（环境工程专业论文）柴油降解菌的筛选、降解条件优化及其降解机理研究.pdf

硕士学位论文 摘要 石油烃降解菌广泛存在于自然界中。影响石油污染物降解效果的因素很多， 如石油烃的种类和组成、物理状态、浓度、温度、p h 值、供氧及营养物质等。石 油烃的降解速率及晟终降解效果是上述各种因素综合作用的结果。 毒子石油烃的囱然降解过程缓慢，丽良污染环境中添加某些物质，优化降解 条件，往往能加速石油污染物的生物降解过程。已有研究表明，表面活性物质可 以促进石油烃的乳化，提高石淮烃在水中溶解度及生物可剥爝性。与化学合成的 表面活性剂相比，生物表面活性剂因其具有无毒、可生物降解、生态安全和高生 物活性等特征越来越受到人们的关注。现在已经成为水体污染治理的热点。 本课题首先从长沙市某炼油厂受石油烃污染的土壤中分离筛选出以0 4 柴油为 唯一碳源生长的9 株石油烃降解菌。并对菌株的降解能力进行了研究，确定降解 优势菌株。其中一株菌能在3 d 内能使柴油的降解率达到7 1 7 。经形态学特征和 生理生化特性鉴定，这株菌为假单胞菌属。 其次本文研究了培养时闽、p h 值、接种量、温度、柴淮浓度、n 源对菌株降 解率的影响，实验结果表明，该菌株在培养时间为6 d 、p h 值为5 0 、接种量为5 、 温度为3 5 、柴油浓度力1 0 0 0 m g l 、n 源为( n h 4 ) 2 s 0 4 的条件下生长旺盛，降解 率达到了8 0 。 此外本文还研究了如何从发酵液中提取表面活性剂，同时测定发酵液的表面 张力，证明该菌能够产生生物表面活性剂，对产表面活性剂的条件进行优化，使 表面活性剂达到最高产量。结果表明，假单胞菌在温度为3 0 、初始p h 为8 o 9 0 、转速为2 0 0 r m i n 、氮源为n h 4 n 0 3 的条件下培养2 d ，培养液的表面张力可由 6 9 m n m 降至3 1 4 m n m ，此时表面活性物质的产量达到了1 6 2 9 l 。将该菌产生 酶生物表瑟活性剂耀予柴、漓降解实验，7 2 h 柴油去除率达到了8 5 。7 ，眈不加表 面活性剂的效果好。从降解前后柴油g c m s 图谱分析表明，该菌主要将c 1 7 c 2 9 之阗的直链烃昶少量支链烃降解成c l 毒- c l s 的短链烃。这为该菌株及其含成的表面 活性物质应用于柴油污染土壤和水体的生物修复提供了有力的依据。 关键词：柴油降解荫；筛选；降解率；生长鼙；生物表面活性剂；表面张力 珏 柴油降解茵的筛选、降解条件优化及其降解机理研究 a b s t r a c t t h e r ea r em a n yo i ld e g r a d i n gs t r a i n si nt h en a t u r e t h ed e g r a d a t i o no ft h e p e t r o l e u mh y d r o c a r b o n s i si n f l u e n c e db ym a n y f a c t o r s ，s u c ha st h es o r ta n d c o m p o s i t i o no fp e t r o l e u mh y d r o c a r b o n s ，t h ep h y s i c a ls t a t e ，t h ec o n c e n t r a t i o n ， t e m p e r a t u r e ，p h ，o x y g e ns u p p l y ，n u t r i e n t s ，e ta 1 t h ed e g r a d es p e e do fp e t r o l e u m h y d r o c a r b o n sa n dt h ef i n a le f f e c ti st h ei n t e r a c t i o n a lr e s u l to fa l lt h ef a c t o r s b e c a u s et h en a t u r a ld e g r a d a t i o nr a t i oo fp e t r o l e u mh y d r o c a r b o n si ss l o w ， a d d i n gs o m em a t e r i a l st ot h ep o l l u t e de n v i r o n m e n t ，a n do p t i m i z i n gt h ed e g r a d a t i o n c o n d i t i o nc a no f t e na c c e l e r a t et h eb i o d e g r a d a t i o no ft h ep e t r o l e u mp o l l u t a n t s o m e r e s e a r c h e sh a v ei n d i c a t e dt h a ts u r f a c e - a c t i v e c o m p o u n d s c a n p r o m o t e t h e e m u l s i f i c a t i o no ft h ep e t r o l e u mh y d r o c a r b o n s ，i n c r e a s et h es o l u b i l i t ya n dt h e b i o a v a i l a b i l i t yo ft h ep e t r o l e u mh y d r o c a r b o n si n t h ew a t e r c o m p a r e dw i t ht h e c h e m i c a ls u r f a c t a n t s ，b i o s u r f a c t a n t sa r ea t t e n t i o n e db ym o r ea n dm o r ep e o p l eb e c a u s e o ft h e i rn o n t o x i c ，b i o d e g r a d a b i l i t y ，m i l d n e s st ot h ee n v i r o n m e n t ，h i g hb i o a c t i v i t ya n d s oo n a tp r e s e n t ，i ti sb e c o m i n gt h eh o to fw a t e rp o l l u t i o nc o n t r 0 1 o u rr e s e a r c hw a s f o c u so nt h ef o l l o w i n ga s p e c t sa n dr e c e i v e ds e v e r a lr e s u l t s ： f i r s t l y ，n i n ed i e s e lo i ld e g r a d a b l es t r a i n sw e r eo b t a i n e df r o mo i l - c o n t a m i n a t e d s o i lb yu s i n gs c r e e n i n gc u l t u r a lm e d i u mm e t h o dw h i c hu s i n g0 4d i e s e lo i la st h es o l e c a r b o ns o u r c e t h ed e g r a d a t i o nr a t i oo fd i e s e lo i lb yt h es t r a i n sw a st e s t e db yu s i n g u l t r a v i o l e ts p e c t r o m e t r ym e t h o d o n eo ft h es t r a i n ss h o w e dp o t e n t i a lf o rf u r t h e r u t i l i z a t i o nw i t had e g r a d a t i o nr a t i oo fd i e s e lo i lb y71 7 i n c u b a t i n gf o r3d a y s b a s e d o nt h em o r p h o l o g i c a l ，p h y s i o l o g i c a la n db io c h e m i c a lt e s tr e s u l t s ，t h es t r a i nw a s i d e n t i f i e da sp s e u d o m o n a ss p s e c o n d l y ，s i xf a c t o r st h a ta f f e c tt h es t r a i ng r o w t ha n dt h ed e g r a d a t i o nr a t i ot o d i e s e lo i l ，s u c ha sp hv a l u eo ft h ec u l t u r em e d i u m ，t e m p e r a t u r e ，i n o c u l a t i o na m o u n t ， n s o u r c e ，i n i t i a ld i e s e lo i lc o n c e n t r a t i o na n di n c u b a t i o nt i m e ，w e r ea l s os t u d i e di nt h e p r o p o s e dp a p e r t h er e s u l t s h o w e dt h a tt h e o p t i m u m c u l t u r ec o n d i t i o nf o r p s e u d o m o n a ss p s t r a i nw a sp h 5 0 ，i n o c u l a t i o nb y5 ，( n h 4 ) z s 0 4a st h ens o u r c ei n t h ec u l t u r em e d i u ma n di n c u b a t i o nu n d e r30 c w h e nt h ep r o p o s e ds t r a i ng r o w su n d e r t h i sc o n d i t i o n 8 0 o ft h ed i e s e lo i lc o u l db ed e g r a d e dw i t ha ni n i t i a lc o n c e n t r a t i o no f l0 0 0 m g la n di n c u b a t i n gf o r6 d f u r t h e r m o r e ，t h i sp a p e ra l s os t u d i e dt h ee x t r a c to fb i o s u r f a c t a n tf r o mb r o t h t h e p s e u d o m o n a sw a sc a p a b l eo fp r o d u c i n gg l y c o l i p i d sb i o s u r f a c t a n tb yas e r i e so ft e s t s 1 1 l n c i u d l n gs u r f a c e t e n s i o nd e t e r m i n a t i o n ，t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h ya s s a ye t c , a n d c o u l dr e d u c et h es u r f a c et e n s i o no ff e r m e n t a t i o ns o l u t i o n t h e a n a l y s i so fd i f f e r e n t c u j t u r ec o n d i t i o n si n d i c a t e dt h a tt h eb i o s u r f a c t a n tp r o d u c e d b yp s e u d o m o n a sw a sa b l e t or e d u c et h es u r f a c et e n s i o no ff e r m e n t a t i o ns o l u t i o n f r o m6 9 r a n mt o31 4 m n m w n e nl n c u b a t l n gf o rt w od a y si nc o n d i t i o n st h a tt h e t e m p e r a t u r ew a s3 0 0 ，t h ei n i t i a l p hw a s8 o 9 0 t h es h a k i n gs p e e dw a s2 0 0 r m i n ，t h en i t r o g e ns o u r c ew a s n h 4 n 0 3 a tt h e s a m et i m e , t h e o u t p u to fb i o s u r f a c t a n t w a s 1 6 2 9 l e m p l o y i n gt h e b i o s u r f a c t a n tt od e g r a d ed i e s e lo i l ，8 5 7 o ft h ed i e s e l o i lw a sr e m o v e da r e r7 2 h i t h a dg o o d e f f e c t u s i n gt h et e c h n i q u e so fg c m s ，t h ee f f e c to f b i o s u r f a c t a n t o n d e g r a d i n gt h ec o m p o s i t i o no fd i e s e lo i lw a sa n a l y z e d t h er e s u i t s s h o w e di tc o u l d d e g r a d ec 1 7 - c 2 9s t r a i g h tc h a i na l k a n e sa n ds o m eb r a n c h e d o n e sj i l t 0c 1 4 - c i ss h o r t c h a l na l k a n e s t h i sp a p e rw i l lp r o v i d es t r o n gb a s i sf o rt h e s t r a i na n di t sb i o s u r f a c t a n t s k e yw 。r d s ：d i e s e l 。i ld e g r a d a t i o nb a c t e r i a ；s c r e e n i n g ；d e g r a d a t j 。n r a t i 。；g r o w m ： b i o s u r f a c t a n t ；s u r f a c et e n s i o n i v 湖南大学 学位论文原刨性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立迸孳亍研究所取得的 研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标嚷。本人完全意识到本声嚷的法律后果由本人承担。 作者签名： 祓爹缓 爨期：力- 瑶年 2 月争星 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关镰整、使用学位论文的规定，躁意学校保 留并向国家有关部f 毒或机构送交论文的复印件和电予版，允许论文被查阅和借 阕。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据瘴进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 量、保密墨，在年熊密籍适用本授权书。 2 、不保密豳。 ( 请在以上相应方框内打“、”) 律者签名：习心冬凝 嚣期：渊年胁月擎虽 导师签名： 书1 、彰沙 翻期：立勰年；2 周年盛 硕士学位论文 1 1 石油污染物的概述 第1 章绪论 1 1 1 石油的概念 石油是原油和石油制品的总称，是地质变迁而形成的天然有机物质的积累。 其中从地下开采的天然烃称为原油，它是黑褐色的粘稠液体，主要成分包括链烷 烃、环烷烃、芳香烃和少量非烃化合物的复杂混合物，其化学组成及物理性质随 产地不同而异【。一般将原油按其特征分为三类：富石蜡原油、富环烷烃原油和 混合原油。在日本，也将原油按含硫量来进行分类，将含硫量2 以上的原油称为 高硫原油，含硫量为1 2 的原油称为中硫原油，含硫量为1 以下的原油称为低 硫原油1 2j 。 原油经过提炼可生产成各种燃料、溶剂、润滑油、沥青等各种石油制品。石 油制品按照沸点范围、用途可以分为四大类：轻质油( 汽车使用的汽油属轻质油， 主要由碳数为4 - 1 0 的烃组成) 、中质油( 柴油则属中质油，由碳数为1 0 2 0 的烃组 成) 、重质油和固体石油制品( 铺马路使用的沥青属固态石油制品) 。 石油是人类最主要的能源之一，有现代工业血液之称【3 1 ，全世界大规模开采 石油是从2 0 世纪初开始的，1 9 0 0 年全世界消费量约2 0 0 0 万吨，1 0 0 年来，这一数量 已增长百余倍，现在每年世界石油的总产量近3 0 多亿吨【4 l 。 1 1 2 石油的组成 1 石油的组分组成 石油化合物的不同组分对有机溶剂和吸附具有选择性溶解和吸附性能，选用 不同有机溶剂和吸附剂，将石油分成若干部分，每一部分就是个组分，分别为 油质、胶质、沥青质和碳质1 。 油质：是指石油中凡能溶解于中性有机溶剂，不被硅胶吸附，浅黄色粘性油 状物。成份主要为饱和烃和一部分芳香烃。 胶质：是指石油中可溶于石油醚、苯、三氯甲烷等有机溶剂，能被硅胶所吸 附。可分为苯胶质( 用苯解吸的产物) 和酒精一苯胶质。前者多为芳香烃和一些含 有杂原子( 氧、硫、氮) 的芳香烃化合物，后者主要为含杂原子的非烃化合物。轻 质油中胶质含量少于5 ，重质油中胶质含量可达2 0 以上。 沥青质：是指石油中不溶于石油醚和酒清，而溶于苯、三氯甲烷的沥青部分。 其分子量较大，在电子显微镜下，其宏观结构呈胶状颗粒，其分子结构以稠环芳 柴油降解菌的筛选、降解条件优化及其降解机理研究 香烃和烷基侧链组成的复杂结构。 碳质：是指石油中不溶于有机溶剂的非烃化合物。 2 石油的化合物组成 石油中含有数百种化合物，主要由正构烷烃、异构烷烃、环烷烃、芳烃和非 烃化合物及沥青质组成。 ( 1 ) 正构烷烃 属饱和烃，在常温常压下，l 4 个碳原子( c l c 4 ) 的烷烃为气态，5 - 1 6 个碳原 子( c 5 c 1 6 ) 的烷烃为液态，1 7 个碳原子以上( c r l + ) 的高分子烷烃皆呈固态。石油 中己鉴定出的正烷烃有c c 4 5 ，个别报导曾提及见n c 6 0 正烷烃，但大部分正烷烃 碳数是c 3 5 。正构烷烃在石油中多数占l5 5 ( 体积) ，轻质石油可达3 0 以上，而重 质石油可小于1 5 ，其含量主要取决于生成石油的原始有机质的类型( 陆相原油含 量多，海相原油含量少) 和原油的成熟度( 未成熟的石油主要含大分子量的正构烷 烃：成熟的石油中主要含中分子量的正构烷烃；降解的石油中主要含中、小分子量 的正构烷烃) 。 ( 2 ) 异构烷烃 石油中的异构烷烃以c l o 为主，且以异戊间三烯烷烃最重要。其特点是在直链 上每4 个碳原子有一个甲基支链。在沉积物和原油中以植烷、姥鲛烷、降姥鲛烷、 异十六烷及法呢烷的含量最高。研究和应用最多的是植烷和姥鲛烷。 ( 3 ) 环烷烃 由许多围成环的多个次甲基( c h 2 ) 组成。组成环的碳原子数可以是大于3 的 任何数，相应称为三员环、四员环、五员环等。石油中的环烷烃多为五员环或六 员环。其含量与成熟度有关；成熟度低的石油中主要含多环烷烃，成熟度高的石 油中主要含单或双环烷烃。一般，单、双环占环烷烃的5 0 5 ：三环占环烷烃的2 0 ； 四、五环占环烷烃的2 5 。 ( 4 ) 芳香烃： 芳香烃其特征是分子中含有苯环结构，属不饱和烃。根据其结构不同可分为 单环、多环、稠环三类芳香烃。单环芳烃是指分子中含有一个苯环的芳香烃，包 括苯及其同系物：多环芳烃是指分子中含两个或多个独立苯环的芳香烃；稠环芳 香烃是指分子中含两个或多个苯环，彼此之间共用两个相邻碳原子稠合而成的芳 香烃。在石油的低沸点馏分中，芳香烃含量较少，且多为单环芳香烃，如苯、甲 苯和二甲苯。随沸点升高，芳香烃含量亦增多，除单环芳香烃外，出现双环芳香 烃，如联苯。在重质馏分中还可能出现稠环芳香烃，如萘和菲，蒽的含量较少。 ( 5 ) 非烃化合物 石油中的非烃化合物主要是含硫、氮、氧三种元素的有机化合物，主要集中 在石油的高沸点馏分中。 硕士学位论文 含硫化合物：是最重要的非烃化合物，存在于中、重馏分中。主要有硫醇( s h ) 、 硫化物( s ) ( 包括硫醚r s - r 、环硫醚) 、二硫化物( s s ) 以及衍生噻吩衍生物。此 外，还有元素硫、硫化氢。 含氮化合物：主要集中在胶质一沥青质中。石油中含氧化合物可分为碱性和 中性两大类。碱性含氮化合物主要是吡咯、吲哚、咔唑的同系物及酰胺等。原油 中含有具有重要意义的中性含氮化合物，即卟啉化合物，它是石油有机成因的重 要生物标志物。 含氧化合物：主要有酸性和中性两大类。酸性含氧化合物中有环烷酸、脂肪 酸及酚，总称石油酸；中性含氧化合物有醛、酮等，其含量较少。 1 2 石油烃污染土壤的概述 1 2 1 石油烃污染土壤的现状 石油己成为人类最主要的能源之一，随着石油产品需求量增加，大量的石油 及其加工品进入土壤，给生物和人类带来危害，造成土壤的石油污染日趋严重， 这己成了世界性的环境问题。石油对土壤的污染多集中于2 0 c m 左右的表层，粘着 力强且乳化能力低【6 l 。土壤的污染程度直接影响到农作物的生长。石油类物质进 入土壤后，改变了土壤有机质的组成和结构，从而影响了土壤微生物的生长繁殖， 引起土壤微生物群落、微生物区系的变化，大量的石油不仅堵塞土壤孔隙，对土 壤微生物也有抑制作用。 石油经过土壤生态系统的一系列作用后，其某些成分在作物各部分中形成积 累，从而影响粮食质量，并进入食物链，进而危及人类健康。 美国环保署报道，在2 0 世纪9 0 年代己有l0 万个地下油罐存在不同程度的泄漏 【7 ，引，并预测几年后，这个数字可能增至3 倍。目前，我国石油企业每年产生落地 油约7 0 万吨，各油田每作业一次遗留于井场的落地油为几十到几百公斤，一些油 田井口周围5 m x 5 m 范围为最大污染区，地面呈黑色，5 0 m 3 0 m 范围为严重污染区， 有原油、油泥散落、遗留井场的钻井泥浆池和作业泥浆池，一般井场周围污染范 围在10 0 0 2 0 0 0 m 2 之间，经雨水冲刷还会导致污染范围不断扩大，地面溢油一方 面下渗污染环境土壤及地下水，一方面被雨水携带污染地表水体，对环境影响严 重【9 1 。 据联合国环境规划署报告，流入海洋的石油每年为2 0 0 万吨至2 0 0 0 万吨，以至 在主要的航道上有明显的油膜分布。大西洋及所属海域主航道承担了大量石油及 其产品的运输任务，也是石油污染物最为集中的地方，在公海也聚集着大量石油 污染物。太平洋属于污染较轻的，但日本周围、我国东海、南海及北海沿岸海面 上也常被石油薄膜充斥。 柴油降解菌的筛选、降解条件优化及其降解机理研究 石油泄漏渗入土壤的量超过土壤的自净容量后，积累的油类物质将长期残留 于其中，破坏土壤结构，影响土壤通透性，损害植物根部，阻碍根的呼吸与吸收， 最终导致植物死亡，甚至地下水都产生危害，严重影响土壤生产力和农作物产量。 其次，污染物进入食物链造成人体损伤【l0 1 。大量的石油污染物进入环境，不仅破 坏生态平衡，制约了经济的发展，而且影响到人类的健康和生存【l 。鉴于土壤污 染的严重危害，治理石油污染势在必行，己引起许多发达国家高度重视，不断采 取措施，治理石油污染。荷兰在8 0 年代已花费了约l5 亿美元进行土壤的恢复工作， 德国在1 9 9 5 年投资约6 0 亿美元用于净化土壤，美国9 0 年代准备在土壤恢复方面的 投资约有数百亿到上千亿美元【1 2 l 。 1 2 2 石油烃污染土壤的产生途径 随着经济和社会的迅速发展，石油及其制品被广泛地应用于国民经济的各个 领域和人类的日常生活中，而且使用量与日俱增，在石油产量激增的同时，石油 在开发、储存、运输、加工和应用过程中的泄露和排放对环境的污染也日趋严重。 土壤石油污染的来源主要有以下5 个方面【l 引。 ( 1 ) 污水灌溉 引用被石油烃污染的水源进行农灌是石油污染土壤的主要原因。含油废水的 原油以乳化形态分散在水中，含油浓度可高达7 0 0 0 m g l 【1 4 l 。有试验表明，随着污 灌时间的延续，土壤矿物油的含量增高，而含油污水中的矿物油主要来自石油开 采、运输和炼油等加工部门。 ( 2 ) 石油生产作业中的排洒 在我国的矿业生产过程中，还存在一些不合理的作业方式，在采油井洗井和 检修时，都会有大量的原油洒落在油井周围，造成了严重的环境污染和生态破坏。 此外，在石油的生产过程中，偶尔会发生不同类型的油井事故，由此引起的突发 性石油泄漏往往会造成数量多、浓度高、危害大的局部污染，石油浓度大超过土 壤颗粒能够吸附的量，过多的石油存在于土壤空隙中，使小范围内的生态系统完 全毁灭。 ( 3 ) 含油固体废弃物的污染 这类物质主要包括含油岩屑、含油泥浆等。它们的特点是在进入地表土壤前 就己经被固体物质吸附或夹带。进入土壤后，它们的污染方式是含油固体物质与 土壤颗粒的掺混。污染的范围和严重程度主要取决于含油固体的扩散特征。 ( 4 ) 溢油事故 石油及其产品在运输、使用、贮存过程中的渗漏，溢油现象时有发生，甚至 在原油开采过程中发生井喷事故，造成大量石油烃类物质直接进入土壤，由此引 起的突发性泄漏往往造成数量多、浓度高、危害大的局部污染，将小范围内的生 4 硕士学位论文 态系统完全毁灭。 ( 5 ) 车辆污染及其它污染途径 汽车尾气或含油的各种矿物油成分，尤其是多环芳烃，可以使车辆繁多的公 路两侧的土壤受到相当于或超过污灌、大气污染造成的矿物油污染。 1 2 3 石油烃污染土壤的危害 由于石油特殊的物理化学性质，在它进入土壤后难以去除，残留时间长，使 土壤中的碳源大量增加，直接导致土壤中c ：n 比失调以及酸碱度的变化，破坏了 土壤结构，给受污染土壤带来一系列的危害，对污染地区的生态、作物以及人类 健康造成诸多负面影响【l ”。具体体现在以下五个方面： 1 石油的密度小，粘着力强且乳化能力低，因此在土壤中容易与土粒粘连， 影响土壤的通透性，降低土壤质量。 2 石油会附着在植物的根表面，形成粘膜，阻碍根系的呼吸与吸收，引起根 系腐烂，影响作物的根系生长。 3 石油中富含反应基，能与无机氮、磷结合并限制硝化作用和脱磷酸作用， 从而使土壤有效氮、磷含量减少，影响作物的吸收。 4 石油烃中不易被土壤吸附的污染物成分可以随地面降水渗透到地下水，污 染浅层地下水环境，影响饮用水的质量。 5 石油中所含的多环芳烃具有致癌、致突变、致畸变等作用，它们能通过食 物链在动植物体内逐级富集，危及人类健康。 1 3 石油烃污染土壤的微生物修复 1 3 1 生物修复技术的发展 随着人们对环境污染认识越来越深，对环境治理的力度越来越大，世界上对 石油烃污染的处理技术主要有三种：( 1 ) 物理处理方法；( 2 ) 化学处理方法；( 3 ) 生物 处理方法。自1 9 8 9 年a l a s k a 发生原油泄漏事故后，人们对石油烃污染的生物修复 进行了大量的研究【l 引。目前大家都认为微生物降解石油烃是最好、最经济、最彻 底的方法。因此，研究石油烃污染的生物处理有非常重要的应用和理论价值。 生物修复指利用生物特别是微生物来催化降解环境污染物，减小或最终消除 环境污染的受控或自发过程，是在微生物降解基础上发展起来的新兴的环保技术 1 1 7 l 。欧洲各发达国家自2 0 世纪8 0 年代中期就对微生物处理技术进行初步研究，迄 今为止，研究领域延伸至包括石油、农药、固体废弃物等对土壤、地下水及海洋 污染的治理。国外在开展微生物治理石油污染较早，最早的是美国海洋微生物学 家z o b e l l 于1 9 6 4 年用原油和润滑油浓度为1 0 9 1 0 0 c m 3 进行海洋细菌降解石油烃速 率的研究。l9 7 2 年的d e r o o 和w e h n e r l l 8 l ，19 7 7 年的m i l n e r l l9 1 ，l9 7 9 年的s e i f e r t 和 柴油籍聪整兹薅透、瓣瓣条锌傀纯及荬洚翳戳瑷研究 m o i d w a n l 2 引，1 9 8 7 年的m a h l o nc ，k e n i c u t t ，i i 2 ，1 9 8 9 年的s c h e r r e r 和m i l l e l 22 1 ，1 9 9 0 年d k p o k w a s i l i 和d d o k u m a l 2 引，和1 9 9 0 年的p e t e r s 和m o l d o m a n 等等都进行了相关 的研究。 我国对石油烃污染的微生物降解研究的较晚，餐我国的石油烃污染却相当严 重。据统计，我国的各大油田如大庆油田、胜利油田在钻井、采油、原油运输和 原油炼制加王等环节均产生地面溢油霹含油凌水，丽地萄溢溜下渗又污染土壤耧 地下水。目前石油污染特别严重，已到了非治理不可的地步了。现在国内有不少 单饿开展了石油烃微生物降解的研究，也取得了一些成果。鬻志洲1 2 4 , 2 5 l ，陈碧娥 1 2 6 , 2 7 l ，丁克强1 2 引，龚利萍f 2 引，巩宗强f 3 叭，姜昌亮3 ，谢明杰p 2 1 ，林风翱f 3 3 1 等都 在石油烃污染土壤的微生物修复开展了大量工作。 微生物修复技术按照修复地点分为原位生物修复技术和异位生物修复技术 1 3 4 1a 1 。原饿生物修复技术 原位处理方法是将受污染土壤在原地处理。处理期间，土壤基本不被搅动， 最常见的就地处理方式是土壤的水饱移区进行生物降解。除了要加入营养盐，氧 源( 多为h 2 0 2 ) 外；还需引入微生物以提高生物降解的能力。有时，在污染区挖一 组并，并直接注入逶当的溶液，这糕就可以恕水中的微生物孳| 入到土壤中。地下 水经过一些处理后，可以恢复和再循环使用，在地下水循环使用前，还可以加入 土壤改良剂。e l l i s 等在斯德歌尔摩中部的一个废弃的木材防腐、漓生产区，对赢浓 度低分子量多环芳烃和高分子量的多环芳烃污染进行就地处理。在0 9 4 5 m 的深 度范围内，土壤中防腐油的总浓度为1 0 - 3 2 0 0 m g k g 。在污染区设置一些井，往井 中注入含有营养盐的磷酸氢钾。氧源( 质量分数3 5 的h 2 0 2 ，1 0 0 m g l ) 和表面活化 剂的溶液，并接种能促进多环芳烃降解的微生物，对污染区进行处理【35 1 。污染土 壤经过4 个月处理，所有多环芳烃的降解都很明显，但是，三环和多环芳烃的降解 率般明显低于6 0 。因为就地处理对温度较敏感，所以只能在气温大于8 的月 份进行。在一定的时间蠹，原位处理不可能有效地去除大多数多环芳烃，而嚣这 种方法因受温度和土壤类型的影响而具有一定的局限性。 2 。异健生物修复技术 异位生物修复主要包括现场处理法、预制床法、堆制处理法、生物反应器和 厌氧生物处理法。 ( 1 ) 现场处理法 近年来国外石油烃污染生物处理的研究很多，其中土壤耕作处理是现场处理 壤污染常用的方法。被污染的废物施在圾上，通过麓肥、灌溉和加石灰等管 理措施，保持氧气、水分矛t l p h 的最合适值，并进行耕作以改善土壤的通气状况， 确保在污染废物和下面土层中污染物赫降解。降解过程所鬟的微生物多为士著微 6 硕士学位论文 生物，但是要提高效果还需要引入驯化的微生物。 m u e l l e r 等对弗罗里达卅i p e n s a c o l a 木材防腐油生产区的土壤进行现场处理，并 测定了2 1 种多环芳烃的降解率。结果表明，各类有机物的降解顺序为：酚醛类 杂环烃 低分子量多环芳烃 高分子量多环芳烃。1 2 周以后，表土低分子量的多环 芳烃的平均降解率大于5 0 ，而高分子量多环芳烃的降解率很低。同一时间内， 底土的多环芳烃仍然保持较高的浓度。 ( 2 ) 预制床法 现场处理中土壤耕作处理最大的缺陷是污染物可能从处理区迁移，预制床的 设计可以使污染物的迁移量减至最小，因为它具有滤液收集和控带f j 4 1 放系统。预 制床的底面为渗透性低的物质，如高密度的聚乙烯或粘土。将污染土壤转移到预 制床上，通过施肥、灌溉，调节p h ，有时还加入微生物和表面活性剂，使其最适 合污染物的降解。 e l l i s f 3 6 1 等用具有滤液收集和水循环系统的预制床对斯德歌尔摩中部防腐油 生产区的土壤进行治理，土壤中多环芳烃的浓度从1 0 2 4 4 m g k g 降至3 2 4 1 m g l k g 。 虽然多环芳烃的浓度显著降低，但是高分子量多环芳烃的降解率很低。与同一区 域的原位处理技术相比，预制床处理对三环和三环以上的多环芳烃的降解率明显 提高。 ( 3 ) 堆制处理法 土壤的堆制处理就是将受污染的土壤从污染地区挖掘起来，防止污染物向地 下水或更大的地域扩散，运输到一个经过处理的地点( 布置防止渗漏底，通风管道 等) 堆放，形成上升的斜坡，并进行生物处理。堆制法是生物修复技术中的一种新 型替代技术。姜昌亮等采用异位生物修复技术长料堆式堆制处理法，对辽河油田4 种不同类型的石油污染土壤进行了生物处理示范研究，结果表明实用规模的长料 堆制处理工程对油田稀油、稠油和高凝油石油污染土壤的处理效果很理想。该处 理工程自然通风可满足远行要求，因此可大大节省能源投资，对大规模污染土壤 处理来说，该技术是一种简单易行、便于推广的污染土壤清洁技术。 张文娟等1 3 7 l 用实验模拟方法，研究堆制处理过程对污染土壤中的多环芳烃降 解，结果表明堆制对6 种难降解的多环芳烃都有不同程度的降解作用，多环芳烃的 降解随着苯环数的增加而降低，当多环芳烃的初始浓度提高约5 0 倍时，除荧、蒽 外，其他多环芳烃的降解随着污染浓度的提高而降低。 ( 4 ) 生物反应器法 生物反应器法是将污染土壤置于一专门的反应器中处理。生物反应器一般建 在现场或特定的处理区，通常为卧鼓形和升降机形，有间隙式和连续式两种。因 为反应器可使土壤与微生物及其他添加物如营养盐，表面活性剂等彻底混合，能 很好的控制降解条件，因而处理速度快，效果好。生物反应器处理的过程为：先 7 紫涵簿孵薷豹薅选、洚聪条 孛优纯及其降繇梳毽研究 挖擞土壤与水混合为泥浆，然后转入反应器。为了提高降解速率，常在反应器先 前处理的十壤中分离出己被驯化的微生物，并将其加入到准备处理的土壤中。 巩宗强等通过小型泥浆反应器的运行，确定了生物泥浆法修复多环芳烃污染 土壤的温度、水土比和通气爨参数。不同水土比对菲和芘的降解影响差别不大， 因此利用生物泥浆反应器进行多环劳烃污染土壤的修复可以采用2 0 ：l 的水土比， 这样既可节约用水，又能保证运行期内壤不至于结块，也可以充分地利用泥浆 反应器的空间，增加单位体积反应器处理土壤的量。温度是影响生物修复的个 重要因子，适宜的澄度是徽生物生长的必要条件。实验结果表翡，在刹焉微生物 泥浆反应器进行污染土壤的生物修复时，控制温度为2 0 - 2 5 比较合适，此温度 与c a s t l d i t 3 8 l 在研究利用生物泥浆反应器处理石油烃污染的淤泥时采用的温度基 本一致。 ( 5 ) 厌氧生物修复法 修复受石油烃污染土壤的研究己开发了生物堆层、堆肥及土壤泥浆反应器等 好氧修复工艺，但分离获得某些降解菌时，些降解菌伴有产生高生态风险的产 物。最近懿研究表明以厌氧还原脱氯为特征的厌氧微生物修复技术有搬大的潜力。 徐向阳等研究了士壤泥浆反应器在投加厌氧颗粒污泥条件下修复芳香烃污染 土壤的性能。结采表明，对浓度为3 0m g k g 模拟污染卡壤，其土壤泥浆中著性 厌氧微生物对五氯酚( p c p ) 具有一定的还原脱氯降解活性，2 8 d 平均p c p 的降解速 率为0 。2 5 8m g k g 。壤泥浆反应器在厌氧操作条彳牛下对p c p 降解速率大于好氧条 件，而且p c p 降解速率随颗粒污泥投加量的增加而增大。 l 。3 。2 石油烃污染土壤治理的现状 土壤中存在着大量依靠有机物生活的微生物，如细菌、真菌、放线菌等，具 有氧化分解有祝物的巨大能力。在受到石油烃污染詹，一些微生物在污染物的诱 导下产生分解污染物的酶系，可将污染物降解转化。由于土壤中的微生物种类繁 多，各种有机污染物在不同条件下的分解形式是多种多样的，主要有氧化还原反 应、水解、羟基化和异构化、环破裂等过程，并最终转变为对生物无毒性的残留 物和c 0 2 ，这与土壤中微生物的种群、数量、活性，以及土壤水分、土壤温度、土 壤通气性、p h 僵、适宜的c n 比等因素有关。为了强化生物降解作用，常采用增 加碳源、通气或引入优势微生物种群等措施，促进污染物的生物降解。当处理包 括多种污染物( 翔直链烃、环烃和芳香烃等) 的污染时，单一微生物通常不会有太 大的效果。试验表明很少有单一微生物具有降解多种污染物的能力。降解石油烃 类化合物的能力依赖于微生物群落的种属组成。 另外化合物的生物降解通常是分多步进行的，在这个过程中包括了多种酶和 多种微生物。土著微生物虽然在壤中广泛地存在，但其生长速度较慢，代澍活 硕士学位论文 性不高，或者由于污染物的存在造成土著微生物的数量下降，使降解污染物的能 力降低，因此在污染物的实际处理过程中，需要考虑在污染土壤中接种多种降解 污染物的高效菌，或者激发当地多样的土著微生物。接种外来微生物时，会受到 土著微生物的竞争，因此，需接种大量的微生物形成优势，才能起到催化作用， 才能加快生物修复的速度。 在生物修复技术中，微生物起着不可替代的动力作用。利用微生物对有机污 染物的降解作用，可以使污染物在其初始环境中降解。同物理、化学处理方法相 比，基于微生物的生物处理技术更具有下列优点：污染物在原地被降解清除， 避免了运输过程中的污染；处理时间较短；操作简便，对周围环境干扰少； 较少的修复经费，仅为传统的化学物理方法的3 0 5 0 ；人类直接暴露在这 些污染物下的机会较少；不产生二次污染，遗留问题少，微生物处理的最终产 物为c 0 2 、水和脂肪酸，对人类无害。 由于微生物治理技术费用低、对环境影响小、适用范围广等优点，因此在环 境科学界，微生物处理技术被认为比物理和化学处理方法更具发展前途，它在土 壤修复中的应用价值是不可估量的。欧洲各发达国家自2 0 世纪8 0 年代中期就对微 生物处理技术进行初步研究，迄今为止，研究领域延伸至包括烃类、农药、固体 废弃物等对土壤、地下水及海洋污染的治理。目前德国、丹麦和荷兰在这方面的 研究工作处于领先地位，英国、法国、意大利等一些欧洲国家也紧随其后，整个 欧洲从事微生物修复工程技术研究机构和商业公司有近l o o 个。 这一技术在北美的发展基本与欧洲同步。在美国，国家环保局、能源部、国 防部及一些大公司、大学、各环境研究机构和一些环境工程公司对这一技术的基 础理论和应用工艺正进行一些详细的小试和中试研究，并有一些成功应用的例子。 由于这种新兴的环境微生物技术近来受到环境科学界的广泛关注，1 9 8 9 年美国权 威文摘刊p o l l u t i o na b s t r a c t ) ) 将“b i o r e m e d i a t i o n ”列为主题关键词。其中文意义 即“生物修复”，是采用工程化方法，利用微生物将土壤、地下水和海洋中的有毒 有害有机物降解成c 0 2 和水或转化成无害物质的方法。生物修复与生物处理是一 致的，或者说生物修复只是工程意义上的概念，就两者区别来说，狭隘的生物修 复是指就地或原位生物处理。美国环保局还曾制订了2 0 世纪9 0 年代土壤和地下水 的生物修复计划，并组织了一个由联邦政府、学术和实业界人员组成的“生物修复 行动委员会( b i o r e m e d i a t i o na c t i o nc o m m i t t e e ) ”来负责生物修复技术的研究和应 用实施。 随着我国石油工业的发展，受石油污染的土地面积不断扩大，污染程度也日 趋严重。油田附近被石油污染的土壤5 0 年可降至安全水平( 石油污染物的质量分数 为0 0 3 ) ，但在国民经济迅速发展的今天，如此长的时间是难以接受的。基于环 保要求和我国人多地少、可耕地目益减少的客观现实，对石油污染土壤进行治理， 柴油降解菌的筛选、降解条件优化及其降解机理研究 使其在较短的时间内达到可耕作的标准，对于发展国民经济尤其是农业生产具有 非常重要的意义。费用较高的物理和化学方法显然具有很大的局限性，但低费用 的生物治理技术为这一问题的解决提供了可能，实践表明，它具有很强的工业可 行性，如能成功地用于处理我国油田石油污染的土壤，必将产生巨大的社会效益 和经济效益。 1 3 3 降解石油烃类化合物的微生物种类 能降解烃的微生物非常多，有7 0 个属( 其中细菌2 8 个属，真菌3 0 个属) ，2 0 0 多 个种【3 9 1 。它们的细胞均含有改变了的脂肪酸组分和较多的核搪体，并常将烃类累 积在细胞质膜上，它们也