（植物病理学专业论文）若尔盖高原湿地土壤真菌的初步研究.pdf

摘要 本文采用全球定位系统( g p s ) 采集了若尔盖高原湿地7 4 个样点8 6 个土样，用 稀释平板法对该区土壤真菌进行了分离计数。对分离到的真菌进行了初步鉴定，并分 析了真菌数量与土壤类型、土壤质地、土壤养分、土壤水分、p h 等土壤环境因子的 相关性；同时在a r c g i s 9 0 平台上运用地统计学方法研究了该地区土壤真菌数量的空 间分布特征。根据土壤真菌的数量、种群及其分布研究该地区土壤真菌的物种多样性。 还分析了若尔盖高原湿地土壤木霉的种类及土壤木霉在拮抗病原菌和分解纤维素方 面的潜在能力。主要研究结果如下： 若尔盖湿地土壤真菌数量为9 6 8 1 0 2 + 2 4 8 x 1 0 3 ( 1 0 8 1 4 1 x 1 0 4 ) c f u g - 1 干土。 不同样点的土壤真菌总数存在较大差异，真菌数量最高达1 4 1 1 0 4c f u g - 1 干土，最低 仅有1 0 8c f u g - 1 干土，相差1 0 0 倍以上。同一样点内，土壤真菌数量随土层深度增加 而减小。不同地理区域，土壤真菌的数量分布表现为嫩哇( 1 8 6 5 2 6 3c f u g d ) 唐克 ( 1 5 4 3 2 4 6c f u g - 1 ) 班佑( 8 2 3 0 1 0c f u g - 1 ) 辖曼( 2 8 5 0 9 8c f u g 。) 阿西( 1 3 4 7 5 1 c f u g - 1 ) 。不同土壤类型方式下，土壤真菌数量表现为沼泽土( 3 8 0 x 1 0 3c f u g - 1 ) 泥 炭土( 2 7 2 x 1 0 3c f u g - 1 ) 草甸土( 1 0 8 1 0 3c f u g - 1 ) 风沙土( o 2 7 1 0 3c f u g - 1 ) 。真菌 数量随土壤质地的不同而表现为中壤土( 1 7 4 x 1 0 3c f u 9 4 干土) 轻壤土( 1 3 8 x 1 0 3 c f u g - 1 干土) 砂壤土( o 3 4 x 1 0 3c f u g 1 干土) 砂土( 0 1 7 x 1 0 3 c 龟g - 1 干土) 。 若尔盖高原湿地土壤真菌数量的空间分布呈呈环状或条块状分布，整体上由湿地 外围向内部逐渐增加。 7 4 个表层土经分离共获得7 7 1 株土壤真菌。分布范围较广的真菌为青霉 ( p e n i c i l l i u ms p p ) 、木霉( t r i e h o d e r m as p p ) 、镰刀菌属( f u s a r i u ms p p ) 、腐霉属 ( p y t h i u ms p p ) 、酵母类真菌、曲霉( a s p e r g i l l u ss p p ) 和毛霉( m u c o rs p p ) ，其分 离频率分别为9 8 6 8 、6 3 5 l 、3 1 0 8 、2 1 6 3 、3 3 7 8 、2 5 6 8 和2 9 7 3 ，在真 菌总数中所占的比例分别为2 1 7 9 、1 2 7 1 、4 4 1 、3 8 9 、4 6 7 、3 5 0 和3 6 3 。 土壤真菌与土壤生态因子间的相关分析表明，真菌数量与土壤中全钾、有机质含 量以及土壤含水量均呈正相关，与p h 值土壤全氮、全磷、速效钾、速效磷、碱解氮 呈负相关。其中真菌数量与速效钾和碱解氮含量呈显著负相关。另外，真菌数量与物 种丰富度( s ) 、s h a n n o n w i e n e r 指数( h ) 里负相关，相关系数较小。土壤真菌的物 种丰富度( s ) 、s h a n n o n w i e n e r 指数( h ) 、p i e l o u 均匀度指数( e ) 和优势度指数( d ) 分别为6 8 6 4 9 + 3 0 8 0 5 、0 7 6 5 0 - 0 。2 4 9 8 、0 9 6 9 7 4 - 0 0 6 2 7 、0 2 4 1 8 4 - 0 1 3 5 3 。辖曼地区土 壤真菌物种丰富度( s ) 和s h a n n o n w i e n e r 指数( h ) 最高，分别达8 4 0 0 和o 8 7 5 9 。 从若尔盖高原湿地土壤中分离木霉菌株9 8 个，其中哈茨木霉1 9 株，黄绿木霉2 9 株，深绿木霉1 0 株，康氏木霉1 2 株，绿色木霉1 3 株，长枝木霉7 株，还有木霉组的棘 孢木霉6 株，粗梗组的淡黄木霉2 株。 木霉生长速度测定结果表明，多数木霉菌株生长速度迅速，为空间和营养资源的 强竞争者。对峙培养中，木霉菌株对立枯丝核菌均有一定程度的抑制作用，其中t l 、 t 2 和t 5 的抑制率较高在7 5 以上。难挥发性代谢产物的抑制效果显著，t 2 3 、t 2 7 、 t 2 5 、t 2 8 和t 3 2 效果最好。 通过纤维素分解实验，从分离出的9 8 株木霉中初步筛选出具有纤维素分解能力的 菌株2 9 株。再经过刚果红纤维素培养基的筛选，有7 株木霉分解纤维素能力较好， 其中5 株为绿色木霉，另外2 株为黄绿木霉和康氏木霉。 关键词：若尔盖高原湿地，土壤真菌，物种多样性，生态因子，拮抗 n p r e l i mi n a r ys t u d yo nt h es o i lf u n g i i nt h ez o i g ep l a t e a uw e t l a n d x uy a h ( p l a n tp a t h o l o g y ) d i r e c t e db yp r o f g o n gg u o s h u a b s t r a c t 8 6s o i ls a m p l e so f7 4p l o t s ，l o c a t e db yg p s ( g l o b a lp o s i t i o ns y s t e m ) ，w e r ec o l l e c t e d f r o mt h ez o i g ep l a t e a uw e t l a n d q u a n t i t i e so ff u n g iw e r ed e t e r m i n e dw i t ht h ed i l u t i o np l a t e t e c h n i q u e t h es o i lf u n g iw e r ei d e n t i f i e da n dt h ec o r r e l a t i o n sb e t w e e nf u n g iq u a n t i t i e sa n d s o i le c o l o g i c a lf a c t o r sw h i c hi n c l u d e ds o i lf e r t i l i t y , s o i lh u m i d i t y , l a n d u s et y p ea n dp h w e r ea n a l y z e db y u s i n gt h es o f t w a r eo fs p s s a c c o r d i n gt ot h eq u a n t i t i e s ，c o m m u n i t i e s a n dt h e i rd i s t r i b u t i o n ，t h e f u n g id i v e r s i t yw a sa l s o s t u d i e d p o t e n t i a lw h i c hc o u l d a n t a g o n i z et op a t h o g e na n dd e c o m p o s ec e l l u l o s ew a sa l s oa n a l y z e d f u n g iq u a n t i t yr a n g e df r o m1 0 8t o1 4 1 x 1 0 4 ( c f u 9 1 d d ，s o i l ) a tt h es a m ep l o t ，t h e r e w e r em o r ef u n g ii nu p p e r ( o - 2 0 c m ) t h a ni n d e e p e rs o i ll a y e r s ( 2 0 - - 4 0 c m ) i nd i f f e r e n t r e g i o n s ，f u n g iq u a n t i t i e sf r o mh i g ht ol o ww e r ea sf o l l o w s ：n e n g w a ( 18 6 5 2 6 3c f u g 以d r y s o i l ) t a n g k e ( 1 5 4 3 2 4 6c f u 9 1 d r ys o i l ) b a n y o u ( 8 2 3 0 1 0c f u g - 1d r ys o i l ) x i a m a n ( 2 8 5 0 9 8c f u g _ d r ys o i l ) a x i ( 1 3 4 7 51c f u g - 1d r ys o i l ) i nd i f f e r e n tl a n dp a t t e r n s ，s w a m p l a n d ( 3 8 0 x1 0 3c f u 9 1 d 巧s o i l ) t u r fl a n d ( 2 7 2 x1 0 3c f u 百1 d 巧s o i ld r ys o i l ) m e a d o wl a n d ( 1 0 8 x 1 0 3c f u g - 1 d r ys o i l ) s a n dl a n d ( o 2 7 x 1 0 3c f u g - 1 d r ys o i l ) t h es p a t i a ld i s t r i b u t i o no fs o i l f u n g im a i n l ye x h i b i t e da ss t r i pz o n a la n dc i r c u l a r i t y p a t t e r n s a n dt h ec o n t e n to fs o i lf u n g ii n c r e a s e dg r a d u a l l yf r o mo u t s i d et o w a r dc e n t e r t h e r e g i o n sw i t hl o wc o n t e n t ( 2 5 0 0c f u 百1 d 叫s o i l ) w e r em a i n l yl o c a t e di nt h e n o r t h e a s to f n e n g w aa n dt a n g k ea n d q i d a o b a no fb a n y o u at o t a lo f7 71f u n g ii s o l a t e sw e r ec o l l e c t e df r o mt h es o i li nt h ez o i g e p l a t e a uw e t l a n d 2 5f u n g a lg e n e r aw e r ei d e n t i f i e d a m o n gt h e s eg e n e r a ，p e n i c i l l i u ms p p ，t r i c h o d e r m as p p ， f u s a r i u ms p p ，p y t h i u ms p p ，y e a s t ，a s p e r g i l l u ss p p a n dm u c o rs p p w e r ei s o l a t e dm o r e f r e q u e n t l ya t9 8 6 8 ，6 3 5 l ，3 1 0 8 ，2 1 6 3 ，3 3 7 8 ，2 5 6 8 a n d2 9 7 3 i nt h e s e s a m p l e s ，r e s p e c t i v e l y t h e i rp r o p o r t i o n so f q u a n t i t yw e r e2 1 7 9 ，1 2 7 1 ，4 4 1 ，3 8 9 ， 4 6 7 ，3 5 0 a n d3 6 3 ，r e s p e c t i v e l y s o i lf u n g iq u a n t i t i e sw e r ec l o s e l yc o r r e l a t e dw i t hs o i le c o l o g i c a lf a c t o r s a ts o m e d e g r e e ，f u n g iq u a n t i t yw a sc o r r e l a t e dw i t ht o t a lp o t a s s i u m ，o r g a n i cm a t t e ra n dw a t e r i c o n t e n t sp o s i t i v e l y ，b u tw i t hp h ，t o t a lp h o s p h o r u s ，r a p i d l ya v a i l a b l ep o t a s s i u m ，r a p i d l y a v a i l a b l en i t r o g e n ，r a p i d l ya v a i l a b l ep h o s p h o r u s ，s l o w l ya v a i l a b l ep o t a s s i u ma n dt o t a l n i t r o g e nn e g a t i v e l y t h ef u n g iq u a n t i t yh a das i g n i f i c a n t l yn e g a t i v ec o r r e l a t i o nw i t hs o i l a v a i l a b l ep o t a s s i u ma n dr a p i d l ya v a i l a b l en i t r o g e n i na d d i t i o n ，t h er e l a t i o n s h i pw a s n o t i c e db e t w e e ns o i lf u n g iq u a n t i t i e sa n dc o m m u n i t yd i v e r s i t y t h eq u a n t i t yo ff u n g ih a da l o wn e g a t i v ec o r r e l a t i o nw i t ht h ea b u n d a n c e ( s ) a n ds h a n n o n - w i e n e r sd i v e r s i t y ( n 9 t h e a b u n d a n c e ( s ) ，s h a n n o n w i e n e r sd i v e r s i t y ( h ，) ，p i e l o u se v e n n e s s ( e ) a n dd o m i n a n c e i n d e x ( d ) w e r e6 8 6 4 9 + 3 0 8 0 5 ，0 7 6 5 0 士0 2 4 9 8 ，0 9 6 9 7 + 0 0 6 2 7 a n d0 2 4 1 8 4 - 0 1 3 5 3 ， r e s p e c t i v e l y f u n g iq u a n t i t yi nn e n g w a w a st h em o s t ，b u ti nx i a m a nt h ea b u n d a n c e ( s ) a n d s h a n n o n w i e n e r sd i v e r s i t y ( h dw e r et h em o s t t h e yw e r e8 4 0 0a n do 8 7 5 9 ，r e s p e c t i v e l y 9 8t r i c h o d e r m ai s o l a t e sw e r ei s o l a t e df r o mt h ez o i g ep l a t e a uw e t l a n d t h e r ew e r e19 i s o l a t e so fzh a r z i a n u m ，2 9i s o l a t e so fza u r e o v i r i d e ，10i s o l a t e so fza t r o o v i r i d e ，12 i s o l a t e so fz k o n i n g i i , 13i s o l a t e so fzv i r i d e ，7i s o l a t e so fzl o n g i b r a c h i a t u m ，6i s o l a t e so f z a s p e r e l l u m ，2i s o l a t e so fzc e r i n u m ，r e s p e c t i v e l y t h et e s to fh y p h a lg r o w t hr a t es h o w e dt h a tm o s to ft r i c h o d e r m as t r a i n sg r e wr a p i d l y , a n dw e r et h es t r o n g e rc o m p e t i t o rf o rs p a c ea n dn u t r i t i o nr e s o u r c e t h er e s u l to ft h ed u a l c u l t u r es h o w e dt h ei n h i b i t i o nr a t e so fh y p a a lg r o w t ho ft r i c h o d e r m aa g a i n s tr h i z o c t o n i a s o l a n iw e r e3 3 4 3 7 7 9 9 ，t 1 ，t 2a n dt 5s h o w e dh i g h e ri n h i b i t i o nr a t e st h a n7 5 0 0 t h en o n v o l a t i l es u b s t a n c e so ft h ei s o l a t e st e s t e dh a do b v i o u si n h i b i t i o nt oh y p h a lg r o w t h o fg s o l a n i , a m o n gt h e mt 2 3 ，t 2 7 ，t 2 5 ，t 2 8a n dt 3 2s h o w e dh i g h e ri n h i b i t i o nr a t e s f r o mt h ep r i m a r ys c r e e nb yh e c h i s u mm e d i u m ，t h e r ew e r e2 9t r i c h o d e r m as t r a i n s h a v i n gt h ea b i l i t yo fd e c o m p o s i n gc e l l u l o s e ，w h i c hw e r es c r e e n e df r o ma l l9 8t r i c h o d e r m a t h e r ew e r e7t r i c h o d e r m ah a v i n gh i g h e ra b i l i t yo fd e c o m p o s t i n gc e l l u l o s ef r o mt h e r e - e l e c t i o nh o l d i n go nc e l l u l o s e - c o n g or e dm e d i u m k e yw o r d s ：z o i g ep l a t e a uw e t l a n d , s o i lf u n g i ，b i o d i v e r s i t y , e c o l o g i c a lf a c t o r ， a n t a g o n i s m i v 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机 构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 侨乡 硼年月7 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容。 研究生签名： 箭乡 导师签名：焦围陟y 7v w 了年f 月砷日 御年铝呷日 l 前言 1 1 研究的目的及意义 生物多样性是生命存在的基本形式，是物种得以持续发展的重要前提和条件。微 生物和动植物一样是地球上宝贵的难以再生的生物资源，也是其他资源不能代替的。 土壤微生物作为土壤生物中的一大类群，其数量庞大、种类繁多，在自然生态系统中 扮演消费者和分解者的角色，是土壤生态系统中最活跃的部分。l a l 和r e d d y 1 】认为 土壤生物多样性的保护对土壤性质的维持，减少土壤与环境退化的危险性具有非常重 要的作用，土壤微生物多样性研究是陆地生态系统多样性研究及土壤生物多样性研究 的重要组成部分，保护土壤微生物的多样性就是保护人类的未来。 土壤微生物主要包括真菌、细菌和放线菌。土壤真菌作为土壤微生物区系的重要 组成部分，虽然与其他组分( 细菌、放线菌) 有着共性，但也具有特殊性，因此对于 土壤真菌的研究尤具意义。真菌是一类种类繁多、分布广泛的真核微生物。尽管真菌 数量不及细菌，甚至比放线菌还少，但真菌是构成土壤微生物生物量的主要来源，具 有分解有机质，为植物提供养分的功能，是生态系统健康的指示物。研究表明，真菌 多样性与土壤水分、有机质、植物多样性呈正相关。真菌在土壤生态系统中发挥着多 种多样的功能，包括降解纤维素、半纤维素、木质素、胶质，还原氮，溶解磷，螯合 金属离子，产生抗生素用于制植物病害等。由于真菌的数量、种类和分布受全球气候 变化、环境污染和人类活动等诸多因素影响，自然环境中真菌的种类和数量、分布都 发生了显著的变化，真菌多样性研究越来越受到人们的重视，而研究一定区域内土壤 真菌的多样性将有助于我们了解该区域生态状况和有益微生物资源。 湿地是重要的国土资源和自然资源，如同森林、耕地、海洋一样，具有多种功能。 湿地与人类的生存、繁衍、发展息息相关，是自然界最富生物多样性的生态景观和人 类最重要的生存环境之一，它不仅为人类的生产、生活提供多种资源，而且具有巨大 的环境功能和效益，在抵御洪水、调节径流、蓄洪防旱、控制污染、调节气候、控制 土壤侵蚀、促淤造陆、美化环境等方面有其它系统不可替代的作用，因此，湿地被誉 为“地球之肾”。在世界自然保护大纲中，湿地与森林、海洋一起并称为全球三大生 态系统。 若尔盖高原湿地是我国重要的湿地之一，分布有具有世界意义的特有物种和高度 濒危稀有物种，拥有具有重要经济意义的物种1 2 0 8 种。近年来，由于本区人口数量剧 增，对资源需求量增加，盲目地开发利用湿地，以破坏湿地资源为代价而过快地发展 畜牧业，过度放牧日趋严重，使很多湿地植物不能有规律完成其萌发、生长、开花、 结实、死亡、繁衍等生活史，造成湿地植物多样性丧失，破坏了湿地生态系统的良性 循环，导致其具有的生态功能也随之丧失。根据杨永兴等【2 5 】的野外考察与研究，进 一步证实了若尔盖高原湿地生态环境恶化、湿地退化十分严重，其主要表现为湿地的 旱化，水质变恶，草场退化。因此对该地区生态多样性的研究变得十分重要，尤其是 土壤微生物的多样性，但有关该区域土壤微生物特别是真菌的研究鲜有报道。本研究 在较大范围内采集土样，分析土壤真菌的资源状况及其真菌物种的多样性，为该区域 土壤资源的合理利用和生态恢复提供参考。同时通过分析该区域土壤木霉在拮抗植物 病原菌和分解纤维素方面的潜力，以期从该生态区域中筛选出可进一步应用的有益真 菌。 1 2 研究现状综述 1 2 1 土壤微生物多样性研究 土壤微生物是土壤中物质循环的调解者，同时也是有机物质和速效养分的一部 分，它参与多种反应过程，如矿化一同化、氧化一还原等，是植物养料转化，有机碳 代谢及污染物降解的驱动力，在土壤肥力演变，尤其是养分循环中具有重要意义。土 壤中微生物总量，是有机物质矿化作用程度的一种衡量标志，目前土壤微生物的区系 以及多样性研究成为了土壤微生物研究的热门【1 8 ，1 9 1 。 微生物多样性是指在某一特定地理区域内，生活在同一环境下不同微生物种群在 组成、结构、功能和动态方面表现出的丰富多样的差异。微生物多样性采用把种的数 量和均匀度相结合的分析方法，根据这两个组分的不同结合所给出的权重的不同，而 形成了各种多样性指数。微生物多样性包括以下6 个方面的内容：形态多样性 ( m o r p h o l o g i c a ld i v e r s i t y ) 、结构多样性( s t r u c t u r a ld i v e r s i t y ) 、代谢多样性( m e t a b o l i c d i v e r s i t y ) 、生态多样性( e c o l o g i c a ld i v e r s i t y ) 、行为方式多样性( b e h a v i o r a ld i v e r s i t y ) 和 进化( 或遗传) 多样性( e v o l u t i o n a r yd i v e r s i t yo rg e n e t i cd i v e r s i t y ) 。 一般而言，土壤微生物多样性指土壤微生物在遗传、物种和生态系统层次上的变 化。三者之间相互依赖、密不可分，尤以生态系统多样性作为物种多样性和遗传多样 性的基础与生存保证。近年来，随着景观生态学的发展，按照空间尺度划分，生物多 样性还包括景观多样性。总之，生物多样性包括生物学、生态学和生物地理学等三方 2 面的含义。土壤微生物多样性代表着微生物群落的稳定性，也反映土壤生态机制和土 壤胁迫对群落的影响。土壤微生物多样性还可以定义为微生物生命的丰富性，通常以 土壤生物区系的变化和生物化学过程间的相互关系来反映，包括二部分内容：物种数 量和它们的分布。 微生物遗传多样性主要通过分子生物技术，研究土壤微生物多样性。微生物物种 多样性主要通过各种方法鉴定土壤中微生物的种群及数量，它不仅反映了群落中物种 的丰富度、变化程度或均匀度，也反映了不同环境条件与群落的相互关系、尤其是群 落物种多样性在一般情形下与群落的稳定和动态有很大关系。微生物生态功能多样性 主要通过分析测定土壤中的一些转化过程，如有机碳和氮的矿化速率、土壤氮固持率、 硝化作用以及土壤酶的活性等。景观多样性是指景观结构、功能和时间变化方面的多 样性，是景观水平上生物组成多样化程度的表征。景观多样性方面的研究起步较晚， 基础薄弱，近年来刚刚受到重视。 土壤微生物多样性可以理解为生物物种的多样化及其变异的程度和广度。长期以 来，微生物多样性的研究一直存在争议，但将土壤微生物的多样性与整个生态系统联 系起来，都可以从物种多样性、遗传多样性、生态特征多样性和功能多样性4 个方面 来概括土壤微生物多样性的基本特征。目前，生物多样性的研究热点有：生物多样 性的调查、编目及信息系统的建立；人类活动对生物多样性的影响；生物多样性 与生态系统功能；生物多样性的长期动态监测；物种濒危机制和保护对策的研究： 栽培植物、家养动物以及野生近缘的遗传多样性研究；生物多样性保护技术与对 策；特殊生境和特殊生物类群的生物多样性。w h i t t k e r 首次将多样性划分为4 个空 间尺度：a 多样性，指群落内物种组成多样性；b 多样性，指在均质生境内或微生境 的多样性；7 多样性，相当于岛屿和景观尺度；6 多样性，相当于生物地理区域 6 3 。 土壤微生物做为生物中的一大类群，其多样性研究具有自身的特点，研究内容主要有： 自然土壤微生物多样性变化趋势；农业土壤微生物多样性；化学物质污染土壤微生物 多样性；不同种植制度下的土壤微生物多样性；转基因植物、微生物介入的土壤微生 物多样性；土壤微生物多样性利用研究。当前的研究热点主要有生物群落多样性的测 度、人类活动对生态系统多样性的影响、应用多样性的原理和方法进行环境监测、自 然保护管理等领域【7 1 2 】。本文仅从物种多样性和生态系统多样性两方面来阐述土壤微 生物多样性。 ( 1 ) 物种多样性 物种多样性f l j f i s h e r t l 3 1 首先提出，是指群落中物种的数目和每个物种的个体数目。 土壤微生物物种多样性是多样性研究中最基本的内容。对土壤微生物多样性的研究已 经有很多指标。其中，常用的指标有物种的丰富度( r i c h n e s s ) 、多样性( d i v e r s i t y ) 、 多度( a b u n d a n t ) 、均匀度( e v e n n e s s ) 等。其中以s i m p s o n 指数( d ) 、均匀度指数、 生态宽度和s h a n n o n - - w i e n e r 指数( h ) 最为常用，而且影响最大。目前采用的物种 多样性指数为物种丰富度指数、物种多样性指数、均匀度指数、生态优势度以及分离 频度。 ( 1 ) 物种丰富度是指测定一定空间范围内的物种数目以表达生物的丰富程度。 主要有一定样地内的物种数( s ) ，丰富度指数s = n i ，其中n i 为每个样点所分离的 真菌不同属的数量，这是衡量物种多样性的最直接也是最重要的尺度眦1 9 1 。 ( 2 ) 物种多样性指数是将物种丰富度与种的多度结合起来的函数。常用的有 s h a n n o n m w i e n e r 指数，s i m p s o n 指数以及种问相遇几率等。 h 一p i i n p i j 墨l 式中p i 是第i 属的多度比例，可以用p i = n i n 求出；n i 是第i 属的菌株数，n = y n i ，所有真菌的总和【2 0 】。 ( 3 ) 均匀度指数是把物种丰富度与均匀度结合起来的一个统计量。应用最多 的是p i e l o u s 均匀度指数( 群落的实测多样性与最大多样性之比率) 、a l a t a l o 均匀度 指数( 对样本大小不敏感的均匀度指数) 。均匀度指数_ i e l o u 指数( e ) 【2 1 2 1 ： e = h h m a x 式中h 为实际的物种多样性指数，h m f x 为最大的物种多样性指数，h m a x = l n s 。 ( 4 ) 生态优势度生态优势度、均匀度和物种多样性指数有密切关系。物种多 样性指数与物种均匀度呈正相关，而与生态优势度呈负相关。多样性指数越高，生态 优势度越小，均匀度越高。 ( 5 ) 分离频度是指某一种或属在样本总体中的出现频率，而且根据分离频度 划分优势度成4 个等级，即分离频度 5 0 为优势种( 属) ，3 0 分离频度 5 0 为 最常见种( 属) ，1 0 分离频度 广州地区，不同土地利 用方式下：林地 菜地 稻田 果园 作物旱地 荒地，土壤微生物总量与土壤肥力 状况密切相关。土壤退化与土壤微生物多样性的关系也十分密切，刘世贵等【2 6 】研究了 三种不同程度退化草地土壤微生物数量种群状况，结果表明不同程度的退化草地在土 壤微生物种类与组成、优势菌群与数量等方面有较大差异，种类与数量有随退化程度 增高而减少的趋势，微生物数量具有明显的垂直分布和季节变动规律。李为等( 2 7 j 研究 中国西南4 个不同岩溶地区土壤微生物的生态分布和特性，探讨了微生物在岩溶系统 中的作用，认为微生物的数量和组成与赋予不同地形和植被特征的岩溶生态系统的特 性高度相关。 另外，人类活动、鼠虫危害等也是影响土壤微生物数量种群变化的重要原因，但 这种影响是通过主要因素( 土壤含水量、p h 值、土地利用类型和土壤肥力等) 起作 用的【5 2 1 。 1 2 2 土壤真菌研究进展 1 2 2 1 土壤真菌研究简史 1 8 8 6 年，a d a m e t z 从沙滩的表面和内层分离到1 1 株真菌，这是最早关于土壤真 菌研究的记载。1 9 0 2 年，k o n i n g 和o u d e m a n s 对分离方法进行改进，用麦芽汁或麦 芽加琼脂作为培养基，将土壤中的植物部分打碎后，制成悬浮液进行培养，得到4 0 多个菌株。这应该是真正意义上的土壤真菌研究的开始，也是以后工作的基础。1 9 1 2 年j e n s e n 等相继对土壤真菌的分离方法作了进一步的改进，使分离效率更加提高。 对土壤真菌的定量研究始于1 9 2 2 年，该研究借鉴了土壤细菌的研究方法和手段，一 般采用的是稀释法。2 0 世纪3 0 年代开始了土壤真菌原位研究的初步试探，c h e s t e r s 提出了将装有灭菌培养基的试管埋于土壤中来分离真菌的方法。土壤真菌分离研究从 此开始步入快速发展的阶段。1 9 5 6 年，g i l l m a n 在其所著土壤真菌手册中汇集了 7 5 6 个种，包括子囊菌、藻状菌( 即现在的卵菌，下同) 及半知菌。1 9 6 8 年，b a h o n 总结自己的研究结果，写成的土壤中丝孢纲真菌的属一书中包含了丝孢纲真菌 2 1 4 属，4 3 6 种，其中1 3 0 属约2 7 0 种是暗色孢菌。d o m s c h 等 6 6 1 ，在1 9 8 0 年出版的 专著中列出1 5 9 个属，4 1 0 个种，包括子囊菌，接合菌，藻状菌，担子菌和半知菌， 其中的少数属已划归于藻物界( c h r o m i s t a ) 。据h a w k s w o r t h 36 3 7 1 的观点，真菌中仅 有o 7 可以培养成活，这样估计土壤中存在的真菌数量至少有7 0 0 0 种或更多。 1 2 2 2 土壤真菌的研究方法 土壤真菌的计数方法分直接计数法和间接计数法两种，分别测定总菌数和活菌数。 直接计数法是将土壤真菌染色，在显微镜下计数的方法；适于在土壤类型近 似的条件下或以各种方法固定土壤后，再计算土壤样本中的真菌。 ( 1 ) r o s s i c h o l o d n y 埋片法：将载玻片埋于土壤中，经过一定的时间后镜检测 定载玻片表面的微生物。真菌一般用放大4 0 0 - - 6 0 0 倍的显微镜，每张标本片观察 1 0 0 - - 4 0 0 个视野，以检出真菌的视野数与总视野数之比表示真菌的生育量( 检出频率 ) 。此法为半定量方法，适用于测定不同时期，不同土壤中真菌菌丝体丰度，然而 不能测定每单位重量土壤中的菌数( 生育量) 。 ( 2 ) 毛细管法：根据微生物利用土壤本身的毛细管系统输送的空气和养分而生 存的原则，将灭菌的毛细管插入溶化的o 2 琼脂中，取出，待琼脂凝固后，安装在 支架上，插入土壤中，一定时间后取出，用5 碳酸赤鲜红染色，在显微镜下观察。 此方法能显示出天然生境下的微生物区系，并可能分离出许多未能为平板法所揭示的 6 微生物种类，但得不出单位重量土样中所含真菌数量。不过，反映出的信息仍可作为 不同土壤中微生物种类及数量的相对值，加以比较。 ( 3 ) j o n e s - m i l l i s o n 法：将土壤悬浮液与溶化的琼脂充分混合，再制成薄片， 使土壤粒子与菌体均匀分散，提高测定总菌数的精确度。本方法适用于土壤中的真菌 的菌丝量的检出频率的测定。上述3 种方法由于菌体和有机物质同样被染色，要求操 作熟练。制成的标本保存时间较长。 ( 4 ) 荧光显微观察法：上述3 种显微镜直接计数法用酸性染料染色后，虽可将 菌体合土壤颗粒分开，但无法区分活菌和死菌。一般情况下，活菌比死菌吸收染料少， 在荧光下分别显示亮绿色和暗红色。此法可进行土壤真菌的定量测定。常用的荧光染 料有异硫氰酸、卜苯胺、8 一萘酚硫酸镁盐、二醋酸盐和萘啶酮酸。其中后两者只染活 的微生物。 ( 5 ) 荧光抗体法：用抗体和荧光素结合制成的荧光抗体试剂处理土壤样品，荧 光抗体和存在于样品中的相应抗原产生特异性反应，在荧光显微镜下产生特定的荧 光。如果事先制备多种模式的荧光抗体，就可对土壤样品中的相应抗原进行检验。并 且荧光抗体可长期保存。本方法由荧光抗体的制备和荧光抗体标本的染色两部分组 成，适用于涂抹标本、印片标本、土壤本身、埋片和土壤切片。真菌多使用菌丝的匀 浆作为抗原来制备抗体。荧光抗体的染色方法有直接法、间接法及补体法等。本方法 可进行土壤真菌的定量测定，并且能够了解土壤真菌的组成情况。 ( 6 ) 电子显微镜直接观察法：利用电子显微镜观察土壤悬夜，用热吸附法制片， 可观察到少量的真菌。此方法比稀释平板法的测定效果高几百倍。但改变了土壤的自 然状态，且不能得到纯培养，不能直接作菌种的鉴定，为其缺点。 ( 7 ) 土壤切片法：利用各种固定剂在不破坏土壤结构的条件下，将土壤样本固 定，制成观察微生物的剖面或薄片，再进行镜检。 间接计数法间接计数法是在培养基上培养，测定菌落数和根据真菌的活性反 应而计数的方法。 ( 1 ) 稀释平板法：根据土壤中真菌的数量，一般采用的稀释度为1 0 一1 0 一，同 时称取待测土壤约1 0 9 ，经1 0 5 c 烘干8 h ，置于干燥器中，待冷却后称重，计算土壤 含水量的百分数。用混菌法和刮刀法将土壤悬浮液接种在培养皿中重复4 次，与2 8 3 0 恒温箱中培养5 7 天，选取菌落数在1 0 1 0 0 的培养皿进行计数( 剔除扩散性真菌 菌落占琼脂表面1 5 以上的培养皿) 。 7 ( 2 ) 土粒法：对于不产孢子的真菌，采用将土粒接种在选择性培养基上的方法 来分离计数。取少量土样加无菌水调成糊状，用圆头玻璃棒在平板上点样，适温下培 养一定时间后，观察生长情况，结果以百分数表示。此方法只能得到不同土壤之间同 类真菌数量的比较粗略的数据。以上2 种方法中，稀释平板法是测定土壤中活菌数的 一种最常用的方法，操作简便，而且可以同时从土壤中分离到较多的真菌，但由于人 工培养基不能满足土壤所有真菌的要求，因此，稀释平板法还不能反映土壤中真菌生 态分布的实际情况，所得结果一般低于土壤中的实际数量，并且在测定产生分生孢子 的真菌时，则往往得出过分夸大的数目。此外，土壤的分散、稀释操作、培养基成分 和培养条件等原因也影响稀释平板法。 ( 3 ) 最大概率数值法：以烟草黑腐病菌根串珠霉( t h i e l a v i o p s i sb a s i c o l a ) 为例， 取烘箱干燥土壤1 0 9 。用每毫升含6 0 微克金霉素的灭菌蒸馏水配制每级1 0 倍的稀释 液至1 0 巧或1 0 击。在铺有滤纸的培养皿内放3 片1 0 m m 厚的胡萝卜片，用直径2 , 一3 m m 的打孔器在上面打出已凹穴，加入稀释液l m l ，重复3 次。接种天后，记录发病 胡萝卜数目。若2 6 次稀释度中获得阳性结果( 5 ，4 ，2 ，0 ，0 ) 。以p l 为5 ，p 2 为4 ，p 3 为2 的值，查表得近似值2 2 。 直接计数法虽能比较真实地显示土壤中真菌的数量和分布状况的图景，但难于鉴 别真菌的种类和细胞的死活，而且不能得到纯培养。测量活菌数的间接计数法由于使 用的培养基的成分组成及物理性状和土壤大不相同，不能使土壤中所有的真菌全部生 长发育，虽然可以获得纯培养，但是所得结果不论在数量还是类群等方面，均不能反 映自然状态下土壤真菌的全部真实情况。直接计数法和间接计数法都存在着不同程度 的局限性，然而不论采用任何一种方法，都能在一定程度上了解土壤真菌的数量和组 成。土壤真菌总菌数和活菌数测定结果同时获得，对确切掌握土壤真菌区系得全貌必 将有所裨益【3 3 3 5 1 。 土壤真菌的分离培养方法：最新研究估计全世界的真菌种类约有15 0 万，但至今 已被正式描述的只有5 1 0 绝大多数是未知的【翊。其原因一方面在于对真菌分离培 养技术的依赖，不能从少量材料中分离出目标生物，缺少对所有真菌群落生物都适应 的培养基和培养条件；另一方面在对于真菌生活环境缺乏全面了解，不能准确地评价 不同地域真菌群落的结构组成 3 7 1 。因此对真菌的分离方法及培养基的选择的就变得 十分重要。 土壤真菌的分离方法很多，主要是稀释平板法、土壤平板法、土壤淋洗法、孢子 8 悬浮法、钟形撒粉器法、平板插入筛选法、插入管法、菌丝分离法、植物残渣法、直 接分离法、捕捉法、湿筛法、漂浮法和蒸气法【3 s 3 9 1 。其中稀释平板法用于分离产孢 能力较高的半知菌、子囊菌和接合菌，例如