（应用化学专业论文）荧光量子点修饰灯塔探针的研究.pdf

量子点修饰灯塔探针的研究 摘要 本论文主要探索一种新型的发卡型荧光分子灯塔探针，即碲化镉( c d t c ) 量 子点与淬灭剂( d a b c y l 等) 通过单链d n a 相连接。由于c d t e 量子点的荧光 发射光谱与淬灭剂的吸收光谱相重叠，可以作为供受体对发生荧光共振能量转移 作用( f l t e t ) 。由于d n a 在杂交前后的形态变化促使供受体之间的距离产生变 化，从而导致探针的荧光强度改变，因此可用于d n a 序列或特定靶d n a 的检 测。 在以巯基乙酸( h s c h 2 c o o h ) 为稳定剂的水相中合成了粒径为2 5 r i m 的 c d t e 量子点是。所合成的量子点具有稳定的、对称的并且较窄的荧光发射带， 其半高峰宽( f u l l w i d t h a t h a l f m a x i m u m ，f w h m ) 为2 4 r i m 。通过改变反应体系 p h 值与回流时间，得到了制备c d t e 量子点的优化条件。 根据荧光共振能量转移原理，分别考察了c d t e 量子点的荧光发射光谱与淬 灭剂的吸收光谱，选择了适当的c d t e 量子点作为能量供体与3 端连接有淬灭剂 的d n a 在p b s 缓冲溶液中进行表面修饰，由于c d t e 量子点表面的羧基与d n a 的5 端的氨基在脱水剂1 乙基3 ( 3 二甲基氨丙基) 碳二亚氨盐酸盐( e d c ) 的作 用下发生缩合。因此得到了一种新型的荧光分子灯塔探针。通过对探针的荧光光 谱研究表明，分子灯塔探针的荧光强度比纯c d t e 量子点低，这表明荧光共振能 量体系已经成功被构建。 此外，本文通过检测探针与不同目标d n a 在杂交反应后荧光强度的变化， 考察了这种荧光分子灯塔探针的检测灵敏度与特异性。研究结果表明，探针在与 与探针d n a 序列完全互补的目标d n a 杂交后，其荧光强度得到了最大程度的 恢复，这表明荧光供体c d t e 量子点与受体淬灭剂之间的距离被拉大，探针的荧 光共振能量转移结构被打开，因此荧光强度恢复，其检出限为5 0 3 9 1 0 母m o l l 。 若采用单碱基错配的目标d n a 杂交，则探针的荧光恢复很弱，这表明此探针体 系可以检测目标d n a 是否发生变异，具有良好的特异性。 关键词：c d t e ，d n a ，灯塔探针，荧光共振能量转移 p r e p a r a tio no fo u a n t u md o t sc o n j u g a t e dm o ie c uia rb e a c o n p r o b ea n da p p ii c a t i o nf o rd n ad e t e c t i o n a b s t r a c t ak i n do fn o v e lh a i r p i nm o l e c u l a rb e a c o n sp r o b e ( m b p ) w a sp r e s 曲肥di n t h i s p a p e r i n o r g a n i cf l u o r e s c e n tc d t eq u a n t u md o t s ( q d s ) a n dq u e n c h e r s ( f o re x a m p l e d a b c y l ) w e r ec o n n e c t e db ys m o e s t r a n d e dd n a ( s s d n a ) t og e th a i r p i ns t r u c t m e o fm b p i tw a sc o n f i r m e dt h a tt h e r ew a sap a r to fo v e r l 印b e t w e e ne m i s s i o ns p e c t r u m o fc d t eq d sa n da b s o r p t i o ns p e c t r u mo fq u e n c h e r s t h e r e f o r e , t h ef l u o r e s c e n c e r e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f c r ( f r e t ) c o u l do c c u rb e t w o g nc d t eq d sd o n o r sa n d d a b c y lq u e n c h e ra c c e p t o r sw h e nt h e i rd i s t a n c ew a sc l o s ee n o u g h ( a b o u t1 - 1 0n m ) m o r e o v e r , t h ed i s t a n c e b e t w e e nd o n o r sa n da c c e p t o r sw e r ec o n t r o l l e db yt h e h y b r i d i z a t i o no f d n a , a n dt h ec h a n g eo f d i s t a n c eo f d o n o r sa n da c c e p t o r sw o u l dl e a d t ot h ec h a n g eo ff l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fm b ra c c o r d i n g l y , ac o m p l e m e n t a r yd n a w i t hs s d n ac o u l db ed e t e c t e db yt h i sf l u o r e s c e n tp r o b es y s t e m t h ec d t eq d sw i 出2 。5i 埘li nd i a m e t e rw e r es y n t h e s i z e dw i t hm e r c a p t o p r o p y l a c e t i ca c i d ( h s - c h 2 c o o h ) a ss t a b i l i z ea g e n ti nw a t e r , w h i c he x h i b i t e das t r o n g ， s t a b l ea n dn a r r o wb a n d ( f u l lw i d t ha th a l f m a x i m u m ，f w h mw a s2 4n m ) i ne m i s s i o n s p e c t r u m ，a n da no p t i m i z a t i o nr e a c t i o nc o n d i t i o n w a se x p l o r e db yc h a n g i n gt h ep ho f t h er e a c t i o ns y s t e m ，r e f l u x i n gt i m e ，a n ds oo n a c c o r d i n gt ot h ep r i n c i p l eo ff r e t , t h ee m i s s i o ns p e c t r u mo fc d t eq d sa n dt h e a b s o r p t i o ns p e c t r u mo fq u e n c h e r sw e r em e a s u r e dr e s p e c t i v e l yt og e ts u i t a b l ec d t e q d sa se n e r g yd o n o r a n dt h ec d t eq d sw 铘m o d i f i e db yt h e5 e n do f d n a - q u e n c h e r i n p h o s p h a m - b u f f e r e ds o l u t i o n ( p b s ) w h e nt h e 1 - e t h y l - 3 一( 3 一d i m e t h y l a m i n o p r o p y l ) c a r b o d i i m i d eh y d r o c h l o r i d e ( e d c ) a sd e h y d r a t i o n a g e n tw a se x i s t e di nt h es y s t e m t h ec a r b o x y lo nt h ec d t es u r f a c e sc o u l dr e a c tw i t l l a m i n oo fd n a i tw a si n d i c a t e dt h a tt h ef r e ts y s t e mw a ss e tu ps u c c e s s f u l l yw h e n t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fm b pw a sd e c r e a s e de x t r e m e l ya f t e rt h em o d i f i c a t i o no f c d t e q d s m o r e o v e r t h em i n i m u ml i m i to fd e t e c t i o na n ds p e c i f i c i t yo fm b pw a ss t u d i e d a c c o r d i n gt o t h ec h a n g e so ft h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo ft h em b ps y s t e ma f t e r h y b r i d i z a t i o nb e t w e e nm b pa n dd i f f e r e n tt a r g e td n a t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo f t h em b ps y s t e mr e c o v e r e dt ot h em a x i m u ma f t e rh y b r i d i z a t i o nb e t w e e nt h em b pa n d ac o m p l e t ec o m p l e m e n t a r yt a r g e td n a ，w h i c hd e m o n s t r a t e dt h a tt h ef r e ts t r u c t u r e o fm b pw a su n f o l d e da n dt h ed i s t a n c eb e t w e e nc d t eq d sd o n o r sa n dt h eq u e n c h e r a c c e p t o r sw a si n c r e a s e d ，t h e r e f o r e ，t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fm b p r e c o v e r e d t h e m i m m u ml i m i to fd e t e c t i o no fm b ps y s t e mw i hc o m p l e m e n t a r yd n ai nt h i sp a p e r w a s5 0 3 9 x1 0 4 m o l la c c o r d i n gt ot h em e a s u r e so ff l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yc h a n g e s 撕h y b r i d i z a t i o n w h e nam i s m a t c h i n gb a s e p a i rd n aw a sa st a r g e td n a t h e f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fm b ps y s t e mw a si n c r e a s e db u tw h i c hw a sm u c hl e s st h a n t h ei n c r e a s ew h e nt h ec o m p l e m e n t a r yd n aw a sa st a r g e t t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a t t h i sm b ps y s t e mn o to n l yh a da l le x c e l l e n t s e n s i t i v i t ya n ds p e c i f i c i t y 谢t h c o m p l e m e n t a r yd n a , b u t a l s oc o u l dd e t e c tt h eb a s eo f t a r g e td n aw a sm u t a n to rn o t k e yw o r d ：c d t e ，d n a ，m o l e c u l a rb e a c o n s ，f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得玉洼王些太堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 罗雪茁 签字日期：知哆车月砂日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解云洼王些太堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权丞洼王些盍堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学 校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：弗凶学 ) 葡轴 导痈签名：乃仁似利 签字日期：五司年7 月；1 日签字日期： 唧年j 月5 je l 学位论文的主要创新点 一、与传统的分子探针比较，本课题提出利用发卡式单链干一环结构 的单链d n a 灯塔探针构建荧光能量转移体系。 二、首次采用半导体纳米粒子c d t e 代替传统荧光染料分子，作为灯 塔探针的能量给体，成功的构建了共振能量转移体系，以实现在 均相体系中对核酸分子( 如：d n a 、r n a 、蛋白质等) 的快速检测。 三、合成出的量子点修饰的灯塔探针有良好的特异性与灵敏度，即该 探针与各种不同的目标d n a 杂交，荧光恢复的强度能明显区分， 能达到准确检测的目的。 第一章绪论 第一章绪论 1 1 量子点在生物领域的研究与应用概述 1 1 1 半导体量子点 半导体量子点( q u a n t u md o t s ，以下简称q d s ) 又称半导体纳米粒子【蚴，是一 种由l i 一族和一v 族元素组成的纳米颗粒。目前研究较多的是c d s 、c d s e 、 c d t e 、z n s 等。与传统的有机荧光染料或镧系配合物相比【3 1 ，荧光量子点具有以 下优点：( 1 ) 单个波长可激发所有的量子点，而不同染料分子的荧光探针需多个 激发波长；( 2 ) 量子点的发射波长可通过控制它的大小和组成来“协调”，如： 紫外一蓝光( z n s 、z n s e ) ：可见光( c d s 、c d s e 、c d t e ) ；近红外光( c d s h g s c d s 、i n p 、i n a s ) 。大小均匀的量子点谱峰为对称高斯分布，而荧光染料峰形 为对数正态分布，且又红移拖尾；( 3 ) 量子点的荧光强度是罗丹明6 g 的2 0 倍，稳 定性是它的1 0 0 倍，光谱线宽只有其三分之一；( 4 ) 量子点具有很好的生物相容性， 而有机荧光染料或镧系配合物则不具有这种优越性。目前，由于量子点具有独特 的光学和电学性质，使其应用领域越来越广泛，得到了物理、化学、生物等领域 研究者的广泛关注。特别是其在免疫生物学和临床检验学等研究中的潜在应用价 值已引起了广大科学工作者的极大关注。 1 1 2 半导体量子点在生物领域的应用 荧光共振能量转移( f r e t ) 技术作为一种高效的光学“分子尺”，在生物 大分子相互作用、免疫分析、核酸检测等方面有广泛的应用。 目前，q d s 最有前途的应用领域是在生物体系中作为荧光标记物。作为荧光 探针，q d s 的光学特性比在免疫荧光分析法中经常采用的传统发色团如罗丹明6 g 或其它有机染料分子有明显的优越性i q ：q d s 的激发光谱宽，且连续分布，而发 射光谱呈对称分布且宽度窄，荧光发射波长可通过改变量子点的大小而加以调 节，因而不同大小的半导体量子点能被单一波长的光激发而发出不同颜色的荧 光。相反，多种染料的荧光( 多种颜色) 却需要多种激光加以激发，这样不仅增加 了实验费用，而且使分析变得更加复杂。当延长照射时间时，有机染料的荧光信 号往往会很快暗下来( 光褪色) ，而半导体量子点则可持续发光，其荧光寿命可达 染料分子的1 0 0 倍以上【5 j 。 然而，早期的发光q d s 是在有机溶剂中制备的【6 ，7 1 ，水溶性差，并且无法与 第一章绪论 生物分子作用，因此利用纳米晶体的光学性质来检测生物分子的文献仍然很少 i $ - l o j 。1 9 9 8 年，b r u c h c z 等【4 】制备了c d s e _ d s 核一壳结构的q d s ，并用其作为 荧光探针对鼠组织细胞进行标记。他们在核一壳结构的外面增加了一层s i 0 2 ，其 表面经不同基团修饰后，能控制其与生物分子之间的相互作用。n i c 等【5 】将q d s 用于非同位素标记的生物分子的超灵敏检测。不同于采用硅壳的方法，他们将 q d s 的表面连接上巯基乙酸( h s _ c h 2 c o o h ) ，从而使量子点不仅具有水溶性， 而且可与生物分子相结合，通过光致发光可检测出q d s ，而结合的生物分子可识 别一些特定的物质，如蛋白质、d n a 或病毒。根据文献报道【“j ，每个量子点最 多可以连接上6 0 个d n a 序列( 如图1 1 ) 。 量i 岫咖 = 1 确一 图1 - 1 量子点上连接d n a 示意图 但是，上述方法中所用的q d s 都是在有机溶剂中制备的，其制备条件比较 苛刻，反应步骤也比较复杂，成本较高，给推广应用带来了一定的困难。因此， 量子点特殊的光学性质使得它在生物化学、分予生物学、细胞生物学、基因组学、 蛋白质组学、药物筛选、生物大分子相互作用等研究中有极大的应用前景 1 2 q ? l 。 研究在水溶液中直接合成半导体量子点对于其在生物医学研究中的应用具有重 要意义。 1 1 3 半导体量子点与生物分子的连接方式 目前用于半导体量子点与生物的连接有以下几种方式： ( 1 ) 依靠静电吸引力 使生物分子连接到q d s 表面包覆的一层带负电荷的游离基团上。方式有： 在q d s 外层包覆一层d h l a ( d i h y d r o l i p o i ca c i d ) ，再连接上生物素，以后根据 需要将蛋白、核酸甚至细胞膜生物素化，依靠生物素和抗生物素蛋白( b i o t i n - a v i d i n ) 之间的高度特异性结合力将q d s 标记到目标分子上；直接将带正电荷的蛋白 连接到q d s 上；通过一个带正电荷的亮氨酸拉链蛋 刍( l e u c i n e 。z i p p e rp r o t e i n ) 第一章绪论 为桥将连接在拉链另一端的单抗标记上q d s i 【1 8 , 1 9 1 。 ( 2 ) 共价偶联 将q d s 包覆一层聚丙烯酸，然后修饰成疏水性的聚丙烯酸醋，再将抗体、 链酶亲合素、或其他蛋白共价偶联到q d s 上。w a n g 等人用的方法是，用n 羟 基琥珀酰亚胺( n h s ) 和1 乙基3 ( 3 二甲基氨丙基) 碳二亚氨盐酸盐( e d c ) 将量 子点活化，再用蛋白将其取代( 如图1 2 ) 【1 0 1 。 囊，? o l d 詈刚q 神 翱一 o 竺婴雕火r 磁+ $ 婚蝴 图1 2 量子点与蛋白的共价偶联机理 ( 3 ) 包埋 将共吸附肤用聚乙烯乙二醇层包覆到q d s 上【2 1 1 ；或者埋入磷脂封闭的共聚合 微束中阎。 1 1 4 半导体量子点应用于共振能量转移体系 近年来生命科学领域出现了一种崭新技术：荧光共振能量转移( f l u o r e s c e n c e r e s o n a n t ；ee n e r g yt r a n s f e r ， f r e t ) 是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极 相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低， 而受体可以发射更强于本身的特征荧光( 敏化荧光) ，也可以不发荧光( 荧光淬 灭) ，同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。利用这种技术能够定时、定量、 定位、无损伤检测活细胞内蛋白质一蛋白质问相互作用。 作为共振能量转移供、受体对，荧光物质必须满足以下条件：( 1 ) 供、受体 的激发光要分得足够开；( 2 ) 供体的发射光谱与受体的激发光谱要重叠；( 3 ) 供、 受体的发射光谱要足够分得开。能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收 光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等 因素有关。 人们已经利用生物体自身的荧光或者将有机荧光染料标记到所研究的对象 上，成功地应用于核酸检测、蛋白质结构、功能分析、免疫分析及细胞器结构功 能检测等诸多方面田 2 4 】。 第一章绪论 传统有机荧光染料吸收光谱窄，发射光谱常常伴有拖尾，这样会影响供体发 射光谱与受体吸收光谱的重叠程度，而且供、受体发射光谱产生相互干扰。最新 的一些报道将发光量子点用于共振能量转移研究，克服了有机荧光染料的不足之 处1 2 5 埘】。相对于传统有机荧光染料分子，量子点的发射光谱很窄而且不拖尾，减 少了供体与受体发射光谱的重叠，避免了相互间的干扰；由于量子点具有较宽的 光谱激发范围，当它作为能量供体时，可以更自由地选择激发波长，可以最大限 度地避免对能量受体的直接激发；通过改变量子点的组成或尺寸，可以使其发射 可见光区任一波长的光，也就是说它可以为吸收光谱在可见区的任一生色团作能 量供体，并且保证了供体发射波长与受体吸收波长的良好重叠，增加了共振能量 转移效率。 1 2 荧光共振能量转移研究概述 1 2 1f r e t 原理概述 荧光共振能量转移( f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ，f r e t ) ，是由 f o r s t e r i ”j 于1 9 4 8 年首先提出的，因此又可称之为f 6 r s t e r 能量转移。f r e t 基本原 理：荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一 定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相 互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移( 即发生能量共振转移) 。 一对合适的物质构成一个能量供体( d o n o r ) 和能量受体( a c c e p t o r ) 对，能量受 体可以是荧光物质也可以是只有吸收光而无发射光的荧光淬灭剂。当两者相隔 1 o 一1 0 0 n r a ，并且供体的发射光谱与受体的吸收光谱能有效地重叠，以供体的 激发光激发，供体分子由基态跃迁到激发态之后，由于偶极一偶极相互作用，供 体分子激发态能量就有可能以非辐射的形式有效地被传递至受体分子，而后受体 分子通过发射出光子而弛豫，这就是荧光共振能量转移理论 2 3 , 2 6 , 3 ，其过程如图 1 3 ，能级如图1 4 所示。 白 龟9 一 詹1 t s 发生能量转移 r 卅5 不发生能量转移 图1 3f r e t 原理示意图 第一章绪论 0 荧光共振能量转移( f i 匝t ) 分析法由于其仪器简单、灵敏度高、所需样品量 少、分析速度快等优点，与色谱分离手段相结合，它己经成为一种有效的痕量及 超痕量分析技术。所谓f r e t 是指电子激发能在适当的能量给予体( d ) 和能量接 受体( a ) 对之间的传递，传递距离最大可达7 o 1 0 0 衄，1 9 4 8 年，f o r s t e r 对于 这种实验现象提出了偶极一偶极相互作用发生能量转移理论。1 9 6 7 年，s t r y e r & h a u g l a n d 提出能量转移可以作为光学尺，用来测量1 o 6 0 r i m 之间的距离。 f r e t 因其对距离的敏感性，广泛地被用于生物大分子结构、性质、反应机理以 及定量分析等方面的研究。因此，能量转移荧光分析非常适合于对环境、生物医 学科学和临床化学等方面复杂、低含量组分的分析，也是基因工程中的一种新手 段。 发生f r e t 需要3 个条件：( 1 ) 供体的荧光量子产率较高；( 2 ) 供体的发射光谱 与受体的吸收光谱能有效地重叠；( 3 ) 供体与受体间的距离要在1 土0 5 r 之内。 供体与受体之间发生f r e t ，将会使供体产生的荧光强度降低，受体发射的荧光 强度增强，同时伴随它们的荧光寿命的相应缩短和延长。因此可以根据供体荧光 强度的降低，受体荧光强度的增强，或者供体荧光寿命的缩短，受体荧光寿命的 延长来计算能量传递的效率e 。 1 2 2f r e t 能量供受体对的选择 荧光物质要成为f r e t 的能量供受体对( 简称d a 对) ，必须满足以下几 个条件口2 1 ： ( 1 ) 供受体的激发光谱要分得足够开。 ( 2 ) 供体的发射光谱与受体的吸收光谱要重叠。 ( 3 ) 供受体的发射光谱要足够分开。 ( 4 ) 受体也可以是一种只有吸收光，没有发射光的物质，即通常所说的荧 第一章绪论 光淬灭剂，在发生f r e t 时它可以使供体的荧光发生淬灭：供体也可以只有发射 光，没有吸收光，即通过化学方法发光，需要诱导剂的参与。 只有在这样的条件下，供体的激发光才不会对受体直接产生干扰，可能获得 足够灵敏而准确的结果。 在生物大分子的能量转移中，在选择d a 对时，首先要确定生物大分子本 身内有没有内原性的荧光基团可以作为d 或a ，如色氨酸残基( t r p ) 【3 3 1 、具有 荧光的碱基p 4 1 、血红素3 5 1 、还有核苷酸的荧光类似物 3 6 - 3 9 1 等，这样可大大简化 繁琐的标记步骤。在实际应用中，使用最普遍的标记方法是将荧光标记物共价键 合到待测大分子上去。生物大分子中大多含有的巯基( s h ) 、氨基( n h 2 ) 就 是最常用的结合点。例如，与s h 基反应进行标记的有碘乙酞胺类荧光衍生物、 马来酞亚胺类荧光衍生物、氮丙锭、汞的化合物，金纳米粒子等：与n h 2 基反应 的标记物有磺酞氯、异硫氰基化合物，表面修饰有c o o h 的无机纳米粒子等。 在发现和开始利用绿色荧光蛋白以前，能量转移的检测对象是一些能够自发 荧光或者可用人工的方法将荧光探针标记到检测对象的物质上，主要有： ( 1 ) 自然的荧光物质，如色氨酸( t r p ) 残基、具有荧光的碱基、血红素、 核苷酸的荧光类似物等。 ( 2 ) 合成的荧光染料，它们可以通过共价键的方式标记到待测物的大分子 上去。近年来还合成出一种特殊的荧光标记物f l a s h e d t 2 ，它本身没有荧光， 当e d t 被含4 个胱氨酸的多肽( c c x x c c ) 取代后却能发出明亮的荧光，因此游 离物不会产生有干扰的背景荧光。 ( 3 ) 稀土元素，可以通过螯合物配体进行标记。 ( 4 ) 无机纳米粒子，可以通过纳米粒子表面修饰的官能团进行标记。 1 2 3f r e t 的应用 f r e t 作为1 o 一1 0 0 n m 距离范围内的光学分子尺，具有高分辨率、高灵敏度、 简单方便等优点，越来越广泛地应用于核酸检测、免疫分析以及生物大分子相互 作用的研究中。 l 、无机离子的测定 聚乙烯醇是一种可溶于水的高分子化合物，先通过氰脉酞氯将荧光胺( 给予 体) 和铬黑t ( 接受体) 分别固定在聚乙烯醇的两个羟基上，将它作为试剂。在氨 缓冲溶液中( p h = 9 6 ) ，由于铬黑t 的吸收光谱与荧光胺的荧光光谱重叠都很小， 不发生荧光能量转移，试剂溶液呈现出荧光：当加入镁离子后，镁同铬黑t 形成 络合物，其吸收光谱向紫移，并与荧光胺发射光谱重叠，发生荧光能量转移，导 致荧光熄灭，荧光熄灭程度与镁离子浓度成比例。用此法测定镁，比相应的铬黑 第一章绪论 t 光度法灵敏度提高l o 倍以上【4 ”。 2 、酶的活性的测定 l a t t 等【4 2 1 设计了一种底物，在该底物中丹酞单元作为能量受体，它在甚至相 隔三个甘氨酞基的情况下也能淬灭色氨酸的荧光。当色氨酸一甘氨酞基之间的键 断裂时，又能恢复色氨酸的荧光。基于这种能量转移，他们测定了浚肤酶的活性。 如果将发荧光的供体和生色团受体分别键合到反应过程中断裂基团的两侧， 那么当水解进行时，监测受体荧光的下降或供体荧光的增强，可用于分析水解酶。 o - 羧基荧光素与卵磷脂脂质体( l e c i t h i nl i p o s o m e ) 混合时，荧光被淬灭，酶破坏 了脂质体并释放出荧光素而恢复荧光，从而提供了测定磷脂酶活性的方法1 4 3 1 。 3 、免疫分析 这是能量转移荧光分析中，应用最多和最成功的领域，最早1 扫u l l m a n 4 4 1 等 人提出( 1 9 7 6 年) 。常用的实验方法有两种：竞争法和夹心法。 在竞争法中u l l m a n 等人选择荧光素作为给予体( d ) ，四甲基罗丹明异硫氰酸 盐作为接受体( a ) 。将抗原( a g ) 用荧光素标记，抗体( a b ) 用四甲基罗丹明标记， 让未被标记的抗原( 分析物) 与标记抗原和标记抗体的免疫复合按下式发生竞争 反应： a g + a a b “_ a 矿+ a g a b g 在免疫复合物种，荧光素标记的抗原( x 9 5 转移激发能量到四甲基罗丹明标 记的抗体( a b 2 ) 上，导致荧光素荧光的熄灭当这一免疫复合物中加入待测分析 物( a g ) 时，随着未标记的抗原浓度的增大，与抗体结合的标记抗原由于竞争反 应的结果而部分脱离抗体，能量转移荧光熄灭降低，荧光强度增加。 夹心法是将抗体的一半用荧光素标记，另一半用四甲基罗丹明标记。被分析 的抗原有两个位置能同抗体结合生成夹心免疫复合物，同时导致能量转移荧光熄 灭。其反应方程式为： a g + a b 9 - a b 8 _ a 9 8 + a g - a b a 试样中被分析的抗原浓度逾高，生成的夹心免疫复合物也逾多，荧光强度也 愈小。这两种方法对抗原的测定，灵敏度可达1 0 。5 范围，并已用于多种抗原或抗 体的测定。 4 、p h 传感器1 4 5 】 将荧光剂曙红作为给予体，非荧光p h 指示剂酚红作为接受体，固定在一聚 合物膜( 如聚乙烯醇或牛血清蛋白) ，置于光导纤维的公共端。当p h = 8 时，酚 红的吸收光谱与曙红的发射光谱有最大程度的重叠。由于荧光能量转移的淬灭作 用，导致荧光强度随p h 值增高而降低，在p h = 6 0 8 0 范围内，荧光强度与p h 值 第一章绪论 变化成比例。 5 、在大分子结构、功能研究的作用 f r e t 技术对生物大分子结构的分析在溶液中进行，无须复杂的结晶等样品 处理步骤，因而快速、灵敏，同时与x 射线晶体衍射法相比，其测定结果更能 反映生物大分子结构与功能问的关系。 f r e t 技术可以轻松的分析生物大分子三维结构及特定位点间的距离。 n i c o l a s 4 6 1 等人以标记于特定非催化位点的卜苯胺基一8 一蔡磺酸( a n s ) 作为 a ，催化位点中t r p 残基为d ，测定了人类a 型及突变体兀型胞浆谷肤甘肤转移酶中 d 、a 间的距离，发现二者有所区别：a 型中距离为2 2 n m ，霄型中为1 8 2 n m 。 i s a c e 【4 7 5 0 1 等人测定了对基因表达有调节作用的蛋白质分子d p d n a 接合部为 m s x 1 片断的空间结构。 6 、核酸杂交分析方面的应用 f r e t 技术以常规荧光仪就可以灵敏，快速的测定核酸杂交。这一技术也可 用于固相分析或利用特殊的荧光显微镜进行单细胞分析，但需要特殊的辅助设 备。目前，f r e t 技术已经可以测定1 0 0 i _ t l 体积中1 0 。1 8 m o l 数量级【5 1 1 的杂交反应， 与放射分析具有相当的灵敏度，却避免了繁琐的分离手续。 f r e t 核酸杂交分析的原理很简单：当分别带有d a 标记物的核酸探针单链 杂交时，给体、受体之间的距离发生变化，就会引起荧光强度的变化。探针的设 计有以下几种模式：( a ) 在核酸双链探针的每条单链5 端进行标记，但只适用于碱 基数在6 2 0 之间的较短的寡聚核普酸链；( b ) 当链较长时，一条单链标记5 端， 其互补链标记3 端；( c ) 将核酸双链探针中的一条链截断，在生成的两条短链相 邻端进行标记；( d ) 作为更加简便的标记方法，只需要在一条链的一端进行共价 标记，而使用嵌入式加入另一种荧光分子作为另一标记。但这种方法不能确定 d ，a 间距离，因为不知嵌入的荧光分子的位置与数量。 f r e t 也可以用于核酸的定量分析。如在5 和3 端分别标记的d n a 杂交双链 中加入不同量未标记互补链，分别测出能量转移效率e ，以e 对加入的未标物量做 工作曲线，用于未知量的测定。m o r d s o n 等人1 5 2 】以荧光素标记寡聚核昔酸单链5 。 端作为d ，罗丹明标记其互补链3 端作为a ，形成一对探针，可测出6 p m o l 的靶d n a 分子。 、 p a r k h u r s t 等人【5 2 j 采用了一种特殊的标记方法：在一条含1 6 个碱基的寡聚核营 酸单链探针的3 端以荧光素( f ) 标记作为d ，5 端以罗丹明( r ”) 标记作为a ，其 在溶液中以随机盘绕状态存在，首位平均距离很近，可发生有效能量转移。而当 其形成杂交双螺旋时，由于1 6 个碱基相当于1 5 圈，p ，r h * 分别位于螺旋直径的 两端，距离变大，e 下降。用这种方法，p a r k h u r s t 等人可在n 1 1 1 0 i u m o l 范围内测 第一章绪论 定探针互补链。他们还观察了探针与其互补寡聚核苷酸链以及m 1 3 m p l 8 ( + ) d n a 杂交反应动力学之间的差别( 探针与m 1 3 m p l 8 ( + ) d n a 中6 2 9 1 6 3 0 6 序列的碱基互 补) ，发现杂交反应均为二级，反应常数分别为5 7x1 0 5 m o l l - l s - 1 和5 7x1 0 4 m o l l l o s ，这1 0 倍的差别被归于由d n a 大分子互补序列两端其它部分结构的波 动变化引起。 王进军等1 5 3 , 5 4 1 为了在活细胞内动态观察由表皮生长因子e g f i j i 起的p k a 酶 活性的变化，利用f r e t 原理设计了一种可以检测p k a 酶活性的报告蛋白 ( a k a r ) 。这种报告蛋白包含一个对p k a 特异性的底物结构域，一个与磷酸化底 物结构域相结合的磷酸化识别结构域。它的两端是g f p 的衍生物c f p 与y f p ，利 用f r e t 原理工作。当底物结构域被磷酸化后，分子内部就会发生磷酸化识别结 构域与其结合而引起的内部折叠，两个荧光蛋白相互靠近就会发生能量转移；如 果磷酸酶发生作用将其去磷酸化，分子就会发生相反的变化。通过对单个细胞 y f p 荧光强度进行随时间变化的定量分析，可以清楚地反映出e g f 诱导的单个细 胞p k a 酶活性变化大小的动态过程。 g r a h a m 掣5 5 】采用绿色荧光蛋白的变种，借助f r e t 技术，研究了r a c c d e 4 2 与其效应蛋白之间的相互作用。 0 s 删d 等1 5 6 】将两种近红外的荧光染料s q 6 3 5 和s q 6 6 0 转化成它们的n h s 脂， 将其共价结合至i j h s a 和抗h s a 上，形成偶联物s q 6 3 5 h s a s q 6 6 0 a n t i h a s 和 s q 6 3 5 一a n t i h s a s q 6 6 0 一h s a ，利用h s a 和a n t i h s a 2 _ 间的免疫反应，可以测定 蛋白质的浓度。使用1 5 0 w 的标准氙灯，能够使检出限达到1 0 一m o l l 。实验表明 这两种染料光谱重叠较好，供体的量子产率和受体的消光系数较高，适用于均相 竞争免疫分析。 f r e t 技术作为一种光学尺，研究生物分子结构的变化非常有利。i s h i i 掣5 7 1 结合全内反射荧光显微术，将其应用于单分子水平探测。他们将c y 3 和c y 5 分别 作为供体和受体标记到a - 原肌球蛋白( a t m ，是a a 同二聚体) 上，当用光激发c y 3 时，可以观察到f r e t 现象的发生；当蛋白质变性，成为两条多肽链时，f r e t 的 信号减弱，如图1 5 所示。因此有可能运用f r e t 技术检测单个蛋白质分子的聚合、 解离以及其构象的变化。 第一章绪论 i l p 沙 图1 - 5 原肌球蛋白的模式图 在w i l l a r d 等1 5 8 1 将四甲基罗丹g q ( t e t r a m e t h y l r h o d a m i n e ，t m r ) 标记的链霉亲 和素( s t r e p t a v i d i n ) 与生物素化的b s a 特异性结合，用量子点标记b s a ，形成了 以量子点作为能量供体，有机荧光物质t m r 作为能量受体的共振能量转移体系， 可以对生物素与链霉亲和素的结合进行检测( 如图1 6 ) 。以4 0 0 衄的光进行激发， 对于量子点来说有很高的激发效率，而对于t m r 来说则几乎不被激发。当以这 个波长对连接体进行激发时，由于发生了共振能量转移，t m r 荧光强度显著增 强。 f r 耵 图1 6 利用蛋白质特异性结合的共振能量转移分析 f r e t 技术的应用非常广泛，f r e t 技术还可应用于d n a 结构以及与蛋白质相 互作用的分析p 9 1 、细胞凋亡的研究【删、磷脂酶活性的检测以及免疫传感器的 开发6 2 1 等方面。随着f r e t 技术应用及研究的不断深入，必将对现代生命科学研 究的发展起着重大推动作用。 第一章绪论 1 2 4f r e t 效率的测量与计算 l 、测量f r e t 效率方法 有寿命测量法和荧光强度测量法两类方法。 ( 1 ) 寿命测量法有光寿命测量法【6 3 1 和供体光漂白寿命测量法( p f r e t ) t 6 4 - 6 引。 荧光寿命的测量主要有两种方法：时域寿命测量和频率寿命测量 6 9 1 。荧光寿命 是荧光基团的一个基本物理参量，荧光寿命测量不受供体浓度以及供体一受体浓 度比的影响，因此一般认为利用荧光寿命测量方法测得的f r e t 效率是可靠的。 但是由于荧光寿命一般在纳秒量级。所以对测量设备以及测量技术要求很高。当 受体浓度很高时，它产生的背景光很强，但是对测量结果的影响却较小【6 7 l 。为 了尽量减少误差，受体的浓度一般不要太高。但是供体一受体的浓度比( r a t i o ) 对f r e t 效率影响很大嗍，尤其是r a t i o 较低时影响更大。当r a t i o 超过一定值 后，f r e t 效率则随r a t i o 的变化不显著。事实上，p f r e t 是分别测量两种情况 下荧光强度的衰减过程，所以该方法应该属于荧光强度测量法。由于受体和供体 可能同时被光漂白，而且供体和受体被光漂白的速率很难一致，所以该方法测量 的结果很难让人信服。 ( 2 ) 基于荧光强度的测量方法有很多种，如供体荧光强度测量方法、受体 荧光强度测量方法和光谱拟合法【。7 0 l 等。 荧光强度测量方法就是通过分别测量供体在没有受体和存在受体时的荧光 强度来计算f r e t 效率。既可以通过测量供体的荧光强度，也可以通过测量受体 的荧光强度来获得f r e t 效率。当f r e t 发生时，供体荧光减弱，而受体荧光增 强，如果能准确测量受体增加的荧光强度和供体减少的荧光强度，就可以准确测 量f r e t 效率。 荧光强度测量法测量简单，对仪器设备要求低，因此是目前使用较为普遍的 测量方法。虽然荧光强度测量法对仪器设备的要求不高，但是却受到如下问题的 困扰：光谱重叠。为了获得灵敏的f r e t 效应，在选择时通常要求供体的发射 光谱尽量与受体的吸收光谱重叠，这样就会导致供体和受体的发射谱往往大部分 重叠在一起，很难将两者发射的荧光区分开来； ) f r e t 和非f r e t 分量的重叠， 即激发谱的重叠。供体发射的荧光由两部分组成：激发光直接激发受体产生的非 f r e t 分量和由于f r e t 效率产生的分量完全重叠在一起。浓度困扰。在许多 情况下