（环境工程专业论文）污泥厌氧消化过程中乙酸累积的微生态机理研究.pdf

摘要 摘要 舢1 1 1 1 1 1 1 1 l i l l l l l 1 1 1 l i l l l l l m i y 18 2 9 6 8 6 污泥厌氧消化过程中会产生许多中间产物，主要是短链有机酸类。其中，乙酸是主 要的中间产物之一，也是有机化工行业的重要生产原料。通过厌氧消化，将污泥的有机 成分尽可能多地转化成乙酸，再通过耦合系统转化为高附加值生物化学品，不仅可使污 泥获得稳定化、无害化处理，而且也可使其中的有机成分得到更好的利用，这是实现资 源化再利用的一条新途径。近年来，混合培养生物技术已经成为一个非常有前景的发展 方向。与传统纯培养方法通过筛选高效微生物或基因改造的思路不同，混合培养生物技 术运用的是生态学的观点，通过选择压力对微生物菌群进行调控。在产酸反应器中，为 了取得最佳的产酸效果，产甲烷抑制剂就是一种常用的选择压力。它可以在不影响产酸 微生物的同时，使短链有机酸等中间代谢产物不被产甲烷菌消耗。 本论文以市政污泥为模式底物，利用环境微生物分子生态学技术，在种群和群落水 平上研究了产甲烷抑制状态下污泥厌氧消化过程中碳流方向、确定了菌群结构与乙酸累 积之间的关系、阐明了各菌群对乙酸累积的贡献、回答了乙酸的累积是如何通过菌群竞 争机制来控制等问题，为污泥厌氧消化制备乙酸奠定了理论基础。主要的研究结果如下： 1 建立了同型乙酸菌免培养的快速定量方法 已报道的同型乙酸菌的引物特异性不高，经克隆文库后发现，大约有5 5 的克隆并 非来自真正的同型乙酸菌，而归属于硫酸盐还原菌等非同型乙酸菌。根据f t h f s 基因 数据库重新设计的引物，经过纯菌验证，克隆文库，溶解度曲线等评价后证实其特异性 能够满足定量同型乙酸菌的特异性要求。该方法的检测限为5 0 0 拷贝反应，相当于1 0 4 个拷贝儋干重。对实际环境样品定量后发现，同型乙酸菌在自然界的数量为1 0 5 1 0 7 个儋 干重，占总细菌数量的0 6 o 9 ，表明同型乙酸菌在厌氧生境中的丰度不高。 2 产甲烷抑制剂对污泥厌氧发酵各阶段的毒性研究 对两种经典的产甲烷抑制剂b e s 和氯仿作用于污泥厌氧发酵不同阶段( 发酵产酸， 产氢产乙酸，食氢产甲烷和食乙酸产甲烷) 的抑制浓度范围和抑制机理进行了较为细致 的评估后发现：食氢产甲烷反应的毒性阈值较高，b e s 和c h c l 3 针对其的半抑制浓度 ( i c 5 0 ) 分别为8 7m m 和0 0 0 9 ，而食乙酸产甲烷的i c 5 0 分别为5 8m m 和o 0 0 6 。 b e s 和c h c l 3 对产酸发酵和产氢产乙酸过程的抑制也机理不同。以葡萄糖和认作为 底物时，氯仿处理污泥的产酸效率和产氢产乙酸活性均有明显下降，而b e s 处理组则 仅在高浓度时呈现出轻微的热力学抑制。兼顾抑制产甲烷效果和产酸效率，最适产甲烷 抑制剂浓度分别为5 0m mb e s 和0 0 5 c h c l 3 。 3 产甲烷抑制剂对乙酸消耗微生物群落的实际效果 t - r f l p 和r e a l t i m ep c r 的结果显示，b e s 和c h c l 3 不仅抑制了系统的产甲烷活性， 而且对产甲烷种群的数量和多样性都有影响。食乙酸产甲烷菌胞珈册口e 勉c p a e 的敏感 摘要 程度比食氢产甲烷菌讹砌口，l d 6 口c 纪，缸胁和胁砌口”d 聊纪阳6 妇胁高得多。在产甲烷抑制 状态下，其部分生态位逐渐被食氢产甲烷菌所占据。由此推断，在较低的抑制浓度下， 尽管食乙酸产甲烷过程被抑制，乙酸也并不一定会积累。乙酸可能通过乙酸氧化途径首 先分解为h 2 和c 0 2 ，随后再由食氢产甲烷菌转化成甲烷。 4 产甲烷抑制状态下发酵产酸菌群的演替特征 细菌群落指纹的多元统计分析结果显示，产甲烷抑制剂不仅影响产甲烷菌群落，还 直接或间接地影响了发酵产酸菌群。在氯仿抑制实验中，低g + c 含量的革兰氏阳性菌 ( c f d s 们旃口胁) ，高g + c 含量的放线菌( 彳c 砌d 聊y 泐) 以及绿色非硫细菌( 西肠加刀缸) 变为优势种群。在b e s 抑制实验中，耗氢细菌 如d 陀如s p 和g p d 6 口c 胞，矗) ，姆，z 印j i z f 岱 推动了群落的演替。由于高浓度的非离解性有机酸存在，革兰氏阴性菌勘c 纪加洗泐和 跏，z e 咖泐在两种抑制模型下的丰度都显著降低。值得注意的是，仍有超过一半的水解 发酵细菌对甲烷抑制剂并不敏感，它们与环境变量的相关系数t 值均小于0 1 5 。 5 二次发酵产乙酸细菌在产甲烷抑制状态下的响应机制 氯仿不仅抑制产甲烷菌，对同型乙酸菌也有强烈的抑制作用。培养终了，同型乙酸 菌数量从1 0 1 0 8m l 。1 减少至3 0 1 0 6m l 1 ，下降了将近3 0 倍。而在b e s 抑制模型中， 适宜的热力学状态( g 2 0 至2 4l ( jm 0 1 ) 和历s 基因拷贝数的上升( 1 5 倍，p = o 0 2 ) 均显示，同型产乙酸途径在产甲烷抑制状态下对乙酸的累积起着非常重要的作用。产氢 产乙酸过程方面，两个抑制组中产氢产乙酸菌数量均有不同程度的下降。氯仿培养物中， 丙酸降解菌( s p o b ) 和丁酸降解菌( s p o b ) 细胞数比未抑制对照中分别低了1 3 3 和 7 9 倍( p o 0 0 1 ) 。而b e s 处理样品的s p o b 和s b o b 的数量仅有轻微减少( 分别下降 1 5 和2 o 倍，p = 0 0 2 ) ，同时g 也接近于热力学平衡状态( g ok j m 0 1 ) 。 6 产甲烷抑制状态下有机碳流和碳平衡分析 通过稳定性同位素和放射性同位素进行碳流分析后发现，未抑制污泥发酵样品的表 观分馏因子仅聊在1 o o 1 0 1 之间，表明乙酸发酵是污泥产甲烷的主要途径。而当加入较 低浓度产甲烷抑制剂后，a 狮增加到1 0 3 1 0 4 之间，产甲烷途径开始向h 2 c 0 2 还原过 渡。碳平衡分析和 u 1 4 c 葡萄糖降解实验证明，同型乙酸菌和产氢产乙酸菌在产甲烷抑 制状态下可以通过种间氢转移重新建立互营共生关系。对 2 1 4 c 】乙酸降解过程进行的碳 流分析则发现，在h 2 分压较低的情况下，乙酸氧化菌对乙酸的消耗作用明显。 关键词：厌氧污泥，乙酸，产甲烷抑制剂，分子生态学，同型乙酸菌，产氢产乙酸菌， 产甲烷菌，有机碳流 i i a b s 仃a c t a b s t r a c t a c e t a t ea sa i li m p o r t a n tm e t h a n o g e n i cp r e c u r s o rp r o d u c e da tt h ea c i d o g e n e s i ss t 印sh a s r e c e i v e ds i 盟i 丘c a n ta t t e i l t i o n i nr e c e n ty e a r s t l l em a i n 嘶v i n gf o r c ef o ri n v e s t i g a t i n gm e p r o d u c t i o no fa c e t a t ei st h eh i 曲e re c o n o m i cv a l u e s ，o w i n gt oi t sw i d e rr a n g eo fa p p l i c a t i o n s i nm ec h 锄i c a li n d u s t t h eb i o p r o c e s ss t r a t e g ym a tr e s u l t si nt l l ep r o d u c t i o no fa c e t a t en o t o n l ya c h i e v e st h eo b j e c t i v eo fc o n t r o l l i n gp o l l u t i o na 1 1 dr e d u c i n gs l u d g ev o l 啪e sb u ta l s o e 伍c i e n t l ye ) 叩l o r e st h cr e s o u r c eo fo r g a n i cs u b s t a n c ei no r g a i l i cw a s t e i i lr e c e l l ty e a 峨m i x e d c u l t u r eb i o t e c l l l l o l o g y ( m c b ) h a l sb e c 0 m eav e 巧p r o m i s i n gd i r e c t i o no f v i r o l l n l e n t a l e n 百n e 舐n g o w i n gt om eu s e o fu n d e f i n e dm i x e dc u l t u r e s ，p r o c e s sd e v e l o p m e n ti nm c bc a i l o n l yb eb a s e do nn a t u r a l e c o l o 舀c a ls e l e c t i o nb ym a n i p u l a t i n gt h eo p e r a t i o no f t h eb i o p r o c e s s o r b yv a 嘶n gm es o u r c eo fm en a t u r a l i n o c u l u m i no r d e rt 0a c h i e v et h em a x i m u m a i l ds t a b l e p r o d u c t i o no fa c e t a t ei na c i d o g e n i cr e a c t o r s ，m e t h a l l o g 饥i ci n h i b i t o r s a r ec o 删 i l o l l l yu s e d s e l e c t i o np r e s s u 聆s b ya d d i t i o no fi 1 1 1 1 i b i t o r s ，s h o r t c h a i no 玛a i l i ca c i d sa i l do t h e ri n t e m e d i a t e m e t a b o l i t e sc a n n o tb ec o n s u n e db ym e t h a i l o g 饥i ca r c h a e aw i t h o u ta f f e c t i n g m e a c i d p r o d u c i n gm i c r o o r g a l l i s m s h e r ew et e s t e dm ee 仃e c t so fb e sa n dc h l o r o f o 肌o nan a n l r a lb a c t 谢a lc o m m u n i t yb y u s i n ge 1 1 v i r o n m e n t a lm i c r o b i a lm o l e c u l a rt e c h n i q u e st os t u d yt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e i l m i c r o b i a lc o m m u n i t vs t m c t u r ea 1 1 da c e t a t ea c c l i m u l a t i o n ，a i l dt oe l u c i d a t et l l ec o n t r i b u t i o no f d i 伍巳r e n tm i c r o b i a l 酉d u p sw i t l lr e s p e c tt om e n o wo fc a r b o na i l de l e c t r o n s ，a i r l dt h e nl a ym e t h e o r e t i c a lf o u n d a t i o nt oe i l l l a i l c ea c e t a t ep r o d u c t i o nb yu s i n ga 1 1 a 0 b i cd i g e s t i o n f o ro u r s t u d yw ec h o s ea i l a 0 b i c a l l yi n c u b a t e ds e w a g es l u d g e ，w h i c hi sa w e l l - s t l l d i e dm o d e ls y s t 锄 w i t hr e s p e c tt ot h eb a c t 甜a lc o m m 蚰时s t n l c t u r ea i l db i o c h e m i c a lp r o c e s s e s t h em a i n r e s e a r c br e s u l t so fm i sd i s s e _ n a t i o nw e r es h o w na sf o l l o w s ： 1 d e v e l o p m e n to fm o l e c u l a ra s s a y si n d i r 。c t l ym o n i t o r sh o m o a c e t o g e i l s 1 1 1 i t i a le x p e r i m e n tr e v e a l e dt h a t ，w i t l lf t h f sp r i m e rs e t ，5 5 o fc l o n e s ，o t h e rt l l a n a u t h e i l t i ca c e t o g e n s ，f e ui n t ot h ec l u s t c ro fs u l f a t er e d u c i n g b a c t 丽aa n do t h c rn o n - a c e t o g e i l i c m i c r o o 喀a j l i s m sb ys e q u e n c i n go fq u a n t i t a t i v ep c rp r o d u c t s n o v e lp r i m e r sf l a l l k i n gt l l e f t h f s 仔a g m e i l tw e r ed e s i 印e da i l dt e s t e d h i g l ls p e c i f i c i t ya n ds e n s i t i v i t yf o re s t i m a t i o no f m ea b u n d a l l c eo fa c e t o g e n sw e r ec o n f i m l e da n a l y s i so fac o l l e c t i o no fa c e t o g e n s ，c l o n e l i b r a r i e s 柚dm e l t i n g 吼v e s t h eu t i l i t yo ft h ea s s a yw a sv a l i d a t e da n du s e di nq u a l l t i 助n gt h c f t h f sg e n ep r e s e n ti nd i f f e r e l l ta 1 1 0 x i ca i l do x i ch a b i t a t s ad e t e c t i o nl i m i to fa p p r o x i m a t e l y 5 0 0t a r g e tm 0 1 e c u l e sp e ra s s a yw a sa c _ l l i e v e df o rd i f 衔e i l t1 肌g m 劬舯e l 】峪q u a n t i f i c a t i o i l ， w h i c hc o r r e s p o n i e dr o u 曲l yt o10 4t a 略e t sp e r 伊锄o fd 巧s 锄p l e s t h ea b u n d a j l c eo f f t h f sg e n er e c o v e r e db yf 1 1 s 1a s s a yw a si nm eo r d e ro fm a 舻i t u d eo f10 3u pt ol0 c o p i e s p e r 蓼锄o fd r yw e i 曲ts 锄p l e ，a n dt h em a ) 【i m 啪c a l c u l a t e da b u n d 锄c e o fa c e t o g e n sr e l a t i v e t o 函1 6 口c 纪以口w a so 6 一o 9 ，c o n f i n n i n gt h el o wp r o p o n i o no fa c e t o g e f l st ot o t a lb a c t e r i ai n e n v i r o n m e n t s 2 i i l l l i b i t o 巧e 彘c t o fm e m a l l o g e n i ci r d l i b i t o r so nm es p e c i f i ca c t i v i t yo fm e s o p m l i c a n a e r o b i c a l l yd i g e s t e ds l u d g e i i l a b s t r a c t t 1 1 eo b j e c t i v eo f “ss t i l d yw a st 0e v a l u a t et h ei i l l l i b i t o 巧e 彘c to fb e sa n dc h l o r o f o m t o w a r d st h em a i na n a e r o b i cm i c r o b i a lp o p u l a t i o n si n v o l v i e di l lv a r i o u sm e t a b o l i cs t 印so f a n a e r o b i cd i g e s t i o np r o c e s s e s ，s u c ha sa c i d o g e n i c 颤m e l l t a t i o n ，s y i l 缸d p l l i ca c e t o g e i l e s i s ，a i l d m e t h a i l o g e l l e s i s t h er e s u l t so fs h o r t t e mb a t c hb i o a s s a y si n d i c a t e dm a tm et o x i c i t yv 撕e d w i d e l yd 印e n d i n go nt h em i c r o b i a lp o p u l a t i o n h y d r o g e n o 们p h i cm e m a i l o g e l l sa p p e 孤硼t o a d a p tr a p i d l yt ot o x i c a n t s t h ec o n c e n t r a t i o n so fb e sa i l dc h l o r o f i o 肌c a u s i n g5 0 m e t a b o l i c i i l l l i b i t i o n ( i c 5 0 ) w e r e8 7m m a n do 0 0 9 ，r e s p e c t i v e l y h o w c v t h ei c 5 0o fa c e t o c l a u s t i c m e t h a i l o g e n sw e r e5 8mma n do 0 0 6 ，r e s p e c t i v e l y t h em e c h a l l i s m sr e s p o n s i b l ef o rm e m i c r o b i a l t o x i c i 够 o f m 甜l a n o g 枷c i 1 1 l l i b i t o r st o w a r d s 酉u c o s e ，p r o p i o n a t e a n d b u t y r a t e u t i l i z i n gm i c r o o r g a i l i s m sw c r ef a i r l yd i 行e r e n t c h l o r o f o m lt r e 舳e n ts i 印i f i c a l l t l y r e d u c e dm e 百u c o s e f e 肌e n t i n ga n df 撕ya c i d d e 黟a d i n ga c t i v i t y w h i l eh i 曲c o n c e i l t r a t i o n so f b e so n l yc a u s e das l i g h t l yt h e m o d y n 锄i ci i l l l i b i t i o n r a k i n gi n t oa c c o u n tt h ea c i d - p r o d u c i n g a 1 1 dm e t h a i l ei 1 1 1 l i b i t i n ge m c i e n c y ，t h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o no fb e s 锄dc h l o r o f i o n i lw ec h o s e w e r e5 0m ma l l do 0 5 ，r e s p e c t i v e l y 3 e f i e c to f 础；b i t o r so nt h eq u a i l t i t ya n dd i v e r s 时o f a c e t a t e - c o n s 啪i n gc o m m 咖i t y t h et - i 强l pf i n g e 印r i n t i n ga 1 1 dt h er e a l - t i m ep c rr e s u l t ss u g g e s t e dm a ti n h i b i t i o n t r e a t m e n t si n n u e n c e dn o to n l yt h eq u a n t i t yb u tm ed i v e r s i t yo fa r c h a e a lc o m m u n i t y a st h e a c e t o c l a s t i c 朋毒珈口，zd - ，口e 砌c e 口p w a sm o r es e n s i t i v et h a n h y d r o g e n o t r o p h i c 朋台砌口咒d 施c 胞，缸z 皤a n d 朋罾砌口，z d m f c 加6 砌z 酷，t h en i c h ev a c a t e db y 朋台砌口订口p 细c e 口pw a s 黟a d u a l l yf i l l e d w i t hh y d r o g e n o t r o p h i cm e t h a i l o g e n s t h u s ，e v e nt h o u g l lm ea c e t o c l a s t i c m e t h a n o g e nw a si n h i b i t e db yr e l a t i v e l yl o wc o n c e n t r a t i o nt o x i c 龇l t a c c t a t ec o u l ds t i l lb e u t i l i z e ds y l l n d p l l i c a l l yb yc o n s o r t i ao fa c e t a t eo x i d i z i n gb a c t 鲥aa n dh y d r o g e i l o t r o p h i c m e t h a n o g e n 4 s u c c e s s i o no fb a c t e r i a lp o p u l a t i o n su n d e rs u p p r e s s e dm e t h a n o g e n e s i s m u l t i v 撕a t et r f l pd a t as t a t i s t i c a la n a l y s e ss u g g e s t e dm a tb o mt h et o x i c a n t sn o to n l y i r l l l i b i t e dm e t h a n o g e n i ca c t i v i t yb u ta l s oc o n s i d e r a b l ya l t e r e dm eb a c t e r i a lc o m m l m i t y s t r u c t u r e a l t h o u 曲b yn om e a n sa l l ，s p e c i e so fl o w g + c 衲瑚p o s i t i v eb a c t e r i a ( s 驴比加胁) ，h 诎g + c 彳c 砌d 删幼a i l du 1 1 c u l t u r 钮国肠心刀础s h o w e dr e l a t i v e l y 廖e a t e rt o l e m c eo fc h c l 3 ， w h e r e a sb e sc l u s t e rw a sc h a r a c t e r i z e db yp r e v a l e n c eo f h y d r o g e n o x i d i z i n gs p e c i e s ( 知d ，? p ，缸s p a n dg 爸d 6 口c 五p ，纱d j l 口冒p 玎印 f 觑s ) g r 锄- n e g a t i v e b a c t 舐as u c h 弱肋c 地，d 沈部a i l d 句优p ，琴话纪，t e n d e dt ob ei n d i r e c t l ys u p p r e s s e db y u n d i s s o c i a t e do r g 枷ca c i d s nw a sa l s on o t e w o n h yt h a tu pt oh a l fo fh y d r o l 如ca l l d f 嘶n e n t a t i v es p e c i e sw e r ei n s e n s i t i v e ，s i n c et h e i rt r f ss h o w e dn o ts i g n i f i c a n tc o r r e l a t i o nt o e n v i r o l l 】 i l e n t a lv 撕a b l e s ( s p e c i e sf i t o 15 ) 5 s e c o n d a r yf 锄e n t e r su n d e rs u p p r e s s e dm e t h a i l o g e n e s i s c h l o r o f o mn o to n l yi n h i b i t sm e t h a n o g e n e s i s ，b u ta l s oi r l l l i b i t sh o m o a c e t o g e n e s i s i h e 乃sg e n ec o p yn 啪b e r se x p o n e n t i a l l y 出o p p e d 舶mt h ev e r yb e 百衄i n ga 1 1 dm e ns t a y e da t a b o u t3 o 10 6m l 1m l t i lt l l ee n d w i mb e s ，h o w e v e r ，l ef a v o r a b l et h c n l l o d y n 锄i c c 0 n d i t i o n ( g 2 0t o 一2 4l ( jm 0 1 ) c o u p l e dw i t ht l l ei n c r e a u s eo f _ ，瓤g e n ec 0 p yn u m b e r s i v a b s t r a c t ( 1 5 f o l d s ，p = o 0 2 ) i n d i c a t e dm a th o m o a c e t o g e n e s i s 丘d mh 2 c 0 2w a ss t i m u l a t e du n d e r s u p p r e s s e dm e t h a i l o g e l l e s i s f o r 缸恤e rl l l l d 盯s t a j l d i n gt h ed y l l 锄i c so fs y i l t r o p l l i ca c e t o g 锄1 c b a c t 甜a ( s a b ) l l l l d e rs u p p r e s s i v ec o n d i t i o n s ，f l u o r e s c 饥t 砌j 泐h ) ，b r i d i z a t i o nt a r g e t i n g16 s r d n ag e n e sw e r ep e 墒彻e d i nb o t h 骶拍m e n tg r o u p s ，t h en 啪b e r so fs a bd e c r e a s e d s i 辨i f i c a i l t l yo v e rt i m e 1 1 1 ed e i l s i t i e so fs ) ，i l t r o p h i cp r o p i o n a t e o x i d i z i n gb a c t 耐a ( s p o b ) a n d s v i l 们p h i cf a t t ya c i d - 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p r o d u c i n gf a t t ya c l d d e g r a d e r sa i l dh y d r o g e n - u t i l i z a t i n gh o m o a c e t o g e i l sw 嬲s t r e n g m e n e d m o r e o v 【2 - h c 】 a c e t i ca c i dd e 龋a d a t i o ne x p 甜m e m ss h o w e dt h a tm ea c t i v i t yo fa c e t a t eo x i d i z i n gb a c t 舐aw 硒 c o n s i d e r a b l e l yl l i 曲u 1 1 d e rt h ec o n d i t i o n o f1 0 wh 2p a n i a lp r e s s u r e k e y w o r d s ：a n a e r o b i cs l u d g e ，a c e t a t e ，m e t h a j l o g e n i ci i l h i b i t o r ，m o l e c u l a re c o l o g y h o m o a c e t o g e n ，s y n t r o p l l i ca c e t o g e l l ，m e t h a i l o g e n ，o r g a n i cc a r b o nf l u x v 目录 目录 摘要i a b s t l a c t i i i 第一章绪论l 1 1 概述1 1 2 国内外研究现状及发展动态2 1 2 1 产甲烷微生物抑制机理与研究进展。2 1 2 2 产乙酸微生物研究进展6 1 2 3 微生物分子生态技术在厌氧菌群研究中的应用1 0 1 3 本论文的主要研究内容1 3 1