维，而草浆黑液中小纤维及杂细胞含量比较离，松木浆黑液含有一 定量与钠化合的脂肪酸和树脂酸皂化物。 无机物占3 0 3 5 ，它主要来自蒸煮中用的碱，碱在黑液中多与无机物化合，也有 少量的n a o h ，n a 2 s ，n a 2 c 0 3 ，n a 2 s 0 4 等，而硅来自草类原料和碱回收炉的耐火材料。此 外还有些c a 、f c 、a l 等成分( 梁实梅等，2 0 0 4 ) 。 i i 4 黑液治理 1 1 4 1 国内外治理情况 对于黑液，目前的治理方法主要有物理的、化学的和生物方法。国际上通常采用的方 法主要是碱回收法，此法处理黑液的同时还能对碱进行回收，大型纸厂用此法还能创造一 定的利润( 徐常新等，2 0 0 1 ) 。但此法所需投资较大，一般的中小型纸厂无法承受。我国造 纸工业情况与国外有所不同。国外用木材造纸，造纸废液进行碱回收的同时将木质索转变 下成热能。所以，造纸废液对环境不会造成污染( 蒋挺大，2 0 0 1 ) 。 而我国木材资源短缺，采用非木材原料生产的纸浆占纸浆总量的7 0 以上。其中大部 分又使用诸如麦草、稻草、高梁杆、蔗渣、棉杆、龙须草、芦苇、荻苇、芒杆等草类原料。 2 由于原料的特征限制了工厂生产的规模，仅据1 9 8 7 年资料，我国年产万吨以下的小厂占工 厂总数的9 5 以上。 碱法制浆是我国主要的制浆方法。碱法草浆黑液由于以下不利因素难以采用传统的碱回 收工艺处理：( 1 ) 该装置投资较大，且碱的回收率仅为4 7 8 ，回收碱的成本也较高，不 适合中小造纸企业( 王宏斌，2 0 0 5 ) 。( 2 ) 废液提取率低；( 3 ) 草浆黑液较木浆黑液固形物 浓度低，但由于硅和细小纤维含量高，致其粘度大，蒸发时易结垢，浓缩困难；( 4 ) 草浆黑 液热值低，燃烧时难以维持必要的炉温，在此情况下。草浆黑液的碱回收在经济上尚不过关， 一些已建有碱回收的中型草浆厂不能正常运转。小型草浆厂基本没有碱回收系统。大量黑液 直接排放造成严重后果( 贺延龄，1 9 8 8 ) 。 1 1 4 2 酸析法治理黑液 由于我国造纸厂规模较小，不适于碱回收。当前，我国广泛采用的处理黑液的方法是 酸析法。这种方法的原理是木质素( 黑液中的主要成分) 的溶解度随着p h 值的下降而下 降，一般在p h 值降到5 0 以下时就会析出。这样。就能使废水的c o d 值大大下降( 徐常 新，2 0 0 1 ) 。 1 2 木质素 1 2 1 木质素概况 木质素是黑液中的主要成分，木质素是造成造纸废水颜色发黑的主要原因( 王宗等， 2 0 0 3 ) 。木质素是造纸工业的副产品，极少被利用。每年约有2 6 0 万吨碱木素排人江河，造成 木质素资源的极大浪费。其研究工作，也只是1 9 3 0 年后才真正开始( 王平等，2 0 0 5 ：曾育才 等2 0 0 5 ) 。 造纸原料中的主要化学成分是纤维索、半纤维素和木质索三种成分。在原料中，这三 种成分构成植物体的支撑骨架：其中纤维素组成微细纤维，构成纤维细胞壁的网状骨架， 而半纤维索和木质索则是填充在纤维之阈和纤维希望之间的“粘合剂”和“填充剂”( 杨 淑惠，2 0 0 1 ) 。木质索、纤维素与半纤维素是构成植物骨架的主要成分。 就总量而言，地球上木质素的含量仅次于纤维素。估计每年全世界每年由植物生长可 产生1 5 0 0 亿吨木质素( 杨龙寿等，1 9 9 4 ) ，我国森林资源不是很丰富，但农作物秸秆每年 有5 6 亿吨。 3 1 2 2 木质素结构 木质素结构复杂，不能用简单的语言表达。只能说木质素是一种具有芳香族特性。其结 构单元为苯丙烷型的、非结晶型的、三维高分子网状化合物( 谭东，1 9 9 4 ) 。木质索的基本 结构单元是苯丙烷，同时确认了在苯环上有甲氧基存在。目前认为以苯丙烷为结构主体的木 质索具有三种基本结构( 蒋挺大，2 0 0 1 ) ，如图1 1 。 这些结构单元的酚羟基、甲氧基、羰基和苯环等活性基团，具有许多化学反应能力。木 质索的芳香环结构使它成为一系列有机化学物质潜在的重要资源。( 王平等。2 0 0 5 ：曾育才 等，2 0 0 5 ) 。 在自然界，木质素总是与半纤维素及纤维索共存的。经长期研究，已经发现，在造 纸的蒸煮过程中，从初期到后期，在蒸煮液里均能发现木质素和半纤维素的复合体。现已 经查明，木质素和半纤维索之问的确存在化学键，构成木质素碳水化合物复合体 ( l i n g i n - c a r b o h y & a t ec o m p l e x 简称l c c ) 。1 9 5 7 年，贝克曼以含水二氧己环制取磨木木 质素，后对剩下的残渣分析发现，云杉木材中的木质素，大约有一半是游离存在的，而另 愈创木基苯丙烷单元紫丁香基苯丙烷单元对经基苯丙烷单元 图1 - 1 木质索三种基本结构 外一半是以复合体形式存在的。月岛从日本红松中分离出磨木木质素后，再经过凝胶柱仔 细分离出木质素一碳水化合物复合体，所分出的复合体中，木质素和聚糖之比为1 ：1 。这 也说明木质素一碳水化合物复合体是存在的( 杨淑惠，2 0 0 1 ) 。 1 2 3 木质素性质 1 2 3 1 物理性质 木质索是一种白色或接近无色的物质。我们见到的木质素颜色是在分离制备过程中形 4 事 y 众 ? o - 成的：木质索的相对密度在1 3 5 1 5 0 之间，制各方法不同，相对密度也不同；没有不对 称碳，所以不具有光学活性；原本木质索是不溶于任何溶剂的，分离的木质素发生了分离 和降解，许多物理性质改变了，溶解度也随着变：酚羟基或羧基的存在，使木质素能够在 浓的强碱溶液中溶解。除酸木质素不溶于所有溶剂外，分析木质素和分离的级份都可以部 分的溶解在甲醇、乙醇、丙酮、或溶剂混合物中，工业碱木质素和木质素磺酸盐一般都可 以溶于水，稀碱、盐和缓冲溶液与一些碱性和中性的极性溶剂中( 蒋挺大。2 0 0 1 ；邬义明， 1 9 9 5 ) 。 1 2 3 2 化学性质 木质素是由三种不周类型的苯丙烷基单体通过脱氢聚合生成的无定形具有巨大网状空 间结构的三维聚合物。木质素苯丙烷基单元有2 3 是通过醚键连接的，其余为碳碳键连接， 木质素结构、成分复杂，其水溶液是一种近似胶体的溶液。具有一定的表面活性，能降低水 的表面张力。木质素具有较大的表面积，其分子中的反应基团醚键、碳碳双键、醇羟基、酚 羟基和苯环等都暴露在外，有利于对其进行化学改性，可进行烷基化、羟基化、酯化、酰化 等反应( 惠会清，2 0 0 5 ) 。 1 3 木质素的应用 1 3 1 在工业上的应用 ( a ) 从木质素结构看，它有非极性的芳环侧链和极性磺酸基等，因此有亲油和亲水性。 可用作水泥减水剂( 木质素磺酸盐具有较强的阴离子表面活性基团。在中性和酸性水中均 可溶解，具有很好的稳定性，因此可以用作混凝土减水剂) 、水泥助磨剂、沥青乳化剂、钻 井泥浆调节剂、堵水剂和调部荆、稠油降粘剂、三次采油用表面活性剂、表面活性剂和染 料分散剂等( 雷中方等，1 9 9 3 ；赵颖华等，2 0 0 5 ) 。 ( b ) 木质素是一种天然高分子化合物，本身就有粘结性，再经过酚、醛或其它方法改 性，其粘结性会更佳。利用这一特性，用作木材胶粘剂( 曾文等，1 9 9 7 ) 。当用作木材的粘 合剂时( 陶用珍，2 0 0 3 ) ，可直接与木材混合。木质索还可以作型煤胶粘剂、铸造型砂胶粘 剂、筑路用胶粘剂、荒漠治沙用胶粘荆、于肥科用胶粘剂等( 孔望清等，2 0 0 5 ) 。 ( c ) 木质素在合成材料中的新型应用。木质素在热硬化的不饱和的聚酯和乙烯基酯中， 作装填物和共聚用单体使用。 ( d ) 用于制造碳纤维。 ( f ) 用作橡胶添加剂。 1 3 2 在农业上的应用 ( a ) 利用木质素迟效性，作各种肥科使用。如作缓释氮肥、木质素磷肥、木质素复合 肥、木质素整合微肥等( 粱国治等，2 0 0 6 ) 。 ( b ) 作农药缓释剂( 蒋挺大，2 0 0 1 ) 。木质素比表面积大，质量轻，它能与农药充分配 合，尤其是分子结构中很多的活性基因，能通过简单的化学反应与农药分子产生化学结合， 使农药从木质索的网状结构中缓慢释放出来，延长了农药的药效。木质索还有很好的吸收紫 外线的性能，对光敏、氧敏的农药能起到稳定作用：木质索本身无毒；木质素在土壤中能缓 慢降解，最终不会有污染物残留。 ( c ) 作植物生长调节剂和饲料添加剂。木质素经稀硝酸氧化降解，再用氨水中和，可 生产出邻醌类植物生长激素。这种激素对于促进植物幼苗根系生长提高移栽成活率有显 著作用：使植物的叶色较绿，叶片较大；对水稻有提早成熟的作用；对水稻、小麦、棉花、 茶叶及白芨等作物有一定的增产效果( 陶用珍等，2 0 0 3 ) 。 ( d ) 作液体地膜( 陶用珍等，2 0 0 3 ) 。木质素是一种可溶性的天然高分子化合物，只需 添加少量碱即可有一定的成膜性，也有一定的强度。 ( e ) 用木质素磺酸盐做沙土稳定剂( 李健法，2 0 0 2 ) 。木质素磺酸盐喷洒在沙土表面后， 首先与沙土表层的沙土颗粒结合，通过静电引力、氢键、络合等化学作用，在沙土颗粒之 间产生架桥作用，促进了沙土颗粒的聚集。木质素固沙作用的研究已经取得了显著成果( 鲁 小珍，2 0 0 5 ) 。 1 3 3 在医药方面的应用 ( a ) 用作抗癌剂和抗诱变剂( 陶用珍等，2 0 0 3 ) 。 ( b ) 在医药业上，木质索磺酸盐还被认为具有肝素的类似医疗功能。用来制造抗凝血 剂、抗溃疡剂、抗炎剂、抑汗剂、杀菌剂、兴奋剂和壮身剂等。并且广泛用予饮料食品、 化妆香料和食品防腐等方面( 蒋挺大，2 0 0 1 ) 。 6 1 4 从黑液中分离木质素 1 4 i 方法总述 从黑液中分离木质素已经有很多人在这方面做过研究( 孙勇等，2 0 0 5 ) ，概括起来主要 有五种方法：降低黑液的p h 值，使碱木索沉淀出来；在黑液中加人电解质，破坏木 素的胶体性，使其沉淀；采用超滤法分离；采用电渗析法分离纯化；采用生物法分 离提纯。 1 4 2 酸沉淀法 罗才典等研究了麦草硫酸盐黑液中木素的酸化沉淀特性。木索的酸化过程分为三个阶 段：禾素的稳定阶段，p h ：1 2 - 0 6 2 ，木素稳定存在黑液中不发生沉降；术素的沉降阶 段，p h 2 3 0 ，木索迅速沉降；木素的残留阶段，p h d a b ，即n a o h 浓度对 半纤维素的提取率影响最大。其次为p h 值，再次则是蒸煮温度和乙醇与滤液之比。其中 最佳组合为a 2 b ，c 3 d ，即用6 的n a o h 浸泡稻草( 液固比为1 5 ：1 ) 于1 0 0 c 反应2 h ，过 滤得滤液，调节滤液p h 值至7 0 ，再按滤液：乙醇( 体积比) 为1 ：0 8 的配比沉淀半纤 维素。采用该工艺半纤维索得率可高达6 7 8 5 。该方法操作简单，对于实验室自制半纤维 素比较简便。 表3 - 4 正交实验方案与结果 a 蒸煮温度 b 乙醇憾液之比 cn a o h 浓度 d p h 1 8 6 5 1 2 2 1 1 6 1 9 o 2 0 3 7 9 3 2 3 6 1 0 3 8 0 9 9 1 0 1 9 1 8 6 4 6 非常显著 a 2 1 2 2 0 5非常显著b 3 1 6 1 9 8 9非常显著c 3 2 0 3 7 0非常显著d 3 3 3 6 小结 从原科获取的便利性、半纤维素含量、制备简便等因素来考虑，选择稻草作为半纤维 素的制备原料。各因素对半纤维素得率影响如下： ( a ) 浸泡温度从9 0 ( 2 开始半纤维素得率有较大增加。 ( b ) 碱浓度控制在5 比较适合。 ( c ) 半纤维素提取得液固最佳比为1 5 ；1 。 ( d ) p h 值为7 半纤维素得率晟高，达到4 7 8 。 2 9 半纤维索最佳制各条件如下： 用6 0 的n a o h 浸泡稻草( 液固比为1 5 ：1 ) ，于1 0 0 c 反应2 h ，过滤得滤液，调节滤 液p h 值至7 0 。再按滤液：乙醇( 体积比) 为1 ：0 8 沉淀半纤维索采用该工艺半纤维 素得率可高达6 7 8 5 。 3 4 菌株筛选 3 4 1 初筛 用分离培养基制成平板，共分离得到生长较快的4 株细菌( 编号为x i x 4 ) 及6 株 霉菌( 编号为m 1 - m 6 ) ，结合定性( 透明圈法) 、定量( 测定半纤维素酶活) 的方法对分 离得到的这l o 株菌进行筛选。 图3 - 5 分离平板上产透明圈的细菌及霉菌图3 喝透明圈测定平板上点种细菌和霉菌 微生物降解半纤维素主要是依靠系列酶的共同作用，检验这些酶的产生是简洁而有 效的方法是透明圈法。 用半纤维素作碳源，根据是否产生透明圈，进行初步筛选产半纤维素酶菌株的方法是 可靠的( 王宜磊等，2 0 0 0 ) ，半纤维素在分离平板中里悬浮状态，能够降解半纤维素的微生 物可在其菌落周围产生肉眼可见的水解圈。而无需象筛选降解淀粉、果胶、纤维素的微生 物那样，要在分离培养基中加入显色剂或诸如乙醇、溴化十六烷三甲基胺( c t a b ) 之类的多 糖沉淀剂。 将本课题分离得到的1 0 株菌接种至透明圈培养基平板上，经1 2 0 d 培养后发现，产生 明显透明圈的共有6 株( 细菌2 株，编号为x 1 、x 3 ；霉菌4 株，编号为m i ，m 3 ，m 5 。 m 6 ) ，见图3 - 5 ，图3 - 6 。其中脱色较快，经1 2 0 d 培养后透明圈直径d 3 c m 的有4 株( 细 菌1 株，x l ：霉菌3 株，m 1 ，m 3 ，m 6 ) ，结果见表3 - 6 。 表3 - 6 半纤维素降解初筛菌株的有关性状 3 4 2 复筛 3 4 2 1 木糖标准曲线的制作 按照2 6 1 2 的方法制作木糖标准曲线备测半纤维素酶活。标准曲线如图3 7 所示 曲线回归方程为：y = 0 0 1 9 1 6 1 x - 0 0 3 3 2 5 ，相关系数为：r 2 = o 9 9 7 2 1 。以此曲线作为标准， 测定半纤维素酶活。 木糖m g 图3 7 木糖标准曲线 3 4 2 2 透明圈与半纤维素酶活 将脱色较快，脱色圈直径d 3 c m 的4 株菌( x i 。m i ，m 3 ，m 6 ) 分别点种至透明圈 测定平板上，每株菌做2 4 个透明圈( 编号确：以x 1 为例，第n 个透明圈编号为x 1 n ) 。 分别按照透明圈的测定方法，定时测定透明圈与菌苔直径比值( d d ) ，并作透明圈t 0 值一 3 1 时间曲线( 见图3 - 8 、图3 9 ) ，观察固体培养基上的产酶情况。由图3 - 8 、图3 - 9 可知，m 3 ， m i ，m 6 ，x 1 分别在7 6 h 、8 2 h 、7 6 h ，9 4 h 时，透明圈比值最大，菌落酶活力表现最高。 每株菌的透明圈及半纤维素酶活见表3 7 ，表3 - 8 ，表3 - 9 ，表3 1 0 ( 部分实验结果) 试验 结果说明三株菌是具有半纤维素酶活的，m 3 酶活最强，m 6 酶活最弱。由于m 6 相对其它 表3 - 7m 3 透明圈与半纤维索酶活 表3 - 8m 1 透明圈与半纤维素酶活 表3 - 1 0u 6 透明圈与半纤维索酶活 表3 - 9x 1 透明圈与半纤维素酶活 菌株来说酶活低得多，因此本课题不予选用。而x l ，m i ，m 3 中又分别以x 1 1 、m l 一1 、 m 3 - 2 酶活最强，因此x l - 1 、m 1 1 、m 3 - 2 作为本课题的最终选用菌株。 令 e 趔 丑 匣 霉 魁 图3 - 8 三株霉菌的透明圈比值随时间变化曲线 图3 - 9x l 透明圈比值随时间变化曲线 同时，从表3 7 ，表3 - 8 ，表3 - 9 ，表3 一1 0 也可以看出，多数产生较大水解圈的菌株半 纤维素酶活力也较高( 表中为部分实验结果) 。但也有透明圈小而酶活强的现象，所以透明 圈大小不能完全代表酶活力。仅以水解圈大小作为半纤维索酶活力大小的定量指标是不太 可靠的，所以液体发酵测定每个菌株半纤维素酶活进行复筛是必不可少的。 实验结果证明，x 1 ，m i ，m 3 中分别以x 1 1 、m i - 1 、m 3 2 酶活最强，因此x i 1 、 m i - 1 、m 3 2 作为本课题的最终选用菌株。 3 3 3 4 3 小节 用半纤维素作碳源，根据是否产生透明圈，初步筛选产半纤维素酶菌株的方法可靠、 简便，半纤维索在分离平板中呈悬浮状态，。能够降解半纤维素的微生物可在其菌落周围产 生肉眼可见的透明圈。 本课题用透明圈法结合半纤维素酶活力测定，筛选出具有半纤维索降解能力的细菌一 株x 1 1 及霉菌两株( m 1 - 1 、m 3 - 2 ) 。这3 株菌跟已有的研究成果( 王宜磊等，2 0 0 0 ) 相比， 具有较高的半纤维素酶活力，已有的研究成果中，酶活较高的只是在5 0 0u m l 。1 5 0 0 u m i - i 的范围，而本课题筛选的菌种酶活高达6 0 0u m i 1 2 5 0 0u m l 。这对于今后的 生产将很有意义。 3 5 菌种鉴定 细菌鉴定结果见表3 1 0 。 x i 1 长时间培养时，菌苔明显呈裂叶状，将其定为地衣芽孢杆菌( r e 布坎南，1 9 8 4 ： 范秀容，1 9 9 0 ；r e 戈登，1 9 8 3 ；中山大学生物系微生物学教研室，1 9 7 8 ) 。 两株霉菌经小室培养及菌落形态观察。发现m i 一1 、m 3 2 有以下特征：菌落绿色，絮 状菌丝，菌丝具有横隔。如图3 - l o ，分生孢子梗具有横隔，有扫帚状分支，如图3 - 1 1 。初 步将m i 1 、m 3 2 定为青霉属 因此，初步鉴定x 1 1 为地衣芽孢杆菌，m i 1 、m 3 2 属于青霉属。 表3 一1 0x i 1 的鉴定实验及结果 图3 i o 霉菌菌丝 3 6 发酵周期确定 3 6 1 发酵周期的重要性 图3 - 1 1 霉菌帚状枝 培养时间与菌体的生长、产酶有密切的关系，培养时问过短，菌体生长不足，半纤维素 酶活力就不高；但如果培养时间过长，则菌体老化甚至自溶( 闺三弟等，1 9 9 4 ) ，酶活力也 降低所以选择一个合适的发酵周期很重要。 3 6 2 生长曲线 i 一 芒 曲 彝 刊 图3 1 2m 3 - 1 、m 3 - 2 生长曲线 将m 3 - 1 、m 3 - 2 种子液以4 接种量接入2 5 0 m l 三角瓶、装液量为5 0 r a l 的液体发酵 培养基进行摇瓶培养，振荡速度维持在1 2 0 r m i n ，培养温度为2 8 ( 2 ，培养1 3 天。从第四 天开始，每天取两个样。过滤收集，蒸馏水洗涤数次，然后于6 0 c 以下烘干至恒重，测 菌丝干重，从而得到生物量随发酵时间的变化，即生长曲线。m 3 - i 、m 3 2 的生长曲线如 图3 1 2 。 3 6 3 半纤维素酶活随发酵时间的变化 将m 3 1 、m 3 - 2 ，x i 1 接入2 5 0 m l 三角瓶、装液量为5 0 m | 的液体发酵培养基进行摇 瓶培养。振荡速度维持在1 2 0 r m i n ，培养温度为2 8 ，培养大约1 0 天。从第培养第二天 开始，每天取两个样，发酵液离心l o m i n ( 3 5 0 0 r m i n ) ，上清液为粗酶液，对租酶液进行 酶活力测定，结果如图3 1 3 ，3 - 1 4 所示。 培养时间d 图3 1 3m 3 - 1 、x l - 1 发酵时间随培养时间的变化 由图可知，半纤维素酶在3 株菌在接种第二天后的整个过程都有产生。m 3 - 1 、m 3 - 2 的酶活在第9 天达到最大，分别为8 4 9 6 u m l - i 、3 3 2 7 6 5u m l 。x 1 1 则在第8 天达到 最大，为8 5 3 3 1u m l - 。 r 日 o 赡 溢 3 6 4 发酵周期确定 培养时间d 图3 1 4m 3 2 发酵时间随培养时间的变化 根据图3 - 1 0 、3 - 1 l 、3 - 1 2 结合微生物生长曲线及半纤维素酶活力随培养时间的变化 将3 株菌的发酵周期定为1 0 天。 3 7 酶的特征 3 7 1 酶的最适温度 关于温度对酶催化反应的影响问题，由于其复杂性，实际上至今还没有真正解决。但 无庸置疑，温度是影响酶解反应的重要因素之一。一般而言，温度主要影响酶的稳定性、 酶蛋自的热变性、酶和底物的结合，影响酶和抑制剂、激活剂或辅酶的结合，影响反应系 统内各种平衡。温度对酶促反应温度的影响有两个方面( 陈冠军。2 0 0 4 ) ：一方面是当温度 升高时，与一般化学反应一样，反应速度加快：另一方面，由于酶本身是蛋白质，随着温 度升高会逐步变性失活，从而降低酶的反应速度。酶反应的最适反应温度就是这两种过程 平衡的结果。所以酶解反应对温度有严格的限制，各种酶都有最适宜的生长温度及生长温 度的上限和下限。相对而言，酶对高温的敏感性比对低温的敏感性表现更为明显：随着温 度的升高。酶可能遭受不可逆破坏。此外我们还注意到，湿度不但影响反应动力学，而且 也影响热力学平衡因此，就某一酶催化反应面言，只有通过实验才能确定其最适温度。 木 ! i g 溢 贺 罂 温度 c 图3 1 53 株菌最适温度 由图3 1 5 实验结果可以看出，m 3 - 2 产生的酶最适温度为4 5 c ，m i - 1 产生的酶最适 温度为5 0 c ，x 1 1 产生的酶最适温度为为5 5 c 。 3 7 2 酶的最适p h 酶酸碱度对酶活力的影响是多方面的，诸如影响到酶的构象，从而影响到决定酶作用 专一性及活力的活性中心的性能；影响酶与底物分子的离子化程度问的亲和力。酶在不同 d h 条件下，将会以不同的解离状态存在，而往往只有一种解离状态最适合于其酶促进反应； 另外，p h 还会影响到酶的稳定性，极端p h 条件对酶 - f b l 起不可逆转的破坏等等。木聚糖 是一种复合酶，通常认为，木聚糖酶主要是由内切- 木聚糖酶( ( e n d o l ，4 - b d x y l 哪e ， e c 3 2 1 ，8 ) 和b - 木糖苷酶( e x o - 1 ，4 - b - x y l o s i d a s e ，e c 3 2 1 - 3 7 ) 组成( 付强善，2 0 0 4 ) ，其中 每一种酶的作用都存在一个最适p h 值。 木聚糖酶是一种复合酶，是由内切木聚糖酶和p 木糖苷酶组成，两者作用机理不同， 对p h 的要求也不同。p h 在4 5 5 正是内切一木聚糖酶较活跃的范围，内切- 木聚糖酶作用 机理是从木聚糖主链内部作用于糖苷键并采用一种随机的方式把主链切断为多个低聚木 糖，而b 木糖苷酶则是利用外切的方式作用于被分成多个的低聚木糖末端而形成单个木 糖。由于b 木糖苷酶在p h 3 0 4 0 的酶话力能达到最大值，这也使得低聚木糖的得率高 于木糖得率。 3456 7 89 p h 图3 1 6p h 对酶活的影响 以不同p h 值( 2 6 9 0 ) 缓冲液配制i 木聚糖底物。在3 株菌各自的最适温度条件 下检测粗酶液的半纤维素酶活力。结果如图3 - 1 6 所示，m 3 - 2 、m 3 1 产生的酶最适p h 值 均为5 、x 1 1 产生的酶最适p h 值为6 。 3 7 。3 酶的热稳定性 将酶液分别在不同温度下保温6 0 m i n ，每隔l o m i n 取一次样，以初始酶活作为1 0 0 ，测 定保温不同时间后的酶活。如果以8 0 的残存酶活为衡量指标的话。结果显示m 3 - 2 在5 5 1 2 以下比较稳定，m 3 1 在5 0 ( 2 以下稳定，而x i 1 在6 0 ( 2 以下稳定。 3 7 4 酶的p h 值稳定性 将各酶组分分别置于p h 2 6 9 0 的系列缓冲溶液中，4 c i 殳置2 4 h ，然后按常规方法测定 剩余酶活，以最高酶活力作为1 0 0 。如果以保存8 0 的残存活力作为稳定性判断标准的话， 实验结果显示m 3 2 、m 3 - 1 在在p h 3 “5 比较稳定，n x l 1 在p h 4 2 7 0 稳定。 3 7 5 小节 ( a ) m 3 - 2 产生的酶最适温度为4 5 ( 2 ，m 1 1 产生的酶最适温度为5 0 ，x i 1 产生的 酶最适温度为为5 5 ( 2 。在最适温度之前所有酶活均呈上升趋势，在最适温度之后，所有 酶活均急剧下降。 伯暑；阳们约 蜉硅靛罂 ( b ) m 3 2 、m 3 1 产生的酶最适p h 值均为5 、x i 一1 产生的酶最适p h 值为6 。 ( c ) m 3 - 2 在5 5 c 以下比较稳定，m 3 1 在5 0 1 2 以下稳定，而x i l 在6 0 以下稳定。 ( d ) m 3 2 、m 3 1 在在p h 3 6 - 6 5 比较稳定而x 1 - l 在p h 4 2 7 0 稳定。 3 8 微生物发酵处理木质素 3 8 1 生物处理木质素原理 生物转化在处理废弃物方面体现了远大的发展前景。应用半纤维素酶可将木质纤维性 材料生物转化为单细胞蛋白、乙醇或其他有用物质( 马金霞，2 0 0 0 ；陈嘉翔，1 9 9 0 。张陶 芸。1 9 9 8 ) 。木聚糖酶是半纤维素酶中的一种，也是半纤维素酶中的主要的种酶，它在食 品和饲料工业中有广阔的应用前景( 罗才典，1 9 8 9 ) 。目前，应用木聚糖酶最广、最成功的 领域是制浆造纸行业。 植物纤维原料中的木质素与半纤维素及纤维素之间存在复合体，草类原料中此复合体更 多。在制浆过程中，木质素被大量除去，残余木质素多以复合物形式存在( 卢今怡，1 9 8 9