（环境工程专业论文）油田水样微生物群落结构分析及原油降解工程菌的构建和特性研究.pdf

摘要 我国是一个能源消耗大国，石油供需严重不平衡，已经成为制约我国国民 经济发展的重要因素之一。然而，由于各种原因，采油过程中都会有石油烃类 的溢出和大量含油废水排放，造成水体和土壤严重的污染。因此，油田生产迫切 需要能够提高采油效率以及减少污染排放的清洁生产技术。微生物采油技术( m e o r ) 利用环境中微生物对原油的作用提高石油产量，具有消耗低、无二次污染等优点，是 目前广受关注的减污降耗的油田清洁生产技术。而对油田环境中原本存在的“本源” 微生物群落的解析和调控是研究、开发和利用该技术的关键。同时构建原油高 效降解菌群，也为提高采油效率和高效处理含油废水奠定了技术基础。 本研究采用分子生物学方法t r f l p 和克隆文库分析方法对来自某采油厂 的三个区块( 联合站，注入井，油井) 的污水样和油井采出液样品中的微生物 群落结构进行了分析，发现三个区块水样中的细菌群落t r f l p 图谱相似性比 较低，说明其群落结构差异很大，同一个区块不同取样点的细菌群落结构差异 也较大，细菌的优势种群也各不相同，其细菌群落主要有四个类群：变形杆菌 ( p r o t e o b a c t e r i a ) ，拟杆菌( b a c t e r o i d e t e s ) ，脱铁杆菌( d e f e r r i b a c t e r e s ) ， 以及未确定分类的类群：而在水样古菌群落结构方面，不同区块的古菌群落结 构有着明显的差异。同一区块古菌群落结构相对稳定，来自同一地层环境的样 品相似性很高，古菌赖以生存的某种特定极端环境条件是决定其群落结构的主 要因素。通过利用t r f l p 的方法对油藏中的微生物群落结构进行分析监控， 可以避开微生物传统培养方法的各种缺陷，从而更客观准确的掌握油藏土著微 生物的种类数量及其在群落中的分配比例，然后为以后按比例构建混合菌剂， 进行外源投加，从根本上刺激提高采油微生物的数量和活性提供可靠的理论基 础和技术支持。同时，也为以后筛选构建高效原油降解菌群，解决石油污染生 物治理问题奠定了良好的理论基础。本次研究还通过电转化的方法将含有原油 降解功能基因l y s 的质粒p k s p h i l 2 通过电击导入宿主菌$ 2 5 a 1 的感受态中， 构建出一株具有原油降解功能的基因工程菌p k s 2 5 a 1 。通过原油降解试验，对 其原油降解功能进行鉴定。实验结果表明：该工程菌对复杂结构烷烃有较强的 降解能力，为高效处理含油废水提供了理论和参数依据 综上所述，通过对微生物群落结构的分析，准确的掌握土著微生物的种类 和数量，不仅为后续开发和应用减污降耗的油田清洁生产技术提供了理论基础， 也为筛选构建高效原油降解菌群，调控油田废水处理中微生物群落结构以及开 发高效废水处理工艺提供了理论依据。而构建原油降解基因工程菌的研究，则 为原油中重质成份的降解，改善原油流动性，提高采油率；进一步提高含油废 水处理效率提供了可靠的技术支持。 关键词：微生物群落t r f l p克隆文库基因工程菌原油降解 a b s t r a c t a sab i ge n e r g yc o n s u m e sc o u n t r y ，i m b a l a n c eo fo i ls u p p l yh a saf a c t o rw h i c h r e s t r i c t sc h i n e s ed e v e l o p m e n t h o w e v e r ，t h ei n j e c t i o no fp o l y m e rn o to n l yc o s tal o t o fe n e r g ya n dm o n e y ，b u ta l s oc a u s e ds e r i o u sp o l l u t i o ni ng r o u n d w a t e ra n ds o i l c l e a np r o d u c t i o n t e c h n o l o g yi no i l r e c o v e r yp r o c e s sw a sg i v e nm u c hm o r e a t t e n t i o ni nr e c e n ty e a r s m i c r o b i a le n h a n c e do i lr e c o v e r y ( m e o r ) i so n eo ft h e c l e a np r o d u c t i o nt e c h n o l o g i e s i tu s e dm i c r o b e sd o w no i lw e l l si no r d e rt oe n h a n c e t h ep r o d u c t i o no fm a r g i n a lo i lw e l l s t h eu t i l i z a t i o no ft h i sp r o c e s sc a ne x t e n dt h e l i f eo ft h ea v e r a g ew e l lw i t h o u ti n c r e a s i n ge x c e s s i v el i f t i n gc o s t sa n dt h es e c o n d a r y p o l l u t i o n h o w e v e r ，w i t h o u tk n o w i n gt h ei n d i g e n o u sm i c r o o r g a n i s m si nt h eo i l w e l l s ，m e o rc o u l dn o tb es u c c e s s f u l l ya p p l i e dt oo i lw e l l s t h u s ，t h ek e ys t e pi n t h em e o ri st h e i n v e s t i g a t i o no fm i c r o b i a lp r o c e s sa n dt h ed i s t r i b u t i o no f m i c r o o r g a n i s m si nt h eo i lw e l l s a tt h es a m et i m e ，i te s t a b l i s ht h eb a s i cb a c k g r o u n d f o rc o n s t r u c t i n gm i c r o b i a lc o m m u n i t yo fd e g r a d a t i o no fc r u d eo i la n dh i g he f f e c to f o i lw a s t ew a t e rp r o c e s s i n g i n t h i sp a p e r ，t h es a m p l ew a se x a m i n e df r o mt h r e es e c t i o no fo i lf i e l db y t e r m i n a lr e s t r i c t i o nf r a g m e n t ( t - r f ) l e n g t hp o l y m o r p h i s m ( t r f l p ) a n a l y s i sa n d c l o n el i b r a r i e sa n a l y s i so ft h e16 s r r n ag e n e so fb a c t e r i aa n da c h a e a la n dt h e f u n c t i o n a lg e n e s t h et r f l pp a t t e r n ss h o w e dl o wc o m p a r a b i l i t yi nb a c t e r i u m c o m m u n i t yo ft h e es e c t i o no fo i l f i e l d i no n es e c t i o no fo i lf i e l dt h eb a c t e r i a c o m m u n i t i e sw e r ed i f f e r e n td u et ot h ed i f f e r e n c eo ft h eo i lw e l l ss a m p l i n g t h e b a c t e r i a lc l o n el i b r a r i e sw e r ec o m p o s e do fb a c t e r i ar e l a t e dt op r o t e o b a c t e r i a ， b a c t e r o i d e t e s ，d e f e r r i b a c t e r e s ，a n ds o m eu n i d e n t i f i e db a c t e r i a h o w e v e r ，t h et r f l p p a t t e r n sb e t w e e nt h ea c h a e a lc o m m u n i t i e sh a dh i g h e rc o m p a r a b i l i t yi nt h es a m e s e c t i o no fo i lf i e l d s o m ee x t r e m ee n v i r o n m e n tw h i c ha c h a e a ld e p e n du p o ni sak e y f a c t o ro fd e c i d i n gm i c r o b i a lc o m m u n i t ys t r u c t u r e t r a n s f o r m e dp l a s m i dp k s p h il 一2 w h i c hc o n t a i nc r u d eo i l d e g r a d a b l eg e n el y s i n t ob a c t e r i u m $ 2 5 a1 b y e l e c t r o p o r a t i o n ，o i ld e g r a d a b l eg e n e t i c a l l ye n g i n e e r e dm i c r o o r g a n i s mp k s 2 5 a 1i s c o n s t r u c t e d b yt e s to fc r u d eo i ld e g r a d a b i l i t y ，t h ef u n c t i o no fo i ld e g r a d a b l e g e n e t i c a l l ye n g i n e e r e dm i c r o o r g a n i s mp k s 2 5 a 1i si d e n t i f i e d e x p e r i m e n tr e s u l t i n d i c a t e sp k s 2 5 a1c a nd e g r a d ec o m p l e xa l k y lh y d r o c a r b o n i tp r o v i d e st h eg i s to f t h e o r ya n dp a r a m e t e r i ns u m ，t h i ss t u d yp r o v i d e dt h eb a s i cb a c k g r o u n di nf u r t h e ra p p l i c a t i o no ft h e c l e a np r o d u c t i o nt e c h n o l o g yi no i lf i e l d ，a n ds e tu pm e t h o d sf o rd e v e l o p i n gh i g h e f f e c t i v eo i lp o l l u t e dw a s t e w a t e rb i o t r e a t m e n tt e c h n i q u e sb ya n a l y s e o fm i c r o b i a l c o m m u n i t vs t r u c t u r em i c r o o r g a n i s m h o w e v e r ，t h es t u d yo fg e n e t i c a l l ye n g i n e e r e d m i c r o o r g a n i s mp r o v i d es o l i dt e c h n i c a ls u p p o r tf o ri m p r o v i n g l i q u i d i t yo fo i la n d k e yw o r d s ：m i c r o b i a lc o m m u n i t y ；t r f l p ；e l o n el i b r a r y ；d e g r a d a t i o n o f c r u d eo i l ；g e n e t i c a l l ye n g i n e e r e dm i c r o o r g a n i s m ( g e m ) 插图清单 1 1t r fl p 分析原理4 1 2t r fl p 图谱5 3 1 联合站样品细菌l6 s r d n a 的t r f l p 图谱l9 3 2 联合站样品细菌t r f 堆积图2 0 3 3 联合样品细菌群落结构加权聚类分析结果2 0 3 4 注入井细菌16 s r d n a 的t r f l p 图谱2 2 3 5 注入井样品细菌t r f 堆积图2 2 3 6 注入井样品细菌群落结构加权聚类分析结果2 3 3 7 油井样品的t r fl p 图谱2 5 3 8 油井样品细菌t r f 片段堆积图2 5 3 9 油井样品细菌群落结构加权聚类分析结果2 6 3 10 样品细菌群落结构多样性指数2 6 4 1 联合站样品古菌16 s r d n a 的t r f l p 图谱33 4 2 联合站样品古菌t r f 堆积图34 4 3 联合站样品古菌群落结构加权聚类分析结果一34 4 4 注入井样品古菌l6sr d n a 的t r f l p 图谱35 4 5 注入井样品古菌t r f 堆积图36 4 6 注入井样品古菌群落结构加权聚类分析结果37 4 7 油井样品古茵16s r d n a 的t r f l p 图38 4 8 油井样品古菌t r f 堆积39 4 9 油井样品古菌群落结构加权聚类分析结果39 4 1 0 样品古菌群落结构多样性指数4 0 5 1l y s 基因阳性验证电泳图45 5 2 空白对照原油气相色谱峰图4 6 5 3 工程茵p k s 25 al 原油气相色谱峰图4 6 5 4 宿主茵s 2 5al 原油气相色谱峰图4 6 5 5 原油族组份含量变化图4 8图图图图图图图图图图图图图图图图图图图图图图图图图图图 表2 1 表2 2 表2 3 表2 4 表2 5 表2 6 表2 7 表3 1 表3 2 表4 1 表4 2 表5 1 表格清单 p cr 反应体系l0 p cr 引物列表l0 酶切位点l l 酶切体系1 1 构建克隆文库所需试l2 菌落pcr 扩增体14 质粒提取所需试剂l5 细菌克隆文库分型结果2 7 细菌克隆文库与g e n b a n k 比对结果29 古茵克隆文库分型结果40 古菌克隆文库与g e n b a n k 比对结41 气相色谱峰面积数据4 7 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得 金起些太堂 或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：函各1 爱 签字日期：2 矾年月房日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解金壁王些盔堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授 权金壁王些太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 酝藤 签字日期：沙殆年月，日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： ( 吖研泛延彳予绷夕 f 夕 导师签名： 签字日期： 电话： 致谢 衷心感谢导师周元祥副教授。在研究期间，他对本人进行了精心指导，耐心帮助 本人解决课题中遇到的问题。在本论文的完成过程中，他进行了认真和仔细的指导。 他严谨的治学态度将使本人终生受益。 在北京大学实验期间，吴晓磊教授，余素林博士对本人进行了热心指导与帮助， 不胜感激。感谢同组师兄、师姐、同学在学习与生活中给与本人的热情帮助和支持! 感谢父母亲对我的物质、精神支持以及为我创造的良好生活环境，使我能够有更多的 时间和精力投入学习和工作中去。 当然，还要感谢硕士研究生期间传道授业的老师、携手共进的同学以及关 心支持我的所有人。有了你们作坚强后盾，我的人生之路必将走得更加稳健和 踏实。 第一章绪论 1 1石油工业的环境问题以及油田清洁生产技术 1 1 1石油工业的环境问题 从人类开始利用石油资源，采油过程就不可避免的对水和土壤环境造成污 染。随着石油资源越来越广泛的应用，环境中的石油污染也越来越严重。在石 油开采过程中，由于采油废水的排放、井喷、泄漏、检修等原因，都会有石油 烃类的溢出和排放，造成周围水体和土壤严重的石油污染。研究表明石油类污 染会危及人类和其他生物健康，具有致癌、致畸、致突变等危害【1 1 据相关资料 统计，我国石油企业采油废水产生量在1 9 9 6 年、1 9 9 7 年、1 9 9 8 年分别为：6 8 4 2 6 万 吨、7 2 8 0 8 万吨、4 1 0 4 8 万吨；采油废水经处理后分别外排：3 6 9 6 万吨、3 9 5 9 万吨、 2 8 2 6 万吨；但外排废水抽查达标率仅为3 4 、2 3 和5 1 2 1 。而且近几年，采油行业 废水排放量不断增大。比如胜利油田经过3 0 多年的开发建设，其石油开采已处于“三 高”阶段【3 】。目前采出液的综合含水率达9 0 以上。 在石油开采方面，早期的油田开发主要是依靠天然能量消耗开采，一般采 收率仅5 1 0 ，称为一次采油；二次采油是依靠人工补充油层能量的物理作 用提高采收率，通常采用人工注水或注气，保持油层压力，采收率可提高到 3 0 - 4 0 ；三次采油是在注水保持油层压力基础上，又依靠注入大量驱油剂， 比如聚合物、表面活性剂、碱剂等，改变油层流体粘度、组分和相态，具有物 理、化学双重作用，不仅进一步扩大了注入水波及范围，而且使分散的、束缚 在毛细管中的残余油重新聚集而被采出【4 】。然而油田原油在外输或外运之前必 须将采出液进行油水分离，合格原油允许含水率为0 5 以下，油水分离产生含 有聚合物的采油污水【5 】。该采油污水中仍然含有较高浓度的石油和化学聚合物， 一旦排放到环境中，将造成严重的水体和土壤污染，因此必须对其进行进一步 的处理。 1 1 2油田清洁生产技术 考虑到环境和经济因素，石油开采中迫切需要开发和应用减污降耗的清洁 生产技术，其中微生物采油技术就是一项替代聚合物采油的减污降耗的清洁生 产技术。其机理是：1 利用微生物改变原油组成，改善流动性，使其变成低粘 度原油。2 利用微生物改变驱油环境，如由微生物新陈代谢产生的生物表面活 性剂，生物气，酸和有机溶剂加大原油的溶解性和流动性。3 微生物的直接作 用，通过在岩石表面上的生长占据孔隙空间，用物理的方法驱出石油，或改变 碳氢化合物的馏分。使微生物粘附到岩石表面，在油膜下生长，最后把油膜推 开，使油释放出来。与其他采油技术相比，微生物采油技术具有明显的优点1 6 j ： 成本低，微生物的主要营养源之一是用通常手段难以采出的石油重质组分， 微生物的繁殖能力和适应性强，作用效果持续时间长，这尤其对边际油田吸引 力大；m e o r 工序简单，利用常规注入设备即可实施，不必增添井场设备， 比其他采油技术实用且操作方便；应用范围广，不仅可开采各种类型的原油 ( 重油、轻油、中质原油) ，更适于开采重油；m e o r 产物均可生物降解， 不损害地层，不会造成环境污染。可以大大减少开采用水量，减少含油污水 排放量。 根据利用的微生物来源不同，微生物提高原油采收率技术可以分为外源微 生物采油技术和内源微生物采油技术两种。前者主要利用在实验室内模拟油藏 条件下从油污染土壤或污水中筛选出合适的细菌，将其注入地下；后者则直接 利用地层原有的内源微生物群落，通过添加营养激活剂，并注入一定量的空气， 直接激活地下的有益内源微生物群落如烃类氧化菌、产甲烷菌等。目前该项技 术在国内外的油井中均得到了应用【7 l 。1 9 5 4 年，美国率先成功地进行了矿场 试验，随后在2 0 世纪5 0 年代末期到7 0 年代，前苏联和东欧一些国家、加拿大、 澳大利亚及中国也开展了微生物采油研究，并进行了不少矿场试验。微生物采 油技术由于1 9 7 3 年的石油危机得以重视并加速了其发展。 然而传统的微生物采油方法没有充分考虑油井当中本土的微生物群落结构 对采油微生物的影响，更不能在油井中通过人为调控来构筑高效的采油微生物 群落以针对性地并且保持长期高效地进行微生物采油。往往注入的外源微生物 可能受到本土微生物群落的抑制而丧失功能，注入的微生物营养液也可能会在 油井中其它土著微生物的作用下消耗，失去激活采油微生物的意义。到目前为 止，所有微生物强化采油技术开发路线的先天不足是微生物强化采油技术开发 的瓶颈。要突破这个瓶颈，关键是要能够充分了解各个油田甚至油井的微生物 的群落结构；掌握当地微生物群落中哪些是有效微生物，并且能够使它们高效 地进行采油；了解什么样的条件可以针对性刺激或扶持当地可能暂时处于弱势 但是能够高效采油微生物，使他们活性增强，从而充分发挥它们的本土化优势、 强化它们的采油能力。微生物采油技术就是对油藏环境中微生物群落进行定向 调控的技术，其关键在于如何对油藏环境微生物群落结构的解析和认知。实际 上，油藏环境是复合高温、高压、高矿化度和贫营养等特殊条件的复杂环境， 油藏生态环境分析结果已表明，微生物在油层中的分布有一定的规律。解析不 同油藏中各种不同生理类群的微生物组成为提高微生物采油的有效性和针对性 奠定了坚实的基础。同时，也为调控含油废水处理中微生物群落结构以开发高效废 水处理工艺提供了理论参考。 目前，尽管国内外对m e o r 进行了长期的研究，m e o r 技术应用上还存在 很多问题，包括：外源微生物注入油藏后，效果不能长久，而且重复性差等， 2 使得该技术的应用尚未形成规模。造成这种状况的原因是，将外源微生物投加 到油藏时，都忽视了油藏中“土著”微生物群落的存在，而比较随意性的对外源 采油微生物进行配伍。因此了解油藏的本源( 土著) 微生物的群落多样性和分 布变化，培养和筛选适宜的采油微生物，优化外源微生物的配伍方式或激活内 源微生物的调控措施，更高效地利用微生物提高石油采收率，减少生产用水量。 1 2 环境微生物群落结构分析研究概况 1 2 1环境微生物群落结构的研究方法 对环境微生物群落的研究方法目前可以分为两大类，一类是基于培养 ( c u l t u r e d d e p e n d e n t ) 的方法，另一类是不基于培养( c u l t u r e d i n d e p e n d e n t ) 的方法。 传统的培养方法设计特定的培养基对环境样品中的微生物进行培养，能够 分离出特定的菌株，对其在特定压力( 温度，p h ，压力) 下的功能进行研究。 但是这种方法具有一定的选择性，它只能培养适合实验室特定培养基和培养条 件的微生物，而样品中未知的微生物众多，环境中可培养的微生物的数量至占 总的微生物数量的0 0 1 1 0 【9 】。因此，在实验室条件下生长的微生物往往不能 反映环境中真实的微生物群落的结构，也不能准确地反应微生物群落的代谢功 能和关系【l o j 。 非培养的方法为生理学、生物化学和分子生物学的原理发展起来的三大类 新方法，基于微生物代谢生理学的方法b i o l o g 1 1 】，基于生物化学方法p l f a 谱 图分析法，以及基于d n a 和r n a 序列信息的分子生物学方法。这些方法力图 克服传统培养法的局限，对复杂样品中的微生物群落进行分析。这些方法中分 子生物学方法是近年来发展起来的分析方法法在评价微生物群落结构中具有快 速准确等特点【1 2 】。 核糖体r n a 基因( r d n a ) 是生物中最保守的基因。w o e s e ( 1 9 8 7 ) 通过 对各类生物的r r n a 序列进行分析，认为小亚基核糖体r n a ( s s ur r n a ) 即 1 6 s 或1 8 sr r n a 序列是用于系统进化及分类研究最合适的指标。通过对各类 生命有机体的s s ur r n a 序列比较分析，提出了生物界的三域分类体系：真核 生物( e u k a r y a ) 、细菌( b a c t e r i a ) 和古菌( a r c h a e a ) 。 微生物的1 6 sr d n a 是微生物染色体上编码1 6 sr r n a 相对应的d n a 序列， 存在于所有微生物染色体基因中，它的内部结构由保守区及可变区两部分组成。 其分子内存在的可变区，显示出微生物不同分类等级水平上的特异性。因此， 可以通过在保守区设计微生物的通用引物，扩增出微生物的1 6 sr d n a 片段， 根据16 sr d n a 可变区的差异来区分不同的微生物，收集群落结构信息。 随着分子生物学技术的发展，利用1 6 sr d n a 对微生物的群落结构进行研 究成为可能。以p c r 为基础建立起来的方法被广泛应用在特殊微生物和群落微 3 生物，以及特殊基因的研究中，也被大量的应用在评估石油微生物群落的研究 中【1 3 】。该方法具有传统方法无可比拟的优点，跳过培养细菌的步骤，直接对环 境样品中的细菌进行检测。基于d n a 或者r n a 信息进行分析的方法有变性梯 度电泳法( d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ，d g g ed 4 j ) ，末端限制性 片段长度多态性法( t e r m i n a lr e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ， t r f l p ) ，r r n a 寡核苷酸杂交法，克隆文库( c l o n el i b r a r y ) 等。细胞固定 分析方法主要为原位荧光杂交法( f l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) 【l5 1 。 但是大量的研究表明，与d g g e 1 6 1 7 】或r f l pd 8 1 相比，t r f l p 技术分析复杂 的微生物群落结构具有更高的分辨率，更适合于对微生物群落多样性进行灵敏 的分析评价，以及快速地研究、分析微生物群落的变化规律。 1 2 2t - r f l p 方法 t r f l p ( t e r m i n a lr e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，末端标记限 制性片段长度多态性) 是基于r f l p 技术建立起来的【l 引。t r f l p 技术以分子 系统学的原理为基础，综合运用了p c r 技术、d n a 限制性酶切技术、荧光标 记技术和d n a 序列自动分析技术，在d n a 水平上通过对特定核酸片段长度多 态性的测定来分析比较微生物群落结构和功能。该方法的全过程如图1 1 所示 【l9 1 。首先根据序列的保守区设计引物，其中一个引物的5 端用荧光物质标记。 提取环境样品中的总d n a ，然后以它为模板进行p c r 扩增，所得的p c r 产物 一端就带有这种荧光标记。然后用限制性内切酶消化p c r 产物。不同菌的扩增 片段的酶切位点存在差异，酶切后会产生许多不同长度的限制性片段。消化产 物用d n a 自动测序仪进行检测获得峰值图，带有荧光标记的t r f 被检测到。 因为每种菌的t r f 长度不同，峰值图上的一个峰至少代表了一种菌。每个峰 所占据的面积占总面积的百分数就代表了该菌的相对数量。该方法自l9 9 7 年由 密歇根州立大学提出之后，被广泛的应用于环境微生物群落的监测中 2 0 - 2 2 1 。 提取总的d n a 5 i i iiiiiiii = = = = = 5 0 iiiiiiiii | ： 蜀翥端i：，c僦fi5 t 皿皿弓彻扩增靶序。巴【 口口 丁工 = 列 一燮画国 图1 1t r f l p 分析原理 f i g 1 1p r i n c i p l eo f t - r f l pa n a l y z i n g 4 d平毕l 璧 黼莲一 号一 采用t r f l p 技术，对环境样品中微生物群落进行以上各步骤的分析，最 后得到类似上图1 2 的该微生物群落的t r f l p 图谱。图中的横坐标表示限制 性片段的长度，纵坐标表示荧光强度。这种图谱是利用g e n e m a p p e r ( g e n e s c a n ) 等软件生成的，同时我们可以获得许多定量的数据，如图谱中峰的个数，每个 峰的峰高、峰面积以及该峰对应的限制性片段的碱基大小等等。利用这些信息， 就可以对所研究的微生物群落进行一些定性或定量分析。 一。 一 。i 一 图1 2t - r f l p 图谱 f i g 1 2 t r f l pp a t t e r n 图谱分析时，首先要确定一个峰检测规则，碱基大小处于一个合适范围( 如 9 4 , - - 8 2 7 b p 范围或6 0 - - 6 4 0 b p 范围或者2 0 - 1 6 3 2 b p 范围) 并且该峰的荧光强度 超过一定阈值( 比如5 0 r f u 或1 0 0 r f u ) 才被纳入后续的数据处理。j o h nd u n b a r r 等f 1 4 1 在其研究中设定峰检测阈值为2 5 r f u ，而o s b o r n 等1 2 1 在其研究中检测阈 值为1 0 0 r f u ，对此，j o h nd u n b a r r 等认为，提高检测阈值，虽然可使平行样品 t r f l p 图谱中的不可重复峰大为减少，但同时也会使一些可重复峰消失，造 成对群落多样性的低估。因此，作者建议的做法是【2 3 】：尽可能降低检测阈值， 但要通过平行实验，将那些在平行实验的图谱中重复被再现的峰纳入统计分析。 根据某个微生物群落的t r f l p 图谱，我们可以计算该群落相关指数。 ( 1 ) 物种丰度( r i c h n e s s ) ：s = 图谱中显著峰的总数，这里我们粗略认为每个峰对 应着一个不同的物种。 ( 2 ) 多样性指数：描述群落多样性的指数有很多，比如通过以上t r f l p 图谱， 可以计算s h a n n o n w e i n e r 指数：h = 一p il n ( p i )其中：p i 表示某个峰的峰高 占总峰高的比例。 但是单纯的t r f l p 分析方法只能提供微生物的种类和相对数量，无法确 定微生物的种类。要进行定性分析，还需要结合克隆文库或者核酸杂交分析。 2 克隆文库 构建克隆文库是将环境样品的d n a 进行目标片段扩增( 如1 6 sr d n a ) 产 物与载体分子重组，重组后转化宿主细胞，转化细胞在选择培养基上生长出的 单个菌落( 噬菌斑或成活细胞) 即为一个d n a 片段的克隆。建立基因文库后 需要结合适当筛选方法从众多转化子菌落中筛选出含有某一基因的菌落，再进 行扩增，将重组d n a 分离、回收，获得目的基因的克隆【2 引。 构建克隆文库的必需条件有3 个：外源p c r 产物；载体；宿主细胞。 5 通过构建克隆文库，可以对环境中的微生物群落进行定性的了解。将目标 条带或序列进行筛选，剔除重复序列，仅将代表性的、丰度较大的序列测序。 筛选后的回收序列进行序列测定分析，有了微生物16 sr d n a 序列，不论是全 长还是部分，都可以提交到g e n b a n k 采用b l a s t 程序与数据库中已知序列进 行相似性分析。g e n b a n k 将按照与测得序列的相似性高低列出已知序列名单、 相似性程度以及这些序列相对应的微生物种类。 运用分子生物学的手段末端限制性酶切片段长度多态性分析ft e r m i n a l r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，t - r f l p ) 对油藏中的微生物群落结构 进行分析监控，避开了微生物传统培养方法的各种缺陷，从而更客观准确的掌 握油藏土著微生物的种类数量及其在群落中的分配比例，然后为按比例构建混 合菌剂，进行外源投加，从根本上刺激提高采油微生物的数量和活性提供可靠 的理论基础和支持。 1 3基因工程菌构建的研究概况 1 3 1基因工程菌 石油类污染物主要化学成分是烷烃、苯、甲苯、二甲苯、复杂芳香烃、胶 质和沥青质等【2 5 1 ，这些物质中有的毒性很大，可能有致癌、致突变、致畸变作 用，因此它们已被列为重点污染物。特别是其中的多环芳烃，因有致癌、致畸、 致突变等活性和能通过食物链在动植物体内富集，它在土壤中的累积更具危害 性【26 。然而，土著微生物和外来微生物对环境中的原油污染物的净化能力明显 不足。通过采用基因工程技术手段，定向地构建高效降解难降解污染物的工程 菌研究则显示出了重要的实际意义【27 1 。然而，从另一方面看，复杂的芳香烃， 以及沥青质这些难降解的化合物，在石油中都属于粘稠度高，流动性较差的成 份，在石油的开采过程中，严重影响着开采效率，通过基因工程菌注入油井中 针对性的降解即将开采的原油，将其中粘稠度高，流动性差的成分降解为毒性 小，流动性好，易于开采的原油，从而降低了石油开采难度，提高二次或三次 采油的效率。 1 3 2基因工程菌构建 基因工程又称为转基因工程，就是按照人类的需要，用类似工程设计的方 式人为的，有目的的，有计划的通过基因克隆，转移以及表达等方式形成新的 生物种或类型【27 。2 0 世纪9 0 年代后期问世的d n a 改组技术可以创新基因，并赋 予表达产物以新的功能，创造出全新的微生物，如可将降解某一污染物的不同 细菌的基因通过p c r 技术全部克隆出来，再利用基因重组技术在体外加工重 组，最后导入合适的载体，就有可能产生一种或几种具有非凡降解能力的超级 菌株，从而大大地提高降解效率【2 8 。30 1 。一个完整的基因工程技术流程一般包括目 的基因的获得、载体的制备、基因的转移、基因的表达、基因工程产品的分离提纯等 过程【3 1 1 。工程菌的主要方法有：降解质粒转移，质粒分子育种，原生质体融合 6 技术，基因工程育种。 1 3 3基因工程菌的应用前景 在应用方面，c h a p r a c a r t y 等f 3 2 】为了消除海上溢油污染，将假单胞菌中不同 菌株的c a m ，o c t ，s a l ，n a h 4 种降解性质粒结合转移至一个菌株中，构建 成株能同时降解芳香烃、多环芳烃、菇烃和脂肪烃的超级细菌。该菌能将天然 菌要花年以上才能消除的浮油缩短为几个小时，从而取得了美国的专利权。在 污染治理工程菌的构建上，是第l 块里程碑。张小凡和小柳津广志将非降解菌 s p h i n g o m a n a s p p y 3 的总d n a 用限制性内切酶处理，经与质粒d n a 接种后，转 化到大肠杆菌j m l 0 9 中，构建成转基因工程菌j m l 0 9 p y 3 ，利用该菌进行模拟 生物修复实验，实验结果表明芳香化合物菲明显减少【3 3 1 。现代科学工作者把 p c r 技术用于基因工程菌的构建并已取得了一些成绩，国内外正在进行这方面 的研究【3 4 0 。随着生物技术的发展，基因工程菌在含油污水处理中以及清洁 生产中的应用将会进一步完善，为人类造福。 通过对原油降解基因工程菌的研究，针对原油中的重质成份进行有效的分 解，一方面可以降低了原油的粘稠度，改善了原油的流动性以及原油质量，进 一步提高二次或三次采油的采收率；另一方面，为有效进行含油废水的生物降 解，提高含油废水的处理效率奠定了坚实基础。 1 4目前微生物采油技术研究存在的问题 ( 1 ) 样品的局限性 大多数的试验样品来自水驱油田的井排水和回注水。这些样品无疑都含有 油、地层水以及油层化学处理所添加的注入流体等混合物，也不可避免的带入 了很多的杂质微生物，这些外来因素都可能使得微生物群落发生变化。样品无 法真实体现环境中的真实微生物群落，于是带来一个很重要的问题，即如何区 分土著菌和外来菌。如果不能很好的区分，人们从样品中分离或者检测到的细 菌一旦回到实际环境中很可能无法生长。将这些菌应用在微生物采油或者污染 修复中往往收效甚微。 ( 2 ) 缺乏采油过程中微生物群落结构变化研究 在采油过程中，由于人为的扰动，比如注水，添加聚合物等，微生物群落 的分布将发生变化，在微生物采油过程中，这种分布变化将会直接影响微生物 在油藏中的代谢作用，目前的研究多集中在单井或多井的一个时间点上油藏微 生物的群落变化，不能提供详细的微生物群落的分布变化。 ( 3 ) 基因工程菌的安全性 基因可以随着技术的发展和应用产生流动，并可能带来遗传污染，而用于环 境保护的工程菌都只能在进入自然环境以后才能发挥作用，因此如果产生不良 的后果，对环境的破坏也很大，而且他们易繁殖，对环境耐受能力和变异几率 也比较大一旦释放就很难控制【3 引。 7 ( 4 ) 基因工程菌的稳定性 通过穿梭质粒转移构建基因工程菌，质粒在宿主菌中的稳定性是一个很关 键的要素，而实验室模拟的试验条件以及筛选条件与实际环境中，有着很大的 差别，工程菌在高矿化度和贫营养等特殊条件下的含油污染物中，以及高温、 高压油藏环境下，质粒能否保证其稳定性还不能确定。 1 5研究目的和内容 本课题在国内率先采用分子微生物生态学的技术分析油田水中微生物群落 结构，为后续调控油藏环境微生物结构、提高石油采收率、开发减污降耗油田 清洁生产技术以及石油污染控制奠定理论基础，也为开发高效含油污水处理工 艺提供方法论参考，试验样品来自某油田某采油厂不同地点水样其中包括联合 站生活污水，注入井井口水样，井底反吐水样，和油井水驱，聚驱水样。研究 中采用分子生物学方法：t r f l p 分析方法和克隆文库分析方法。这两种方法 是不基于培养的分析方法，能够提供较为全面的微生物群落结构信息。主要分 析油藏微生物( 细菌和古菌) 群落16 s rd n a 多态性，得到油藏微生物群落l6 s r d n a 基因分布图谱，从分子水平上分析油藏不同区块中微生物的分布情况以 及不同样品中微生物群落中各种细菌和古菌的组成及其种群大小。从而避开了 传统方法对微生物的不可培养性和富集分离培养法的强烈选择性的缺陷。由于 将单一高效菌株投加到陌生的油藏环境中，无法融入到本土的微生物群落中成 为优势菌种，所以很难发挥其高效采油的特征，因此根据群落结构分析的结果， 用筛选出的高效采油微生物在维持原有基本的群落结构下，按原由群落结构比 例进行外源投加，提高其中高效采油微生物的比例及活性。再将其投入到含油 地层去，使其更有效的长期发挥高效采油的功能特点。同时，