（应用化学专业论文）含三氮唑杂环化合物的合成及生物活性研究.pdf

大连理工大学硕十学位论文 摘要 根据以d n a 为靶点抗肿瘤药物的作用机理，通过对平面性良好的1 ，8 一萘酰亚胺和 苊醌类化合物进行结构改造，本文设计、合成、表征了三系列以d n a 为靶点的抗肿瘤 化合物： 以c l i c kc h e m i s t r y 方法，设计、合成了一系列新型含1 ，2 ，3 三唑基的萘酰亚胺类衍 生物，并对其光谱性质、d n a 嵌入能力、d n a 光敏切割活性和抗肿瘤活性进行了研究。 荧光光谱法、粘度测定、圆二色谱法研究化合物与c td n a 相互作用的结果表明该化合 物具有一定的d n a 嵌入性能，嵌入常数为1 0 4 1 0 5 m ，可作为有效的d n a 靶向分子； d n a 光敏切割活性试验结果表明：该系列化合物具有较强的光敏损伤活性；抗肿瘤活 性研究结果表明该系列化合物具有明显的体外抑制肿瘤细胞生长活性，特别是带有硫吗 啉基取代的化合物n 2 对7 7 2 1 肝癌细胞有很高的抑制活性，i c 5 0 值达到0 4 7 8 p , m 。 以c l i c kc h e m i s t r y 方法，设计、合成了一系列新型含1 ，2 ，3 三唑基苊并杂环类化合 物，对其光谱性质、d n a 结合能力、d n a 光敏切割活性和抗肿瘤活性进行了研究。紫 外光谱法、粘度测定、圆二色谱法研究化合物与c td n a 的作用模式为部分嵌入，并伴 随一定的静电堆积；d n a 光敏切割试验表明：该系列化合物具有较强的光敏损伤活性。 其中带有两个氰基的化合物e 2 表现出最好的d n a 光敏切割活性，与它高效的细胞抑制 性能相一致。 以c l i c kc h e m i s t r y 方法，设计、合成了两个新型含1 ，2 ，3 三唑基萘酰亚胺类荧光团。 光谱测定和细胞标记试验表明该类化合物可以应用于活细胞的生物影像，具有开发为荧 光探针的应用前景，为今后在其基础上修饰进行荧光标记做了有益的探索。 关键词：萘酰亚胺；1 ，2 ，3 一三唑；嵌入；d n a 光敏切割；抗肿瘤活性 含三氮唑杂环化合物的合成及生物活性研究 s y n t h e s i sa n db i o l o g i c a la c t i v i t i e so f n o v e lh e t e r o c y c l i cc o m p o u n d s c o n t a i n i n g1 , 2 ，3 一t r i a z o l e a b s t r a c t b a s e do nt h em e c h a n i s mo fa n t i t u m o ra g e n t st h a tt a r g e td n a ，t h r e es e r i e so fc o m p o u n d s w e r ed e s i g n e d ，s y n t h e s i z e da n dc h a r a c t e r e db ym o d i l y i n gt h es t r u c t u r e so ft h en a p h t h a l i m i d e s k e l e t o na n da c e n a p h t h e n e q u i n o n ed e r i v a t i v e s ，w h i c hc o n s i s to ff l a ta n dr i g i ds t r u c t u r e s as e r i e so f1 ，2 , 3 一t r i a z o l 一1 ，8 - n a p h t h a l i m i d ed e r i v a t i v e sw e r ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d v i a “c l i c kc h e m i s t r y ”t h e i rs p e c t r ap r o p e r t i e s ，d n ai n t e r c a l a t i v e ，d n ap h o t o d a m a g i n g a n da n t i t u m o ra c t i v i t i e sw e r ee v a l u a t e d t h es c a t c h a r db i n d i n gc o n s t a n t sb e t w e e nc td n a w i t hn 1 - n 6w e r em o n i t o r e db yf u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p yt e c h n i q u e t h er e s u l ts h o w e dt h a t t h e yc o u l de f f e c t i v e l yi n t e r c a l a t ei n t ot h ec td n aa n dt h es c a t c h a r db i n d i n gc o n s t a n t s r e a c h e d1 0 4 1 0 5m - i , s ot h e yc o u l db eu s e da se f f e c t i v ed n a t a r g e tm o l e c u l e s t h ea n t i t u m o r a c t i v i t i e st e s to ft h e s ec o m p o u n d se x h i b i t e de f f i c i e n ta c t i v i t i e sa g a i n s t7 7 21a n db g c - 8 2 3c e l l l i n e s e s p e c i a l l yc o m p o u n dn 2 、析t ht h i o m o r p h o l i n y ls u b s t i t u e n t ，t h ei c s 0v a l u ea g a i n s t7 7 2 1 c e l lw a s0 4 7 8 x 1 0 一m as e r i e so fn o v e l1 , 2 ，3 一t r i a z o l - a c e n a p h t h o f u s e dh e t e r o c y c l i cc o m p o u n d sw e r ed e s i g n e d a n ds y n t h e s i z e dv i a c l i c kc h e m i s t r y ”t h e i rs p e c t r ap r o p e r t i e s ，d n ai n t e r c a l a t i v e ，d n a p h o t o d a m a g i n ga n da n t i t u m o ra c t i v i t i e sw e r ee v a l u a t e d d n a b i n d i n ga b i l i t i e so ft h ee 1 - e 6 w e r ei n v e s t i g a t e db yu v - v i s ，c ds p e c t r o s c o p i ct e c h n i q u e sa n dv i s c o s i t ym e a s u r e m e n t ，t h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ec o m p o u n d sb i n d e dt od n a p a r t l yv i ai n t e r c a l a t i o n ，a c c o m p a n i e db y k i n do fa g g r e g a t i o n d n ap h o t o - d a m a g i n ga s s a y e ss h o w e dt h a tt h e s ec o m p o u n d sc o u l d e f f e c t i v e l yc l e a v es u p e r c o i l e dd n a ，e s p e c i a l l yc o m p o u n de 2w i t ht w oc y a n o g e ng r o u p s ， w h i c hw a si na c c o r d a n c ew i t hi t se x c e l l e n ta n t i t u m o ra c t i v i t y t w on o v e l1 , 2 ，3 一t r i a z o l 一1 ，8 一n a p h t h a l i m i d ef l u o r o p h o r e sw e r ed e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d v i a “c l i c kc h e m i s t r y ”c e l lu p t a k ee x p e r i m e n t sw i t hf l u o r e s c e n c ei m a g e si n d i c a t e dt h a tv1 a n dv 2c o u l db eu s e df o rb i o i m a g i n gi nl i v i n gc e l l s ，w h i c hi m p l i e dt h ep o t e n t i a l so ft h e f l u o r e s c e n c ed y e sv1a n dv 2u s e da sf l u o r e s c e n c ea g e n t s k e yw o r d s ：n a p h t h a l i m i d e ；1 , 2 ，3 一t r i a z o l e ；i n t e r c a l a t i o n ；p h o t o d a m a g e ；a n t i t u m o r a c t i v i t y i i 大连理工大学学位论文独创性声明 作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究 工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外， 本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请 学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献 均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 学位论文题目： 作者签名： 火连理工大学硕士研究生学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关学位论文知识产权的规定，在校攻读学位期间 论文工作的知识产权属于大连理工大学，允许论文被查阅和借阅。学校有 权保留论文并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，可以将 本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印、或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 学位论文题目： 作者签名： 导师签名： 大连理工大学硕士学位论文 1绪论 1 1引言 人类发现恶性肿瘤已有3 0 0 0 年以上历史。恶性肿瘤是一种细胞的不受控制的无序 的异常增生现象。恶性肿瘤细胞与正常细胞相比，有结构、功能和代谢的异常，它们具 有超过正常的增生能力，这种增生和机体不相协调。恶性肿瘤细胞的特性包括细胞的无 休止和无序的分裂，并有侵袭性( 向周围组织浸润) 和转移性。 在各种疾病中，癌症是致人死亡的主要疾病之一。据世界卫生组织报告，每年世界 上有超过1 0 0 0 万起新的癌症病例发生。在2 0 0 0 年，有5 3 0 万例男性和4 7 0 万例女性发 生恶性肿瘤，总计有6 2 0 万例死于此病，全球因恶性肿瘤死亡的人数占了总死亡人数的 1 2 。尽管有先进的医疗技术，由于平均寿命的延长，生活方式的改变以及抽烟等原因， 如果没有进一步抑制癌症的措施，预计到2 0 2 0 年全球癌症发病率将上升5 0 ，发病人 数将达到1 5 0 0 万。报告中还指出，在发展中国家同发达国家一样，癌症己成了一个主 要卫生问题。肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、肝癌和子宫颈癌这几种实体瘤是发病 率最高的几种癌症。 目前治疗恶性肿瘤的主要方法包括：手术治疗、抗癌药物的化学治疗、放射治疗和 生物反应调节剂及其它治疗。但是对于占肿瘤9 0 的实体瘤而言，放化疗总是很难起到 根治肿瘤的作用，复发率非常高。因此，研究新一代的低毒高选择性、耐药性低的药物 以及改进治疗方法成为恶性肿瘤治疗的当务之急。 1 2 以d n a 为靶点的抗肿瘤药物 1 2 1 研究以d n a 为靶点药物的意义 与药物作用的3 种重要的生物大分子靶( 酶、受体、及核酸) 中，以酶和受体为靶 的药物研究开始较早。相比之下，以核酸为靶的药物研究则起步较晚，主要是由于核酸 三维空间结构的复杂性及其与药物作用机制的多样性所决定的。1 9 5 3 年，w a t s o n 和 c r i c k 建立的d n a 双螺旋的模型【i 】从结构上为d n a 作为遗传物质提供了强有力的证 明，自此生物学进入了分子生物学时代。2 0 世纪6 0 年代，意大利、法国、日本、美国 等一些实验室开展了d n a 葸环抗生素道诺霉素复合物研究，发现葸环化合物通过带正 电荷的残基与d n a 之间的静电作用及葸环平面与d n a 的嵌入而形成复合物。分子生 物学和分子药理学的发展使人们能够从基因水平上理解某些疾病的发病机制，通过分子 设计寻找有效的治疗药物。d n a 靶向化合物成为很重要的药物选择对象，临床上使用 含三氮唑杂环化合物的合成及生物活性研究 的许多抗癌药物都以d n a 为作用靶点，通过与癌细胞d n a 发生相互作用破坏其结构， 进而影响基因调控与表达的能力，表现抗癌活性【2 】。 1 2 2 d n a 靶向药物分子与d n a 相互作用的方式 d n a 靶向分子与核酸作用的部位是核酸的碱基、磷酸骨架和戊糖环，其相互作用 方式归纳起来有三种：非共价结合，共价结合和剪切作用。大多数d n a 靶向药物都是 通过非共价结合方式与d n a 进行作用的，主要存在三种方式：外部静电结合 ( e l e c t r o s t a t i cb i n d i n g ) 、沟区结合( g r o o v eb i n d i n g ) 和嵌插结合( i n t e r c a l a t i v eb i n d i n g ) ， 如图1 1 所示【3 l 。 g o o v e 洲i - l l i n t e l c a l a t l n g b i m l i n 9 图1 1小分子与d n a 非共价作用的三种方式 f i g 1 1 t h r e en o n c o v a l e n ta c t i o nm o d e sb e t w e e ns m a l lm o l e c u l e sa n dd n a ( 1 ) 外部静电结合，即分子通过非特异性的静电相互作用结合于带负电荷的d n a 双螺旋外部。由于沿着螺旋外部的静电相互作用都是非特异性的，没有选择性，通常认 为这种结合模式在作为药物的应用上价值不大。但也并非完全如此，有些分子与d n a 的静电作用对它能嵌入结合在g c 碱基对之间也起了必不可少的稳定作用，例如t m p y p 金属卟啉。 ( 2 ) 沟渠结合，即d n a 靶向分子与d n a 的大沟或小沟的碱基对边缘直接发生相 互作用。大沟区、小沟区在电势能、氢键特征、立体效应、水合作用上都有很大差别。 很多大分子蛋白质与d n a 特异性的结合是通过d n a 大沟区作用。而分子量小的靶向 分子则是在小沟区作用。典型的小沟区结合的靶向分子多含有几种简单的芳香杂环结构 如呋喃、吡咯或苯环，这些芳环由扭转自由的键来连接，由此产生合适的扭转力来配合 小沟区内的螺旋曲线，取代沟区中的水分子并与d n a 双螺旋链中沟区的碱基对边缘通 过范德华引力形成接触，从而导致靶向分子在小沟区结合的特异性。小沟区结合的靶向 一2 一 大连理工大学硕士学位论文 分子选择性的作用于d n a 双螺旋结构中a t 富集区，通过氢键、范德华力等作用，非 嵌入性的捆缚住d n a ，从而阻止d n a 的模板复制，起到抗病毒、抗肿瘤的作用。 ( 3 ) 嵌入结合。常是指在碱基对之间嵌入平面的或几乎平面的芳香稠环体系，对 于一次理想的嵌入过程，小分子的平面部分必须至少具有2 8 a 2 的表面积，即最佳是3 - 4 个环，然而现在已经观察到有些具有抗肿瘤活性的非经典平面芳香环体系的化合物也是 以嵌插方式与d n a 结合发挥药效的【4 】。嵌插结合是药物分子与d n a 发生作用的最重要 的形式之一【5 6 】，其作用力来自芳环的离域7 c 体系与碱基的兀体系间的兀7 c 相互作用、偶极 偶极相互作用及疏水相互作用。在经典的嵌插模型中，由于嵌插部位的形成引起碱基 对分开，螺旋伸长0 3 4n m ，这正是典型的芳环体系的厚度。实际上这是一个最大值， 一般观察到的螺旋伸长均小于0 3 4n m 。 药物分子嵌插到d n a 碱基对中，改变了d n a 的拓扑结构，导致d n a 的功能在生 化水平上发生了封锁，例如r n a 聚合酶或拓扑异构酶的活性受到抑制。许多d n a 嵌入 剂同时也是拓扑异构酶抑制剂，如喜树碱类化合物、阿霉素( d o x o n i b i c i n ) 、米托葸醌 ( m i t o x a n t r o n e ) 等。现在普遍认为嵌入剂的抗肿瘤活性与这类化合物稳定d n a 嵌入剂 拓扑异构酶三元复合物的能力紧密相判7 引。拓扑异构酶( t o p o i s o m e r a s e ，t o p o ) 是生 物体内广泛存在的一类必需酶。根据对d n a 裂解机理不同分为拓扑异构酶i ( t o pi ) 、 拓扑异构酶i i ( t o pi i ) 两大类，它们除了在细胞周期中维持d n a 的拓扑结构外，还与基 因调节、细胞有丝分裂等有关联。t o pi 在人成纤维细胞中的含量与细胞生长状态无关， 即使在静止期也能维持较高水平，而在肿瘤细胞中的含量比正常组织高。在正常细胞中， t o pi i 的含量是呈细胞周期依赖性的，由t o pi i 基因控制。t o pi i 的活性在g o 期最低， 在细胞分裂期较高，在s 期达到最高。t o pi i 的活性也与细胞的增殖速度成比例，在快 速生长的细胞中高，在慢速生长的细胞中低。t o p i i 在肿瘤细胞中的半衰期比在正常细 胞中的半衰期长4 倍。因此以t o p 为作用靶点的抗肿瘤药物具有一定的选择性 9 a 0 】。 有些药物如葸醌类化合物、苯并三唑类衍生物、某些重氮化合物等嵌入d n a 后， 经过进一步活化，如光照产生羟基自由基、单线态氧、超氧化自由基、超氧化阴离子自 由基等活性物质，使d n a 断裂、受损，从而影响d n a 功能，发挥他们抗肿瘤、人工 光核酸酶的作用i l 。 影响药物分子与d n a 相互作用的因素很多，药物分子的结构不同，整个分子与d n a 的结合方式也不同，而且上述几种作用方式有时是同时发生的i l 2 。 含三氮唑杂环化合物的合成及生物活性研究 1 2 3 萘酰亚胺类化合物作为抗癌药物的研究进展 萘酰亚胺类化合物作为癌药物进行研发已经有3 0 年的历史，迄今取得了巨大的进 展，是近几年的研究热点。以下我们将重点介绍l ，8 萘酰亚胺类化合物在抗肿瘤方面的 研究进展。 1 9 7 3 年，b r 锄a 【1 3 】等对几种具有抗肿瘤作用的化合物进行结构组合改造，得到了第 一批萘酰亚胺类化合物1 - 4 ( 图1 2 ) ，对这些化合物进行了体内的和体外的抗肿瘤活性 测试，显示出良好的抗肿瘤活性，这些化合物能够强烈抑制人宫颈癌h e l a 细胞和k b 细胞的生长，并能抑制d n a 和r n a 的合成。 r i 1 _ 4 r 1 = c h 2 c h 2 n ( c h 3 ) 2 r 2 = c h 2 c h 2 n ( c 2 h 5 ) 2 入 r 3 = c h 2 c h 2n 、 、- 、一 n 0 2r 4 = c h 2 c h 2 图1 25 硝基1 ，8 萘酰胺类衍生物及其前体化合物 f i g 1 2 s t r u c t u r e so f5 - n i t r o - 1 8 - n a p h t h a l i m i d ea n di t sp a r e n tc o m p o u n d s 随后，大量的萘酰亚胺类化合物被合成并进行体外抗肿瘤活性研究。这些工作主要 围绕三个方面展开：( 1 ) 在萘酰亚胺母体环上引入不同的取代基和对酰亚胺侧链取代 基进行基团变换；( 2 ) 对萘酰亚胺母体环进行结构修饰，主要是在萘环上并上不同的 杂环以提高该类化合物对d n a 的结合能力，从而增强其抗肿瘤活性；( 3 ) 合成含有萘 酰亚胺药效团的d n a 双嵌入剂。 ( 1 ) 在萘酰亚胺母体不同位置引入取代基 通过在5 位引入硝基、氨基、酰氨基、羟基、甲氧基、叔丁基、氯等基团，在酰亚 胺侧链上引入含氮原子或不含氮原子的取代基，b r a n a 研究组合成了大量单萘酰亚胺类 化合物【1 4 1 。q s a r ( 定量构效关系) 研究表明，这些化合物的侧链中含有氮原子对其细 胞毒性至关重要；同时，侧链上的氮原子与酰亚胺环中的氮原子间隔两个原子时，化合 物的活性最高。其中，两个最著名的化合物是a m o n a f i d e 和m i t o n a f i d e ( 图1 3 ) 1 5 , 1 6 j 。 已进入到i i 期临床。 一4 一 大连理工大学硕士学位论文 n ， n 磁磁m a m o n a f i d e 目前处于临床i i 期阶段，有报道称其对晚期乳腺癌有很好的疗效，但是 在体内容易被n a t 2 酶乙酰化形成n a c e t y l a r n o n a f i d e ( 图1 4 ) ，这种乙酰化产物在体 内代谢随个体差异会产生高度可变的、不确定的毒副作用，引起骨髓抑制 ( m y e l o s u p p r e s s i o n ) 、呕吐、皮疹以及中等程度的静脉炎等副作用，这严重地制约了它 的应用，使其没有能够进入i i i 期临床研究。 n h 2 n a t 2 酶 n h c o c h 3 a m o n a f i d e n a c e t y l - - a m o n a f i d e 图1 4a m o n a f i d e 被n 乙酰基转移酶代谢的途径 f i g 1 4t h er o u t eo fm e t a b o l i s mo fa m o n a f i d eb yn a t 2e n z y m ec a t a l y s i s m i t o n a f i d e 的临床研究进程不如a m o n a f i d e 顺利。临床试验结果显示其对实体瘤有 效，但是会造成较大的中枢神经毒性等不良反应。因此，该化合物的临床研究已终止。 尽管临床研究不尽如人意，a m o n a f i d e 和r n i t o n a f i d e 仍然是单萘酰亚胺化合物中研 究的最充分的，也是同类型的单取代的萘酰亚胺类化合物中活性最强的。在a m o n a f i d e 和m i t o n a f i d e 的结构基础上，b r a n a 研究组和z e ec h e n g 研究组相继报道了在萘酰亚胺 的5 位和8 位引入硝基和氨基，得到了一系列的化合物5 ，6 ( 图1 5 ) 【l7 。5 氨基8 硝 基萘酰亚胺衍生物对结肠癌c x 1 和肺癌l x 1 的活体实验表明这类化合物有着比单取 含三氮唑杂环化合物的合成及生物活性研究 代的a m o n a f i d e 和m i t o n a f i d e 更强的细胞毒性。而5 ，8 二硝基或二氨基衍生物则有着较 强的体内以及体外抑制白血病和黑素瘤活性的能力。 0 2 n r 2 r p r 。 5 a ：r i = h ；r 2 = h ；r 3 = n ( c h 3 ) 2 b ：r i = h ；r 2 = h ；r 3 = n ( c 2 h 3 ) 2 c ：r 1 - h ：r 2 = h ；r 3 = n ( c h 2 ) 4 d ：r i = h ；r 2 = h ；r 3 = n ( c h 2 ) 5 e ：r i = h ；r 2 = h ； r 3 = c h 2 n ( c h 2 c h 2 0 h ) 2 f - r i = c h 3 ；r 2 = h ；r 3 = n ( c h 3 ) 2 n h ，g ：r 1 2 h ：r 2 2 c h 3 ；r 3 2 n ( c h 3 ) 2 x 6 图1 55 位、8 位双取代的萘酰亚胺类衍生物 y f i g 1 5 s t r u c t u r e so f5 ，8 - d i n i t r o - 1 ，8 - n a p h t h a l i m i d ed e r i v a t i v e s a ：x = y = n 0 2 b ：x = y = n h 2 ( 2 ) 对萘酰亚胺母体环进行修饰 1 9 9 3 年，s a m i 等【l8 】在发色基团上进行改造，加入了葸环，取代了结构相对简单的 萘环，改造出一批单取代联苄基异喹啉化合物。在人黑色素瘤u a c 3 7 5 、卵巢肿瘤 o v c a r 3 以及小鼠白血病细胞中检测了这些新化合物的活性。这些化合物中，有一个命 名为a z o n a f i d e 的化合物显示出比a m o n a f i d e 强很多的细胞毒性，其结构式见图1 6 。在 a z o n a f i d e 的结构基础上，s a m i 等继续开发了一系列衍生物，此类化合物在人黑色素瘤 u a c 3 7 5 、卵巢肿瘤o v c a r 3 以及小鼠白血病细胞等肿瘤细胞中有相当强的抑制作用， 并且在多药耐药细胞株中也表现出相近的细胞毒性。和a m o n a f i d e 相比，a z o n a f i d e 在 b 6 c f 3 1 小鼠1 6 c 乳腺癌模型中表现出更优越的抗肿瘤活性。但是d o n 等l l9 j 报道 a z o n a f i d e 对结肠癌c o l o n 3 8 和卵巢癌m 5 0 7 6 无效。在同系列的衍生物中，化合物 a m p 5 3 ( 6 乙氧基取代a z o n a f i d e ) 表现出更为广泛的活性，它对l e w i s 肺癌模型、h l 6 0 白血病模型，m c f 7 乳腺癌模型以及a 5 4 9 非小细胞肺癌表现出活性，相对肿瘤增值率 ( t c ) 分别为3 0 ，3 9 ，3 9 和3 7 。因此临床研究显示，在a z o n a f i d e 系列化合物 中，a m p 5 3 最有希望被继续开发，并可以用于对化疗药物多药耐药的患者。 一6 一 一 、一 大连理工大学硕士学位论文 r r o c h 2 c h 3 a z o n a f i d e a m p 5 3 图i 6a z o n a f i d e 及其衍生物 f i g 1 6 s t r u c t u r e so f a z o n a f i d ea n da m p - 5 3 7 y y y 1 - h 8 y 2 2 c f 3 x = o x ：s n f n h 2 9 n f n h 2 图1 7b r a n a 研究组报道的新型杂环并荼酰亚胺类衍生物 f i g 1 7 n o v e lh e t e r o c y c l i cn a p h t h a l i m i d e sr e p o r t e db yb r a n a g r o u p 2 0 0 2 年2 0 0 3 年，b r a n a 研究组相继报道了一系列咪唑并萘酰亚胺7 t 2 0 j 和吡嗪并萘 酰亚胺类化合物8 i2 1 】( 图1 7 ) 。这两类化合物中，化合物7 1 对人结肠癌细胞( h t 2 9 ) 和人子宫癌( h e l a ) 的抑制活性比a m o n a f i d e 有了稍微地提高，对前列腺癌( p c 3 ) 的 抑制活性没有a m o n a f i d e 有效。化合物7 2 对h t 2 9 和p c 3 的抑制活性则高于a m o n a f i d e 。 化合物8 1 对人结肠癌细胞( h t 2 9 ) 、人子宫癌( h e l a ) 和前列腺癌( p c 3 ) 的抑制 活性比a r n o n a f i d e 都有了稍微地提高：而含有三氟甲基的化合物8 2 对仅对h t 2 9 和p c 3 一 -n_、 、一 一 、一 一 、一 b 一 一 、一 含三氮唑杂环化合物的合成及生物活性研究 的抑制活性略高于a m o n a f i d e 。对人子宫癌( h e l a ) 的抑制活性没有a m o n a f i d e 有效。合 成这两个化合物的关键中间体衍生而来的化合物9 也表现出了比a m o n a f i d e 更高的的活 性。2 0 0 4 年，b r a n a 研究小组再次报道了两类新型的呋喃、噻吩并萘酰亚胺1 0 1 1 【2 2 1 。 化合物1 0 1 ，1 0 2 ，1 1 2 对人结肠癌细胞( h t 2 9 ) 、人子宫癌( h e l a ) 和前列腺癌( p c 3 ) 的抑制活性都比a m o n a f i d e 都有了较大地提高。化合物1 1 1 也仅仅是对人子宫癌( h e l a ) 的活性稍低于a m o n a f i d e 。其中活性最好的是化合物1 1 2 ，对三种癌细胞的活性比 a m o n a f i d e 提高了1 0 倍以上( i c 5 0 由1 0 击m 数量级降低到1 0 7 m 数量级) 。 r r r i 1 31 41 5 r - 1 ) h ，2 ) p - m e ，3 ) p - m e 4 ) o - c i ，5 ) o - o h ，6 ) m - n 0 2 1 6 沪r 2 n r = 1 ) c h 2 c h 2 n m e 2 ， 2 ) c h 2 c h 2 c h 2 n m e 2 3 ) c h 2 c h 2 c h 2 c h 3 厂、 4 ) c h 2 c h r 弋h 1 ) r i = n ( c h 3 ) 2 r 2 = n h 2 2 ) r 1 = c h 2 n ( c h 3 ) 2 r 2 = nh 2 3 ) r i = n ( c h 3 ) 2 。r 2 = h 4 ) r i = n ( c h 3 ) 2 ，r 2 = o h 5 ) r i = n ( c h 3 ) 2 r 2 = c i 6 ) r i = n ( c h 3 ) 2 r 2 = n h ( c h 2 ) 2 n ( c h 3 ) 2 图1 8 钱旭红、李志刚等报导的萘酰亚胺类衍生物 f i g u r e1 8 n o v e ln a p h t h a l i m i d e sr e p o r t e db yq i a n sg r o u p 华东理工大学钱旭红、李永刚等在萘酰亚胺类d n a 嵌入剂作为抗癌药物试剂的研 究方面取得了富有成效的进展( 图1 8 ) f 2 3 1 。体外实验表明，化合物1 2 1 5 大多选择性 的对m o l t - - 4 人白血病细胞、a 5 4 9 人肺癌细胞有强抑制作用。化合物1 6 大多选择性的 对h l 6 0 人白血病细胞、a 5 4 9 人肺癌细胞、p 3 8 8 小鼠白血病细胞有强抑制作用，其i c 5 0 8 一 大连理工大学硕士学位论文 值均达到了1 0 m 或1 0 母m 数量级。特别是2 3 1 对a 5 4 9 人肺癌细胞和p 3 8 8 小鼠白血 病细胞的i c 5 0 值分别为0 8n m ，5 0n m ，对a 5 4 9 的活性是a z o n a f i d e 的活性的1 2 5 倍。 目前，已经对这些化合物进行活体实验 ( 3 ) 双嵌入剂。 另一种增强萘酰亚胺类化合物活性的方法是将两种单萘酰亚胺母体结构通过含但 原子的长“手臂 连接起来，得到对称( 或不对称) 的双萘酰亚胺。通过影响化合物的 嵌入方式和嵌入效率，进而影响化合物的抗肿瘤活性及其选择性。 时至今日，虽然许多抗癌药物先导已被发现。然而，化合物抗癌活性的选择性与高效 性、因芳香杂环而导致的应用时溶解性及毒性问题是该方向发展需要突破的瓶颈。 1 3 人工光核酸酶( d n a 光敏切断剂) 的研究进展 1 3 1 人工核酸酶的应用 核酸酶是用于d n a 和r n a 切割的重要分子生物学工具，同时也是去除生物制品中 d n a 和r n a 杂质的生物技术工具：如用于降解体系中的核酸，以避免其引起的粘度增 加而影响下一步分离纯化：对重组蛋白质酶制品，宿主菌中的核酸杂质必须去除，以避 免可能的转基因风险；对来源于转基因抗病作物的生物制品，其转基因成分的去除也是 十分重要的应用领域。 天然的核酸酶在许多领域都有重要用途，但是其巨大的分子量和有限的序列识别能 力阻止了其进一步的使用。例如，在d n a 重组实验中，限制性内切酶仅仅只能识别4 8 个具有回文结构的碱基序列。因此，在较长的核酸链中，这样短的识别序列出现的频率 会很高。所以当一条较长的核酸链被限制性内切酶切断时，将产生很多的碎片，这些碎 片很难进一步被利用。而且对于更多序列或者非回文结构的碱基序列，它就无能为力了。 正是天然核酸酶在应用方面的诸多限制，才为人工核酸切割剂的设计与合成提供了契机 【3 2 1 。近2 0 年来，人工核酸切割试剂的研究一直是生物化学和分子生物学中最为活跃的 前沿领域之一，所谓核酸切割，就是通过化学反应将长链的核酸分子断裂成较短的碎片。 因其作用方式与核酸酶相近，又被称为人工核酸酶。 与天然核酸酶相比，化学合成的小分子人工核酸酶不存在蛋白质变性失活带来的应 用局限，且造价低廉，因而有着巨大的优势。除作为生物学工具，人工核酸酶的应用领 域还拓展到了生物医药领域，如基因治疗药物等。因此，研究人工核酸酶具有非常重要 的理论和应用价值。 人工核酸酶按照其及激发条件和作用方式可以分为两种： ( 1 ) 非光敏类型：可在生理或略高于生理温度下以水解等机理损伤核酸。 含三氮唑杂环化合物的合成及生物活性研究 ( 2 ) 光敏类型：光激发下，分子进入电子激发态并催生活性碎片( 如自由基、单线态 氧或超氧负离子等) 引起一系列的化学反应对生物大分子进行结构分解( 剪切、损伤) 。 它们在生物化学中具有广泛的用途，如：可以作为核酸结构探针，研究核酸的结构：还 可以作为足迹试剂研究d n a 与蛋白质的相互作用：还可以作为光动力疗法治疗癌症的 药物等。 1 3 2 人工光核酸酶的种类 化学切断剂大多是以d n a 的脱氧核糖部分为作用靶标，主要分为两大类：金属配 合物d n a 光敏切断剂和有机化合物d n a 光敏切断剂，本文重点介绍有机小分子作为 人工光核酸酶的应用。 ( 1 ) 蒽醌类化合物 s c h u s t e r 研究组报导了大量的作为人工光核酸酶的葸醌类衍生物【2 4 1 。这一系列中 最重要的例子见于图1 9 。根据化合物的结构和实验条件的不同，有三种可能的机理与 这类化合物的光敏切割有关。 oo o 1 7 o o 1 9 + n n h 3 h ， hi n 丫攀h v o + h 3 n 1 8 o o 2 0 s 0 3 + n h 3 图1 9 典型的葸醌类d n a 光敏切断剂 f i g 1 9a n t h r a q u i n o n ed e r i v a t i v e sa sd n ap h o t o c l e a v e r s 4 - n h 3 大连理工大学硕士学位论文 最常见的一种机理是电子转移【2 5 】。具有平面结构的蒽醌1 9 ，无序列选择性的嵌入 d n a 中，光照后在g c 序列的5 g 处产生切割【2 6 】。 第二种机理是当葸醌大大过量时从脱氧核糖夺氢的机理【2 7 1 。但是，这种机理与葸醌 的结构是密切相关的。化合物1 7 、1 8 对d n a 的切割源自这种机理，化合物1 9 却只能 发生电子转移【2 7 】。这种差异可以通过化合物的激发态来加以解释。事实上，1 7 的激发 态来自于帆 跃迁，能从脱氧核糖上夺氢。化合物1 9 由于葸醌侧链酸胺的结构的不同， 其激发态是7 r 尢士跃迁，只能发生电子转移而不能夺取氢原子【2 6 1 。 阴离子葸醌衍生物2 0 则属于第三种机理。在这种情况下，化合物不用嵌入d n a 中。 该化合物对d n a 的切割与溶液中氯离子的浓度有非常大的关系。实际起切割作用的是 不带电荷的氯原子，它产生于从氯离子到葸醌的光诱导电子转移【2 引。 对于化合物2 l 、2 2 ，它们与d n a 的作用方式完全不同于上述化合物【2 9 1 。因为侧链 取代基位于芳环平面外的缘故，这两个化合物只能在小沟与d n a 结合而不能嵌入d n a 。 特别是化合物2 2 对a a t t 有非常强的序列选择性。机理实验表明，化合物2 l 、2 2 是通 过夺氢和电子转移两种机理对d n a 进行切割【3 0 】。 ( 2 ) 萘酰亚胺类化合物 以萘酰亚胺为母体经修饰得到的光切断剂对d n a 损伤因结构的不同，其机理也不 尽相同【3 l - 35 1 。 ar i = r 2 = h ，r = c h 2 c h 2 c h 2 s c h 3 r br i = r 2 = h r = c h 2 c ( s c h 3 ) ( o c h 3 ) r 1 cr i = r 2 = h ，r = ( c h 2 ) 4 c h 2 ( n h 2 ) c o o c h 3 dr i = h r 2 = n 0 2 r = ( c h 2 ) 4 c h 2 ( n h 2 ) c o o c h 3 er i = n 0 2 ，r 2 = h r = ( c h 2 ) 4 c h 2 ( n h 2 ) c o o c h 3 r 2 fr i = r 2 = h ，r = c h 2 c h ( o c h 3 ) o o h gr i = r 2 = b r r = c h 2 c h ( o c h 3 ) o o h hr 1 = n 0 2 r 2 = h ，r = ( c h 2 ) 6 n h z 图1 1 0 萘酰亚胺类d n a 光敏切割剂 f i g ，1 10 s t r u c t u r e so f n a p h t h a l i m i d e su s e da sd n ap h o t o c l e a v e r s 图1 1 0 中，化合物2 3 a 通过光照产生单线态氧机理切断d n a ，2 3 b 的机理则是通 过光引发下分子间电子转移引起的d n a 烷基化。水溶性的赖氨酸衍生物2 3 c 和2 3 e 能将碱基上的单电子转移到受体，从而有效产生d n a 切断。把硝基引入萘酰亚胺环上 含三氮唑杂环化合物的合成及生物活性研究 ( 2 3 d ) ，产生了具有d n a 切断功能的硝基自由基阴离子，d n a 切断的选择性完全改 变了，从5 端鸟嘌呤鸟嘌呤( - g g ) 序列切断转向胸腺嘧啶( t ) 序列的切断。萘酰亚 胺的过氧化物2 3 f 和2 3 9 ，在长波照射下( 3 6 5 n m ) 能有效引发羟基自由基，引起d n a 损伤。t w r e d m o n d 对这些生物活性的光化学机理作了深入研究【3 6 】。j y o t im e h o t r a 研 究组还报道了4 硝基- n 正己胺1 ，8 萘酰亚胺2 3 h 3 7 】，它能通过插嵌结合与d n a 作用， 并对a t 碱基对的嵌入比对g c 要强。在光引发条件下，嵌入剂会对双螺旋d n a 产生 单链切断。 k e l l y 研究组【3 8 】对萘酰亚胺类d n a 光敏切割剂作了细致而又富有成效的工作如( 图 1 1 1 ) 。化合物2 4 和2 5 的选择性对d n a 以g c 嵌入为主，对d n a 的光敏切割以激发 三线态为主，单线态为辅。由自粹灭过程引起的自由基产生效率的很高，分别为o 1 l ， o 0 1 和0 2 5 。然而，激发态的迅速淬灭阻止了单线态氧的产生。 而化合物2 6 是将萘酰亚胺环与经典的共敏化试剂甲基紫相连接而得到一类新的化 合物，这类化合物能有效地结合d n a ，同时自由基产生的量子效率增长1 ，表明其电 荷分离效率被显著的增强。 + 厂 ( c h 2 ) x 近冲函+ 一n 热+ 一 x = 2 6 2 6 厂 s r r = m e b u o m e 图1 1 lk e l l y 研究组报道的d n a 光敏切割剂 f i g 1 1 l d n a p h o t o c l e a v e r sb yk e l l y g r o u p 钱旭红研究组也对萘酰亚胺类d n a 光敏切割剂进行了富有成效的研究【3 9 枷】。他们 的工作主要集中在对萘酰亚胺环的修饰上。即通过在萘酰亚胺环上并入各种杂环，增强 分子