（环境工程专业论文）油污染对发光细菌和卤虫的急性毒性效应研究.pdf

中文摘要 摘要 随着海上石油运输量和船载量的增长，海上溢油事故的发生也随之增多，并 且溢油事故越来越大，这严重影响了海洋生态环境。为了定量化评估油污染对海 洋渔业及海洋生态环境损害的程度，开展油污染对海洋生物的急性毒性研究，提 供可靠的数据势在必行。 本文选取海域船舶大量使用的船用柴油、燃料油作为试验油种，采用a s t m ( 美国实验和材料协会) 的标准方法制备油的分散液，对发光细菌和卤虫进行急 性毒性研究，得到船用柴油和燃料油分散液对发光细菌的2 0 m i n - e c 5 0 分别为 1 0 1 3 、2 7 2 9m g l ，无影响最大浓度分别为o 5 3 、1 0 5m g l 。船用柴油和燃料油 分散液对卤虫的4 8 h - l c 5 0 分别为l o 6 3 、3 2 2 1m g l 。 为了得知溢油事故中使用消油剂给海洋生态环境引起的毒性效应，本文还开 展了添加消油剂后油的乳化液对发光细菌和卤虫的急性毒性研究，得到船用柴油 和燃料油乳化液对发光细菌的2 0 m i n e c 5 0 分别为4 3 3 、1 6 8 3 m g l ，无影响最大 浓度分别为o 3 4 、0 8 5 m g l 。对卤虫的4 8 h l c s o 分别为7 0 1 、2 0 2 9 m g ，l 。本文 选择船用柴油和燃料油，使用消油剂后，发现增强了油品对发光细菌和卤虫的毒 性。 为得到发光细菌抑光度随时间和浓度变化的规律，用船用柴油和燃料油的分 散液对发光细菌进行时间一浓度一抑光度的研究，得出随着时间的增加和浓度的 增大，抑光度增加。在此基础上，拟合了发光细菌的时间一浓度一抑光度三维关 系图，此结果的发现对油污染在不同时间对海洋生物的毒性影响评估很有意义。 为了得到低浓度油污染对生物生长、正常行为和外表的毒性效应，试验进行 了船用柴油分散液对卤虫体长发育影响的研究，发现小于o i m g l 时对卤虫生长 有刺激作用，表现为泳动空间较大、泳动频率较快、不聚堆、趋光性较弱；高于 o 1 m g l 有抑制作用，聚堆抱团和趋光现象尤其明显。 关键词：油污染；消油剂；急性毒性 英文摘要 r e s e a r c ho na c u t et o x i c i t yo fs p i l l i n go i l st o p h o t o b a c t e r i u m p h o s p h o r e u mzs p pa n d a r t e m i a a b s t r a c t t h ei n c r e a s i n gp e t r o l e u mt r a n s p o r t sa m o u n t sa n dt h eb o a t c a r r y i n gc a p a c 时a tt h e s e ah a sl e a dt om o r ea n dm o r eo i la c c i d e n t , w h i c hh a sa f f e c t e dt h em a r i n e e c o - e n v i r o n m e n tg r a v e l y i ti sn e c e s s a r yt os t u d yt h ea c u t et o x i c i t yo fo i lt oe v a l u a t e o i lp o l l u t i o n sd a m a g et ot h es e af i s h e r ya n dt h em a r i n eo r g a n i s m s t h i sp a p e rs e l e c t sm a r i t i m ed i e s e lo i la n dm a r i t i m ef u e lo i la so i ls a m p l e su s e di n e x p e r i m e n t s ，a d o p t st h es t a n d a r dm e t h o do fa s t m ( a m e r i c a ns o c i e t yf o rt e s t i n ga n d m a t e r i a l s ) t op r e p a r ed i s p e r s es o l u t i o na n de m u l s i o ns o l u t i o no fo i l ，a n dc a r r i e so u t a c u t et o x i c i t yr e s e a r c ho np h o t o b a c t e r i u m p h o s p h o r e u mzs p pa n da r t e m i a t h ee c s o v a l u ew h i c hi st h ed i s p e r s es o l u t i o no fm a r i t i m ed i e s e lo i la n dm a r i t i m ef u e lo i lt ot h e p h o t o b a c t e r i u m p h o s p h o r e u mzs p pi s1 0 1 3 ，2 7 2 9 m g l ，a n dt h en o - e f f e c t - m a x i m u m c o n c e n t r a t i o ni so 5 3 1 0 5 m g l t h el c s ov a l u ew h i c hi st h ed i s p e r s es o l u t i o no f m a r i t i m ed i e s e lo i la n dm a r i t i m ef u e lo i lt ot h ea r t e m i ai s 1 0 6 3 3 2 2 1 m g l r e s p e c t i v e l y i no r d e rt og e tt h et o x i c i t ye f f e c tb e i n gp u ti n t ou s ed i s p e r s a n t si no i ls p i l la c c i d e n t ， t h i sp a p e ra l s os t u d y st h ea c u t et o x i c i t yo fo i le m u l s i o ns o l u t i o nt op h o t o b a c t e r i u m p h o s p h o r e u mzs p pa n da r t e m i a t h e2 0 m i n - e c s ov a l u ew h i c hi s t h ee m u l s i o n s o l u t i o no fm a r i t i m ed i e s e lo i la n dm a r i t i m ef u e lo i lt ot h ep h o t o b a c t e r i u m p h o s p h o r e u mzs p pi s4 3 3 、1 6 8 3 m g l 。a n dt h en o e f f e c t - m a x i m u mc o n c e n t r a t i o ni s o 3 4 0 8 5 m g l t h el c s ov a l u ew h i c hi st h ee m u l s i o ns o l u t i o no fm a r i t i m ed i e s e lo i l a n dm a r i t i m ef u e lo i lt ot h ea r t e m i ai s7 0 1 、2 0 2 9 m g lr e s p e c t i v e l y t h i sp a p e r s e l e c t sm a r i t i m ed i e s e lo i la n dm a r i t i m ef u e lo i la st e s ts a m p l ea n dh a sf o u n do u tt h a t t h ea c u t et o x i c i t yt op h o t o b a c t e r i u mp h o s p h o r e u mzs p pa n da r t e m i ac a nb e s t r e n g t h e n e dt os o m ee x t e n ta f t e ru s i n gd i s p e r s a n t t og e tt h ei n h i b i t i o nl u m i n e s c e n c ea g a i n s tt i m ea n dt h ec o n c e n t r a t i o no ft h eo i lt o t h ep h o t o b a c t e r i u mp h o s p h o r e u mzs p p ，a n dt h ee x p e r i m e n tc a r r i e so u tt i m e 英文摘要 c o n c e n t r a t i o n - r e s p o n s er e s e a r c ht ot h ed i s p e r s es o l u t i o no fm a r i t i m ed i e s e lo i la n d m a r i t i m ef u e lo i l ，a n dr e s u l t si ni n c r e 勰i n gi n h i b i t i o nl u m i n e s c e n c ew i t l li n c r e a s i n g t i m ea n dc o n c e n t r a t i o n t h i sp a p e rf i t st h et i m e - c o n c e n t r a t i o n - e f f e c tt h r e ed i m e n s i o n a l d i a g r a m t h i sr e s u l ti ss i g n i f i c a n ti ne v a l u a t i n gt h et o x i c i t yd e g r e eo fo i l st om a r i n ea t d i f f e r e n tt i m e t h ee f f e c to fd i s p e r s es o l u t i o no fm a r i t i m ed i e s e lo i lt oa r t e m mi ss t u d i e dt og e t t h et o x i c i t ye f f e c tt ot h eg r o w t h , r e g u l a rb e h a v i o ra n do u t w a r da p p e a r a n c eo fm a r i n e o r g a n i s m si nt h el o wc o n c e n t r a t i o no i lp o l l u t i o n t h er e s u l t ss h o wt h a tt h em a r i t i m e d i e s e lo nh a ss t i m u l a t e dt h ea r t e m i aw h e ng e t t i n gl o w e rt h a no 1 m g l w h i l eh a s i n h i b i t o r ya c t i v i t yw h e nh i g h e rt h a no 1 m g l k e yw o r d s ：o i lp o h u f i o n ；d i s p e r s a n t ；a c u t et o x i c i t y 大连海事大学学位论文原创性声明和使用授权 原创性声明 本人郑重声明：本论文是在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果， 撰写成硕士学位论文 = = 油透鎏过筮堂细菌麴卤虫数鱼丝垂性塾廑盟窥：。除论 文中已经注明引用的内容外，对论文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本论文中不包含任何未加明确注明的其他个人或集体已经 公开发表或未公开发表的成果。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：槲鼢日年5 月冲日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“大连海事大学研究生学位论文提交、 版权使用管理办法”，同意大连海事大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论 文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连海事大学可以将本 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编学位论文。 保密口，在年解密后适用本授权书。 不保密( 请在以上方框内打 ) 论文作：鳅计降翩签名：敝 日期：归7 年岁月节日 油污染对发光细菌和卤虫的急性毒住效应研究 第1 章绪论 1 1 研究背景 海洋占了地球表面积的7 1 ，孕育了地球上的原始生命，为人们提供了丰富的 生产、生活和空间资源，是全球生命支持系统的重要组成部分。随着海上运输业、 捕捞业的日益繁荣，海上溢油事故的发生也随之增多，使得海域中石油污染的面 积和程度都在不断扩大加深，这严重影响了海洋生态环境，破坏了海洋生物赖以 生长、存活和繁殖的栖息环境，同时也破坏了海洋生态系统的结构和功能。 长期的石油污染不仅影响海洋生物的生长、发育和繁殖，造成渔获量减产，而 且还可以在海洋生物体内蓄积，不仅影响海产品的品质，重要的是可以通过食物 链影响人类的健康，曾经有报道指出，某些地区癌症的发病率高，就是食用石油 污染过的产品造成的。因此，石油污染对海洋生物的影响正f 1 益引起人们的关注 和重视。研究石油污染对海洋生物的毒性作用及毒理机制，有助于人们理解石油 污染的严重性，并为制定防治海洋石油污染措施提供依据。 1 1 1 世界和我国原油海上运输现状 由于地貌特征的原因，中东、独联体、非洲和中南美洲是原油主要的输出地区， 其中中东是最大的原油输出地区，每年原油的输出量占世界总出口量的一半左右。 亚太、欧洲和北美地区存在着严重的原油缺口，因此油进口主要集中在这三个地 区，其中原油进口量最大的是北美，其次是亚太。由此成本低效率高和便捷的海 上运输成为能源进口的第一选择，占世界油运总量的3 5 “。据交通部的消息，我 国的原油进出1 ：39 0 都是通过海上运输完成的 2 1 。 1 1 2 溢油事故的特点和危害 随着运输量和船载的增加，溢油事故发生频率也在增加。船舶航行中因事故 造成海上溢油，特别是油轮溢油事故可造成特别严重的污染。 海洋水体油污染是目前一种世界性的、严重的海洋污染。运输中发生溢油事 故具有突然性、危害性、长期性，它无固定的排放方式，来势凶猛，在很短时间 内往往难以控制；瞬时间一次大量排放，破坏性极大，它们的毒性和污染性会影 第1 章绪论 响到整个海洋环境的生态系统，进而也会打乱一定区域内人群的正常生活，给社 会造成巨大损失；它们与周围的环境可能发生进一步的反应或作用，需要人们投 入大量的人力和物力，花很长时间才能恢复。 1 9 9 6 2 0 0 5 年国内外重大溢油事件见附录1 。 1 1 3 油污染对海洋生物的影响 石油污染海洋，首当其冲的受害者是浮游生物，包括浮游植物和浮游动物。 它们在海洋中处于被动的游动状态，因此浮游生物一旦遇上漂浮在海面的粘糊糊 的油物质，就会被紧紧粘住，失去自由活动的能力，最后随油块一起冲上海滩或 沉入海底。其中单细胞藻类浮游植物是最易受油污染的海洋初级生物。再者就是 浮游动物，其中包括原生动物，轮虫，枝角类和挠足类动物。掘统计，浮游生物 的生产力大约占整个海洋总生产力的9 5 。浮游生物受到损害，就等于从根本上 动摇了海洋生物“大厦”的基础。浮游动物是鱼类等高级动物的丌口饵料，一旦 其受到污染，对海洋鱼类的危害也是无法估计的。 鱼类大多对油污染很敏感，当局部海区受到石油污染时，鱼类就会很快逃脱 或回避。但是当油污染面积很大，或者大量石油突然倾泄入海，即使成鱼也很难 逃脱厄运。因为他们在逃离前腮已经被粘糊糊的原油粘住了。呼吸变得困难，最 后窒息而死。在美国马萨诸塞州外海的一次溢油事故中，有大批鱼类死亡。3 天 后在这一海区捕到的鱼9 5 以上是死的。溶解在海水中的石油对鱼类的危害更 大，它可通过腮或体表进入鱼体，并在体内蓄积起来，损害各种组织和器官例。 石油对鱼卵和仔鱼的危害更加明显，仔鱼仔虾、卵以及仔鱼仔虾个体发育对石油 污染的毒性敏感程度要比成熟的鱼高1 0 0 倍 4 1 。 生活在海底的底栖动物，如海参、各种贝类、海星、海胆等，它们不仅受到 海水中石油的危害，而且还受到沉到海底的石油更大的危害。在一些石油污染比 较严重的海区采捕到的贝类、蛤、等煮熟后常常有一股浓烈的油臭味。 油污染的致死效应和对生境的破坏具有长期性生态影响。但是除某些种类的 鸟外，整个生物种群皆因此而濒于灭绝的现象则不多。 2 油污染对发光细菌和卤虫的急怿毒件效戊研究 1 1 4 化学消油剂的使用及对海洋生物的影响 化学消油剂亦称溢油分散剂。2 0 世纪6 0 年代中期海尔曼( h e l m a n ) 、克拉恩 ( k l e i n ) 和克诺普( k n t i p p ) 等三位科学家进行了用乳化分散剂消除海上浮油的 实验。化学消油剂用于处理海面溢油也有3 0 多年的历史。消油剂的大量使用始自 1 9 6 7 年t o r r e yc a n y o n 号油轮溢油事故，当时用于消除海面溢油的消油剂达1 0 0 0 0 t 之多，受影响海域的海洋生物和底栖生物几乎全部被毒死，生态环境的恢复期至 少需要几十年之久，让世界为之震惊【5 】。这次事故之后，许多科学家开始致力于 低毒高效化学消油剂的研制。从第一代产品到第三代产品。活性剂由阴离子发展 至聚氧乙烯非离子，非离子中又由醚型改换成酯型；溶剂由含大量低分子芳烃而 演变成液态石蜡；现代某些产品则用聚乙二醇为溶剂，同时消油剂产品也由溶剂 型( 普通型) 而发展至浓缩型。这一发展过程除了努力提高产品的乳化能力外， 降低产品的毒性是个重要追求目标，同时也注意到产品的生物可降解性【6 】。 化学消油剂中的主要成分是表面活性剂、溶剂和少量的助剂( 润湿剂、稳定剂 等) 。表面活性剂由亲油基团和亲水基团两部分组成，是消油剂中起主要作用的部 分。由于表面活性剂对油和水都产生亲合力，改变了油、水界面间的作用并极大 地降低了油膜的表面张力1 7 1 。消油剂通过亲油基团和亲水基团把油和水连接起来， 经机械搅拌混合和波浪的作用，使溢油分散成一个个水包油乳化粒子，随着水体 的自然运动扩散于水体之中( 见图1 1 ) ，大大增加了油与水的接触面积，使油易 于被微生物降解，从而加速了溢油的自然净化 羽。普通型消油剂含活性剂1 0 - 4 0 ， 浓缩型含6 0 - - - 7 0 ，用时掺5 - 6 倍的海水后喷洒。但是化学消油剂并不是从根本 上去除了油的污染，它只是加速了溢油在水中的降解，从而使水表面的油膜迅速 减少，减少溢油对滨岸带及水鸟的影响f 9 1 。而且化学消油剂本身对海洋生物就有 不同程度的毒害作用，目| j 消油剂毒性分级如表1 1 t 。 第1 章绪论 “百9 柏 9 # 粼黜 、弋运八， 奢 s 州- c 哺n tl o c - l 拇哪- m 警 、弋_ 萏写瑙r ， v r f m m h 慵ii e n e = 娜y 、7 ，7 ， 9 。一 r q p f i g 1 1 消油剂的作用原理 f i g 1 1h o wd i s p e r s a n t sw o r k 表l1 消油剂对海洋生物的毒性分级 t a b 1 1t h e t o x i c i t y sc l a s s i f i c a t i o n o f d i s p e r s a n t s t o m a r i n eb i o l o g y 1 2 研究现状 1 2 1 溢油污染急性毒性研究 有关化学物质的毒性试验方法已有广泛的介绍如o e c d ( 经济合作与发展组 织) 和a s t m ( 美国试验和材料协会) 的标准方法、水生生物急性毒性评价方法都 详细地规定了毒性试验的内容方法和操作步骤。关于油分散液和乳化液对海洋生 物的急性和慢性毒性主要集中在浮游植物、浮游动物和更高级的海洋动物，而对 于更低级别的发光细菌的急性毒性试验还未见报道。有必要建立一套用发光细菌 来检测油分散液毒性大小的方法。 ( 1 ) 对发光细菌的研究 近年来研究关于重金属和有毒液体化学品对发光细菌的毒性较多，发光细菌 4 油污染对发光细菌和卤虫的急性毒性效府研究 作为指示生物来评价受试物的毒性大小，具有快速方便等优点。该方法是7 0 年代 后兴起的一种微生物监测环境毒物的新方法，得到广泛的应用，随着技术的完善 和前处理技术的提高，发光细菌测定方法也应用在了更多的领域。 急性毒性方面：如张秀君用发光细菌法对2 6 个污染源废水样的毒性进行测定， 所得结果既与实际相符又与鱼的毒性试验结果帽一致，证明发光细菌监测工业废 水是可行的【】；党亚爱等用发光细菌评价了1 7 种燃料的毒性大小【1 2 1 。丁克强对提 取液中2 种汽油( 9 0 # 和9 3 样) 的毒性进行了研究，得出9 0 # 和9 3 # 汽油的土壤提取液 e c 5 0 值分别为8 3 5 m g l 和8 3 7 m g l ，这些结果为发光细菌毒性测试方法在石油产品 土壤生物毒性评价中应用提供了可能性【1 3 】。居荫诚等在舷外机用环境友好润滑油 及其生物毒性的研究中在国内第一次采用a s t m 规定的油的样品制备方法，对于基 础润滑油，当载荷率达至l j l 0 0 0 0 m g l 时，相对发光度为6 6 ，远大于5 0 ，可认为 基础油的为无毒【1 4 1 。 环境毒物基因方面：张秀君用发光细菌暗变种对化合物致突变效应进行了研 究，通过与a m c $ 试验方法进行比较，提出发光细菌暗变种试验可以作为一种测试 化合物致突变的方法，其灵敏度总体比a m c s 试验耐”】。李伟民等将自行构建的含 青海弧菌荧光酶基因质粒引入n a m e s 试验中发现其具有与a m e s 相关的性状，对各 类致突变效应有良好的反应【。赵华清等用明亮发光杆菌t 3 , , i x 种的暗变种t 9 1 7 1 菌株检测物质的基因毒性，可以极大的提高试验的灵敏度，提出发光细菌法是一 种非常有价值的生物试验方法io ”。吴慧清等进行了生物发光检测法和国标法监测 样品中活菌总数的比较研究，得出两者结果相吻合，而生物发光法更简单迅速【l 剐。 y a t e s 等对黄曲霉素b 1 、桔霉素等8 种霉菌素进行了发光细菌分析，结果发现8 种 霉菌的毒性次序与哺乳动物细胞毒性一致【1 9 】。 另外在发光细菌的急性毒性和鱼类急性毒性研究上一些学者也做了不少的研 究，表明其灵敏度和可靠性可以与鱼体9 6 h 培养测定的急性毒性相比较，表1 2 是美 国高级生物学家b u l i c h ，a a 博士以美国明亮发光杆菌n r r l b 1 1 1 7 7 菌株为代表 给出的发光细菌的e c 5 0 与鱼的9 6 h l c 5 0 值的比较【2 0 1 。 第l 章绪论 表1 2 发光细卤的e c ，o 与鱼的l c 5 0 值比较 t a b 1 2 t h ec o m p a r e o f p h o t o b a c t e r i u m p h o s p h o r e u m ls p p s e c 5 0a n d f i s h s l c s o ( 2 ) 对浮游植物的研究 6 油污染对发光细菌和卤虫的急性毒性效应研究 对浮游生物的影响分为对浮游植物和浮游动物。到目前为止，过内外关于油 类物质对藻类的影响已有不少的研究，总体来说分为急性毒性研究和非急性毒性 研究，也得到了比较成熟的结果，在这里也不再作细致的叙述。 ( 3 ) 对浮游动物的研究 大型水蚤( d a p h n i am a g n as 印a u s ) 、卤虫( a r t e m i as a l i n a ) 等浮游动物都具有 生活周期短、繁殖快、经济、方便易得、对毒物敏感和易于实验室培养等优点， 广泛的应用于水生生物毒理试验中。实验类型有急性毒性试验( a c u t e t o x i c i t y t e s t ) 、 阻碍生长试验( g r o w t hi n h i b i t i o nt e s t ) 、繁殖试验( s u r v i v a l r ep r o d u c t i o nt e s t ) 等a 卤虫是很好的受试生物，国外对卤虫的研究报道较多的是杀虫剂、消毒剂、 垃圾渗出液等对卤虫的毒性影响，国内研究的是有机磷农药、油田废水和单一化 学品等，关于用a s t m 标准制备油分散液对卤虫的急性毒性和非急性毒性还未见报 道。 国内外一些学者对卤虫进行了重金属、化学品、有机农药和油类物质的急性 和非急性毒性研究。王作敏研究t h 9 2 + 对卤虫( a r t e m i as a l i n a ) 的2 4 h - l c 5 0 ( 喂食) 值为o 0 1 4 m g l ，4 8 h l c 5 0 ( 不喂食) 值为0 o l l m g l 2 “。l i uz h e n 昏a o 等研究得出 硝基苯和苯酚对水蚤( d a p h n i am a g n a ) 4 8 h - l c 5 0 分别为1 4 4 6 m g l h 和8 7 8 m g l ， 对c a r a s s i a sa u r a t u s 的l c 5 0 分别为4 7 9 和7 8 3 m g l 1 2 2 1 ；王连生得出硝基苯、氯苯、 苯胺、苯对大型蚤的4 8 h - l c 5 0 值分别为3 7 1 5 、4 7 8 6 、5 2 4 8 和5 4 9 5 m g l 2 3 l 。王宏 等研究得出苯和甲苯对大型蚤4 8 h l c 5 0 值分别为4 7 9 和4 8 3 m g l 1 2 4 。张彤研究t 4 种石油化工污染物对卤虫的毒性效应，得出四种化工污染物硫氰酸钠、二甲基甲 酰胺、乙腈和丙烯腈l c 5 0 分别为2 5 3 7 0 、2 2 6 1 9 0 0 、1 6 0 5 0 0 0 和1 4 3 4 m g l t 2 5 1 。刘绮 在一种新的生物监测方法研究种得出k c n 、六六六、苯酚、苯等物质对卤虫的l c s o 分别为0 2 5 、4 7 2 9 、3 8 6 0 m g l 2 6 1 。周常义等研究了三唑磷对卤虫的急性毒性，得 到对卤虫的2 4 h - l c 5 0 为1 6 4 m g l ，4 8 h l c 5 0 为0 8 0 m g l 【2 7 】。杜鹃得出的对硫磷、甲 胺磷、辛硫磷、敌敌畏、乐果这五种农药对卤虫的4 8 h l c s o 分别为0 5 2 、5 4 、o 1 2 、 o 2 0 、1 8 0 m g l 1 2 舯。路鸿燕等研究了大庆原油、直流柴油、蒸发汽油和航空煤油对蒙 古裸腹蚤( m o i n am o n g o l i c ad a d a y ) 4 8 h - l c 5 0 值分别为9 8 9 、7 1 7 、3 5 2 、3 4 8 m g l ， 7 第l 章绪论 其混合物的4 8 l c 5 0 值为7 0 2 m g l 2 9 1 。 ( 4 ) 油污染对水产经济品种的研究 许多急性毒性试验都以重要的水产经济品种作为研究对象。在生物体整个生命 周期中以早期生命发育阶段对污染物最为敏感，因此利用鱼虾贝类的胚胎及仔鱼、 仔虾进行毒性实验，可以作为一种缩短的慢性实验，成为评价污染物最大容许浓 度很好的指标。吴彰宽等研究t 2 3 种毒物对中国对虾的急性毒性，发现石油烃和 其产物的毒性大小顺序为：汽油 煤油 轻柴油 原油 润滑油 3 0 1 。胜利原油对真鲷 ( p a g r a s o m u sm a j o r ) 、牙鲆( p a r a l i c h t h y so l i v a c e u s ) 及黑鲷( s p a r u sm a e r o c e p h a l u s ) 仔鱼的4 8 h l c s o 值分别为6 4 、1 3 7 和1 0 7 m g t , ，对牙鲆仔鱼和暇虎鱼9 6 h - l c 5 0 值分 别为1 6 、6 6m g l 3 1 1 。贾晓平和林钦测定了南海原油、扩柴油和2 舻柴油对斑节对 虾( e e n a e u sm o n o d o n ) 、曰本对虾( p e n a e u sj a p o n i c u s ) 、刀额新对虾( m e t a p e n a e u s e n s i s ) 3 种仔虾和黄鳍鳃( s p a r u sl a t u s ) 、黑鳃( s p a r u sm a c r o c e p h a lu s ) 、前鳞鲻 ( m u g i lo p h u y s e n i ) 和七星鲈( l a t e o l a b r a x j a p o n i c u s ) 4 种仔鱼的急性毒性，发现油类 对仔虾和仔鱼的毒性顺序均为：0 8 柴油 2 0 4 柴油 南海原油，而且油分散液的毒性大 于其水溶性组分3 2 1 。田力杰等总结国内外学者对海洋生物的毒性研究结果见表 1 3 1 3 3 1 。 表1 3 石油对各类群海洋生物的危害浓度 t a b 1 3t h eh a r mc o n c e n t r a t i o no f o i lt om a r i n eb i o l o g y 1 2 2 使用消油剂对水生生物急性毒性影响改变的研究 目i j 关于发生溢油事故后使用消油剂有弊还是有利一直是有争议的一个问 题，即使对目i i 低毒的消油剂也如此。虽然消油剂使用前均进行了毒性试验，包 8 油污染对发光细菌和卤虫的急性毒性效应研究 括：有效性、毒性、生物降解性和生物毒性关系试验，但是究竟其是否会加大对 海洋生态及海洋生物的影响等问题，目前尚缺乏生态学知识，还没有一致的看法。 国内外在添加消油剂前后油分散液和乳化液的毒性变化时做了大量的研究， 通常是对消油剂、分散液和乳化液对生物的毒性大小进行比较。如国内杨波等报 道说，双象i 号、g a m l e n 、奥妙能、碧浪宁8 6 8 、n a l f l e e t9 0 1 0 和c o r r e x i t9 5 2 7 六 种常用消油剂对菲律宾蛤仔、阿匍缀虎鱼、中华哲水蚤及中肋骨条藻都有毒性影 响，且毒性差异较大【3 4 】。国外有学者证明消油剂的加入增加了分散液对水生生物 的毒性【3 5 1 。i s m a i lg u l e e 等研究了加消油剂| j 后原油毒性大小的变化，对端足类动 物毒性大小分别为得到原油的分散液、c o r i x i t 9 5 2 7 乳化液和c o r e x i t 9 5 0 0 乳化液 的9 6 h - l c s 0 分别为3 1 0 0 0 m g l 、1 6 2 m g l 和1 4 8 m g l 【3 6 】。 相反的，另外的研究指出加消油剂后乳化液的毒性比单纯油分散液的毒性小的 多。s a r am 等证明原油的分散液和乳化液对o p a l l i d u s f g 的4 8 h - l c 5 0 分别为0 3 9 和 1 8 m g l ，他说造成这种结果的原因可能和溢油的化学组成的变化有关，而总石油 烃的增加对生物的毒性影响很小【3 7 1 。相似的，f u e i k 等发现尽管由于消油剂的加入 使总石油烃的浓度增加了，乳化液对各种海洋生物的毒性水平仍然小于石油分散 液的毒性【3 s 】。m i t c h e l lf m 等报道，原油分散液和乳化液对淡水生物i n v e r t e b r a t e h y d r av i r i d i s s i m a 的9 6 h l c 5 0 值分别为0 7 和9 0m g l 总石油剧3 9 】。s i n g e r 等的研究结 果表明原油分散液和乳化液对l a r v a lt o p s m e l t 的9 6 h - l c 5 0 值分别为( 1 6 3 4 4 0 2 0 ) 和( 2 8 6 0 7 4 7 3 ) m g l t 4 0 l 。 上述研究报道中，石油加消油剂f j 后的毒性比较有很大的差异，可能的原因有 两种，一是油浓度的表示方法不同导致结果不同】；二是所研究的生物不同，不 同生物种和门之间差异非常明显，对石油及其产品的耐受性也明显不同【4 2 l 。另外， m i t c h e l l f m 等的研究结果表明，导致原油急性毒性的成份是低分子量的烃即单环芳 烃而不是多环芳烃p 9 1 ，此观点被s a r a 等的研究所支持，s a r a 等在研究消油剂的加入 对原油毒性影响的研究中发现，气象色谱所能检测出的的毒性大的，低分子量的 烃浓度没有增加，而加入c o r e x i t 9 5 2 7 所引起的只是低分子量烃浓度的相对减小， 因此加入c o r e x i t 9 5 2 7 不能增加原油对p a l l i d u s 幼虫的毒性增加【3 _ 7 】。如c a r m e la 9 第1 章绪论 p o l l i n oa n dd o u g l a sa h o l d w a y 研究了原油的分散液、c o r e x i t 9 5 2 7 孚l 化液、 c o r e x i t 9 5 0 0 - 孚l 化液、c o r e x i t 9 5 2 7 和c o r e x i t 9 5 0 0 对五彩鱼仔鱼的l c 5 0 分别为1 2 8 、 o 7 4 、1 3 7 、2 0 1 和1 4 5 m g l 1 4 3 1 。也证实了上述两种说法。 作者在总结石油及其成品油污染对各种生物的毒性研究中发现，无论是对油品 分散液还是对乳化液的研究，其半致死浓度的差异都很大，分析其原因可能是由 于试验条件的不同、受试生物的不同、原油成分和杂质的含量不同和使用测定浓 度的仪器不同造成的浓度表示方法不同造成的，因此其可比性也非常小，有必要 建立一套比较合理、适用的石油毒性检验方法。 1 3 研究目的、内容和意义 1 3 1 课题来源及研究目的 课题来源：国家自然科学基金项目( 4 0 4 7 6 0 4 6 d 0 6 0 8 ) “g i s 支持下的突发 性海洋污染事故生物资源损害评估研究”。 目前，溢油污染问题已被联合国和我国列入“2 l 世纪重大议程”。根据国际和 国内有关法规和“谁污染谁治理，谁损害谁赔偿”的原则，污染事故的受损方有 权要求有关责任方对其损失给予及时赔偿或恢复。对于突发性海上溢油事故所造 成的渔业和生物资源损害程度进行定量评估是海事仲裁和经济索赔的重要内容。 目的我国尚缺乏有效的损害评估模式，常采用的专家调查等评估方法属于半定量 化估算，存在手段不统一和主观性较大等缺陷。因此定量化、准确的评估石油及 其成品油对海洋渔业及海洋生物资源的损失量就显得非常重要，此项目将基于数 值模拟方法建立海洋污染事故生物资源损害定量化评估模式。 石油污染对海洋生物的急性毒性研究开始发展和深入，但是大多数研究都集 中单纯的油分散液对经济品种鱼类和虾类的毒性影响，而对发光细菌和浮游动物 物的研究较少，且在国内还未见到参照a s t m 标准方法加消油剂i j 后对发光细菌 毒性大小的比较。因此本研究的目的就是探讨和建立石油、成品油及消油剂的使 用对发光细菌和浮游动物的毒性研究方法，在试验基础上获得石油、成品油及消 油剂对发光细菌和浮游动物的急性毒性数值，因为不同的物质对发光细菌的毒性 作用不同，只按标准测定固定时间2 0 m i n 下的急性毒性数掘还不能准确的来反应 1 0 油污染对发光细菌和卤虫的急性毒t 牛敛府研究 受试物质的毒性，因此本试验还研究了不同时间下样品对发光细菌的毒性效应， 得到发光细菌抑光度随时间和浓度的变化关系图，从而为定量化评估溢油对海洋 生物及海洋生态的损失量提供更为精确的基础实验室数据。 1 3 2 本文研究内容 本文选用发光细菌和卤虫为受试生物。两种种所选生物分别处于海洋食物链 低级和中级层次，有一定的代表性。 ( 1 ) 技术路线 图1 2 为本论文进行试验的总体设计。 ( 2 ) 具体实施 a 急性毒性试验部分 两种常用石油成品油分散液对两种受试生物的急性毒性研究； 石油成品油分散液对发光细菌和卤虫的急性毒性研究； 石油成品油添加消油剂前后对发光细菌和卤虫急性毒性的变化与比较。 b 石油成品油对受试生物致毒机理的探讨 对受油污染的发光细菌的发光量变化的原因和对受油污染的卤虫的急性毒性 以及体长发育，探讨其毒性机理； c 抑制率与时间和浓度关系的探讨 目前国外已有此方面的研究，但是每个国家根据其不同的国情和生物品种的 不同，研究结果的应用有不同的要求和使用条件，因此，为了更好的适应我国国 情，定量化评估溢油污染对渔业和生物资源的损害程度，本文将根据试验结果进 行初步探讨。 第1 章绪论 油分散液 对发光细 菌的毒性 试聆 加消油剂 后油分散 液对发光 细菌的毒 性试验 油分散液的制各 和浓度测定 对发光细菌的急 性毒性研究 对发光细菌的时 问一浓度一效应 研究 加消油荆后油分 散液的制备和浓 度测定 对发光细菌的急 性毒性研究 对发光细菌的时 间一浓度一效应 研究 油分散液对 卤虫的急性 毒性试验 加消油剂后 油分散液对 卤虫的急性 壳件 图1 2 试验路线 f i g 1 2e x p e r i m e n tr o u t e 剂最一效应关系 分析与讨论 时h j 一效应分析 与讨论 时间一剂量一效 应分析与讨论 总结与期望 1 3 3 本文研究意义 1 ) 生物毒性监测中物种的选择通常从生态学意义来考虑，如浮游生物、生物 的早期发育阶段、受污染环境的主导物种等。但是我国海洋石油污染排放监测物 种的筛选工作相对滞后，文献少有报道 4 4 1 。从生物的分类级别上来说，本文选取 处于最低等的一种特殊菌种一发光细菌作为受试物种，首次应用在评价油分散液 和乳化液对生物毒性大小的研究中，为海洋溢油损害评价的数据获得提供了一种 新的监测方法。 2 ) 本文研究成品油分散液及乳化液对发光细菌、卤虫的急性毒性，通过急性 毒性试验获得石油成品油对发光细菌2 0 m i n 半数抑制浓度数据，卤虫的2 4 4 8 h 急性毒性数据，由于消油剂的加入改变了油对生物的毒性，这些急性毒性数据为 石油污染损害评估提供了更可靠的依据。 油污染对发光细菌和卤虫的急性毒性效戍研究 3 ) 本文还就石油污染物对两种种生物的致毒机理做了一定的探讨，从多个方 面和角度对石油的生物毒性进行分析，为我国海洋石油污染的生物研究提供条 可供参考的途径。 4 ) 结合我国研究现状和实际情况，对现有的溢油生物损害程度与时间的关系 进行进一步探讨，使其更加适应我国溢油损害评估的需要，为定量的评价溢油对 海洋渔业及海洋生态的损失，以及在海事仲裁和污染事故赔偿索赔方面提供一个 可参考的数据。 第2 章实验材料和方法 第2 章实验材料和方法 急性毒性试验是指机体( 人或试验动物) 一次接触或2 4 h 内多次接触毒物后， 在短期( 最长到1 4 天) 内所发生得毒性效应，包括一般行为、外观变化、大体形 态变化以及死亡效应。 2 1 试验油品的确定 石油污染是海洋水域最严重的污染问题之一，并且它是一种成分十分复杂的 天然混合物。在精炼过程中可分馏出汽油、煤油、柴油、润滑油、裂变原料油、 渣油等产品。研究表明各种分馏物的毒性是不一样的，因此本文选取海域船舶主 要运输的、具有代表性的和具有潜在威胁的油种一船用柴油和燃料油，研究其对 发光细菌和卤虫的急性毒性，为保护海洋生态环境和环境损害评价提供基础资料。 2 2 试验材料 2 2 1 试验仪器 1 ) 主要仪器：生物毒性测试仪；数显磁力搅拌器；紫外可见分光光度仪； 2 ) 其他：超声清洗仪；倒置显微镜；照度计；恒温光照培养箱：温度计；日 光灯架；三角烧瓶；烧杯等。 2 2 2 试验药品 1 ) 分光纯石油醚； 2 ) 分光纯四氯化碳； 3 ) 其他：无水硫酸钠；硫酸；氯化钠等。 2 3 发光细菌急性毒性试验 生物发光是某些生物的一种生理现象，海洋生物中更为多见。自1 6 7 2 年 r b o y l e 观察到发光的菌体所发出的光易被化学物质抑制后，许多科学家相继对 细菌的发光效应进行了大量的研究。本世纪7 0 年代至8 0 年代初，国外科学家首 次从海鱼体表分离和筛选出对人体无害，对环境敏感的发光细菌，用于检测水体 1 4 油污染对发光细菌和卤虫的急性毒住效应研究 生物毒性。8 0 年代初我国引进了这项技术。并先后分离出海水型和淡水型的发光 细菌，用以检测环境污染物的急性生物毒性。 发光细菌是一类非致病的革兰氏阴性兼性厌氧细菌，亦称明亮发光杆菌，它 们在适当条件下经培养后能发射出肉眼可见的蓝绿色的光。细菌的发光过程是菌 体内一种新陈代谢的生理过程，是光呼